הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל תרבות משותפת ללא מגע לחקר הפעלת תאי מערכת החיסון המולדת במהלך זיהום בנגיף הנשימה

2.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62115

⸱

28 בפברואר 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Department of Microbiology and Immunology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 3Haartman Institute, Medicum, University of Helsinki, 4Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, National University Hospital, National University Health System, 5Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), Singapore Immunology Network (SIgN), 6NUHS Infectious Diseases Translational Research Program, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מפרט חקירה של האינטראקציות המוקדמות בין תאי אפיתל האף נגועים ויראלית והפעלת תאים מולדים. ניתן להבחין בין תת-קבוצות בודדות של תאי מערכת החיסון בהתבסס על הפעלתם בתגובה לזיהומים ויראליים. לאחר מכן הם יכולים להיחקר עוד יותר כדי לקבוע את השפעתם על תגובות אנטי ויראליות מוקדמות.

תקציר

האינטראקציות המוקדמות בין שכבת האפיתל באף לבין תאי החיסון המולדים במהלך זיהומים ויראליים נותרות אזור שלא נחקר. המשמעות של איתות חסינות מולדת בזיהומים ויראליים גדלה באופן משמעותי כמו חולים עם זיהומים בדרכי הנשימה המציגים הפעלה גבוהה של תאי T מולד להראות תוצאה טובה יותר של המחלה. לפיכך, ניתוח אינטראקציות חיסוניות מולדות מוקדמות אלה מאפשר הבהרה של התהליכים השולטים בהם ועשוי להקל על פיתוח מטרות טיפוליות פוטנציאליות ואסטרטגיות לשיכוך או אפילו למניעת התקדמות מוקדמת של זיהומים ויראליים. פרוטוקול זה מפרט מודל רב-תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לחקור שיחות צולבות מוקדמות, אינטראקציות והפעלה של תאי חיסון מולדים מגורמים המופרשים על ידי תאי אפיתל נגועים בדרכי הנשימה. באמצעות נגיף שפעת H3N2 (A/Aichi/2/1968) כמודל הנגיף המייצג, הפעלה מולדת של תאים מונו-גרעיניים של דם היקפי בתרבית משותפת (PBMCs) נותחה באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לחקור את תת-קבוצות התאים המופעלים על ידי הגורמים המסיסים המשתחררים מהאפיתל בתגובה לזיהום הנגיפי. התוצאות ממחישות את אסטרטגיית ההצטיידות להבחנה בין תת-קבוצות התאים וחושפות את ההבדלים הברורים בין האוכלוסיות הפעילות של PBMCs לבין השיחה הצולבת שלהם עם האפיתל הנגוע והבקרה. לאחר מכן ניתן לנתח עוד יותר את קבוצות המשנה המופעלות כדי לקבוע את תפקודן, כמו גם שינויים מולקולריים ספציפיים לתאים. ממצאים מחקירה צולבת כזו עשויים לחשוף גורמים החשובים להפעלת אוכלוסיות תאים מולדות חיוניות, המועילות לשליטה ודיכוי התקדמות הזיהום הנגיפי. יתר על כן, גורמים אלה יכולים להיות מיושמים באופן אוניברסלי על מחלות ויראליות שונות, במיוחד על וירוסים חדשים המתעוררים, כדי לדכא את ההשפעה של וירוסים כאלה כאשר הם מסתובבים לראשונה באוכלוסיות אנושיות תמימות.

מבוא

וירוסים נשימתיים הם אולי בין הפתוגנים הנפוצים ביותר הגורמים לנטל בריאותי וכלכלי חמור. מההתפרצויות הגלובליות התקופתיות של זני מגיפה מתפתחים (למשל, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ועד לזנים העונתיים של שפעת מדי שנה, וירוסים מהווים איום מתמיד על בריאות הציבור. למרות שחיסונים מהווים את עיקר התגובה לאתגרים גלובליים אלה של בריאות הציבור, זה מפוכח לציין כי אמצעי נגד אלה הם רק מגיבים 1,2. יתר על כן, עיכוב בין הופעתו של זן זיהומי חדש לבין הפיתוח המוצלח של החיסון שלו הוא בלתי נמנע3, מה שמוביל לתקופה שבה האמצעים הזמינים לריסון התפשטות הנגיף מוגבלים מאוד.

עיכובים אלה מודגשים עוד יותר על ידי העלויות הנגרמות על החברה-כלכלית והחברתית. השפעת העונתית לבדה אחראית לכ-8 מיליארד דולר בעלויות עקיפות, 3.2 מיליארד דולר בהוצאות רפואיות ו-36.3 אלף מקרי מוות בארצות הברית מדי שנה4. זאת לפני התחשבות בעלויות המחקר הדרושות למימון פיתוח חיסון. התפרצויות מגיפה יש השפעות חמורות עוד יותר על החברה, יחד עם הקצב הגובר של הגלובליזציה מדי שנה, כפי שמעידים השיבושים הגלובליים הנגרמים על ידי הופעתה והתפשטות מהירה של תסמונת נשימה חריפה חמורה coronovirus 2 (SARS-CoV-2)5,6,7.

מחקרים אחרונים הראו כי חולים נגועים שיש להם אוכלוסייה גדולה יותר של תאי T מולדים מופעלים נוטים להיות תוצאה טובה יותרשל המחלה 8,9,10. יתר על כן, אוכלוסיית תאי ה- T המולדת מסווגת לתת-קבוצות מרובות: תאי T (MAIT) הקשורים לריבית, תאי Vδ1 γδ T, תאי Vδ2 γδ T ותאי T הרוצח הטבעי (NKT). תת-קבוצות אלה של תאי T מולדים מציגות גם הטרוגניות בתוך האוכלוסיות שלהם, מה שמגביר את המורכבות של האינטראקציות בין אוכלוסיות התאים המעורבות בתגובה החיסונית המולדת11. לפיכך, המנגנון המפעיל תאי T מולדים אלה והידע של תת-קבוצות ספציפיות של תאי T מולדים עשוי לספק שדרה אחרת של מחקר כדי לצמצם את ההשפעות הזיהומיות של וירוסים אלה על הפונדקאי האנושי, במיוחד בתקופה של פיתוח החיסון.

תאי אפיתל נגועים בשפעת לייצר גורמים המפעילים תאי T מולדים במהירות 12,13,14. בהתבסס על ממצא זה, מודל תרבות משותף זה של ממשק אוויר-נוזלי (ALI) ללא מגע שואף לחקות את האינטראקציות הכימיות המוקדמות (בתיווך גורמים מסיסים שפורסמו על ידי שכבת האפיתל הנגועה) בין שכבת אפיתל האף הנגועה לבין ה- PBMCs במהלך ההדבקה המוקדמת. ההפרדה הפיזית בין שכבת האפיתל באף (בתרבית על תוספות ממברנה) לבין ה- PBMCs (בתא שמתחת) ושלמות האפיתל מונעים זיהום ישיר של ה- PBMCs על ידי הנגיף, ומאפשרים מחקר מפורט של ההשפעות של גורמי מסיסים שמקורם באפיתל על ה- PBMCs. לכן ניתן לחקור עוד יותר את הגורמים המזוהים על הפוטנציאל הטיפולי שלהם בגרימת אוכלוסיית תאי ה- T המולדת המתאימה שעשויה להגן מפני זיהום שפעת. מאמר זה פירט אפוא את השיטות של הקמת תרבות משותפת לחקר הפעלה מולדת של תאי T מגורמים מסיסים שמקורם באפיתל.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: עיין בטבלה 1 לקבלת מתכונים של מדיה המשמשת בפרוטוקול זה.
הערה: hNECS גדל על טרנסוול 12-well נמצאו לגדול לתוך עובי אופטימלי יותר עבור גורמים מסיסים להגיע לתא הבסיס בקלות כאשר נגועים בנגיף שפעת. לפיכך מומלץ להשתמש בטרנסוול בגודל 12 היטב לתרבות משותפת.

1. הקמת שכבת המזין 3T3

  1. הקמה ממניות קפואות
    1. להפשיר cryovial של NIH / 3T3 פיברובלסטים ממניות קפואות. הוסף את התוכן של cryovial ל 2 מ"ל של מדיה חיונית מינימלית מלאה של Dulbecco (DMEM) ו resuspend התאים.
    2. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 × גרם וטמפרטורת החדר / לחץ (RTP), ולהסיר את supernatant. הזן מחדש את התאים ב- DMEM מלא.
    3. ספור את התאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן. הוסף 10 μL של כחול טריפאן ל 10 μL של ההשעיה התא resuspended. מערבבים היטב, ומוסיפים 10 μL של ההשעיה להמוציטומטר כדי לספור את התאים.
    4. תאי זרעים בצפיפות של 1 × 104 תאים / ס"מ2 בצלחת תרבית מתאימה (למשל, בקבוקון T75). דגירה בקבוקון התרבות וכתוצאה מכך במשך 3 ימים ב 37 °C (5 ° F) באווירה של 5% CO2 .
  2. טיפול במיטומיצין C
    1. ב 3 ימים, להבטיח את המפגש הוא 60%-80%, להסיר את המדיום, ולשטוף את התאים עם 1x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS).
      הערה: חשוב ששכבה המזין 3T3 לא תגיע למפגש מלא; אחרת, הטיפול במיטומיצין C לא יהיה יעיל.
    2. הוסיפו לבקבוקון את ה-DMEM המלא בתוספת mitomycin C, ודגרו ל-3.5 שעות בטמפרטורה של 37°C באטמוספירה של 5% CO2 . הסר את המדיום המכיל mitomycin C, ולשטוף את התאים 2x עם 1x PBS.
  3. זריעת תאי 3T3 בלוחות של 6 בארות
    1. הוסף 3 מ"ל של 1x טריפסין-EDTA לבקבוק במשך 3-5 דקות כדי לנתק את התאים. לאסוף את התאים מנותקים בצינור 15 מ"ל טרי. צנטריפוגה צינור 15 מ"ל במשך 5 דקות ב 300 × גרם, RTP; זרוק את הסופר-נרטיב. הזן מחדש את התאים ב- DMEM מלא.
    2. ספור את התאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן. זרע את התאים בצלחת 6-well ב 7.5 × 10 5-2.5 × 106 תאים / טוב. לדגור על הצלחת לילה ב 37 °C (5° פרנהייט) באטמוספירה 5% CO2.
      הערה: שכבת המזין 3T3 נחשבת מוכנה אם התאים בריאים. בשלב זה, זרעו את תאי הגבעול/האבות של אפיתל האף האנושי (hNESPCs) על שכבת המזין להתרחבות.
    3. הוסף DMEM מלא לבקבוק ודגרה ב 37°C, 5% CO2 לילה עבור 3T3 תאים להתאושש מטיפול mitomycin C.

2. הקמת תרבות אפיתל האף האנושי (hNEC)

הערה: יש להשיג דגימות קליניות מחולים ללא תסמינים של זיהום בדרכי הנשימה העליונות.

  1. עיבוד רקמת האף לתוך השעיה של תא יחיד
    1. לשטוף רקמת האף ב 1x Dulbecco של PBS (dPBS) (PBS ללא Mg2+ ו Ca2 +) המכיל 100 μL / mL של תערובת אנטיביוטית-אנטימיקוטית. חותכים את הרקמה לרסיסים קטנים, ולטפל במדגם ב 10 מ"ג / מ"ל של פרוטאז נייטרלי לילה ב 4 °C (60 °F) עם רעד.
    2. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 200 × גרם, ולהסיר את supernatant לאחר צנטריפוגה. לדגור על הכדור ב 1-2 מ"ל של 1x טריפסין-EDTA (37 °C (37 °C (15 °F, 15 דקות), ולהרוות על ידי הוספת נפח של סרום בקר עוברי שווה 10% מהנפח בצינור.
    3. באופן מכני לנתק את הרקמה המעוכלת לתוך אגרגטים של תאים בודדים על ידי צנרת, ולאחר מכן להעביר את ההשעיה וכתוצאה מכך דרך מסננת תא 70 מיקרומטר. הזן מחדש את התאים ב- DMEM מלא.
      הערה: לאחר שלב זה, השעיית התא היא תערובת של תאים ותאי גזע מובחנים סופניים המכונים תאי גזע אפיתל האף האנושי / תאי אב (hNESPCs). מטרת השלבים הבאים היא לבחור ולהעשיר את אוכלוסיית hNESPC מתערובת של אוכלוסיות תאים שונות.
  2. זריעת מתלה של תא יחיד לשכבת מזין 3T3 לבחירת hNESPCs
    1. צנטריפוגה ההשעיה התא משלב 2.1.3 (300 × גרם, 5 דקות, RTP), ולהסיר את supernatant. Resuspend התאים ב 3-5 מ"ל של בינוני 3.
      הערה: מדיום 3 פותח כדי לקדם את הצמיחה הסלקטיבית של hNESPCs.
    2. לספור את התאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן. זרע 1 x 106 תאים ב 2mL של בינוני 3 לכל באר על צלחת 6-well המכילה שכבת מזין 3T3 מוכנה לאחר הסרת המדיה בצלחת 6 באר. לדגור את התרבות המשותפת המתקבלת ב 37 °C (5 ° F) באווירה של 5% CO2 .
      הערה: לאחר זריעה, הקפד לא להסעיר את הצלחת כפי שהוא ישפיע על הקובץ המצורף של hNESPCs.
    3. שנה בינוני 3 (2 מ"ל) כל 2-4 ימים על ידי הסרת המדיום הישן לחלוטין והחלפתו במדיום טרי 3.
      הערה: מדיום משתנה כדי לחדש חומרים מזינים וכדי למנוע מצבים חומציים מדי להשפיע לרעה על הצמיחה של hNESPCs. המרווח בין כל שינוי בינוני תלוי עד כמה חומצי (צהוב) המדיום הופך. יש לקצר את המרווחים אם המדיום הופך חומצי במהירות.
    4. לאחר 7-10 ימים, שים לב כי hNESPCs נמצאים במפגש מתאים להעברתם על תוספות ממברנה. ראו איור 1 למורפולוגיה מייצגת של hNESPCs בשלוש נקודות זמן שונות (יומיים, 5 ימים ו-10 ימים).
  3. העברת hNESPCs על תוספות ממברנה
    הערה: בשל טיפול mitomycin C, שכבת מזין 3T3 יהיה לאט להתפרק במהלך תקופת ההרחבה hNESPC. זה יגרום הידבקות מוחלשת על פני השטח של הבאר, המאפשר את הפריקה שלהם על ידי שטיפה עם פיפטה, משאיר מאחור רק את hNESPCs בריא.
    1. הסר את המדיום, והוסף 500 μL של 1x dPBS לכל באר. רוקן את התאים 3x עם micropipette כדי לחלץ את תאי 3T3, ולהשליך את 1x dPBS. שים לב תחת המיקרוסקופ כי hNESPCs עגול נשארים בעוד שכבת מזין 3T3 בצורת ציר הוא מנותק.
    2. הוסף 500 μL של ריאגנט ניתוק תאים לבאר, ודגר ב 37 °C (5° C) באטמוספירה של 5% CO2 במשך 5-10 דקות, או עד hNESPCs התנתקו מפני השטח של הבאר.
    3. לאסוף את ההשעיה hNESPC, צנטריפוגה (300 × גרם, 5 דקות, RTP), ולהסיר את supernatant.
    4. מחדש את הכדור במדיום 3. לספור את התאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן. זרע 3 × 104 תאים ב 150 μL של בינוני 3 לכל תוספת ממברנה (צלחת 24-well) או 1 × 105 תאים ב 300 μL של בינוני 3 לכל תוספת ממברנה (צלחת 12-well) (איור 2). לדגור על התאים ב 37 °C (5° פרנהייט) באטמוספרה של 5% CO2 .
    5. שנה את המדיום (בינוני 3) של התאים האפיים והבסיסיים כל יומיים. נווט בקצה פיפטה בין הזרועות התומכות של הממברנה כדי לגשת לתא הבסיס, להסיר את המדיום הישן, ולאחר מכן להציג מחדש מדיום טרי באותה שיטה. למרות התא apical נגיש בקלות, הקפד לא להפריע שכבת hNESPC גדל.
      הערה: אין להפריע למדיום בתא האפי לפחות יומיים לאחר הזריעה מכיוון שהתאים זקוקים לזמן כדי להתחבר לממברנה.
  4. בידול של hNESPCs ל- hNECs
    1. כאשר hNESPCs להגיע 100% מפגש (כ 3-7 ימים מן זריעה על תוספת הממברנה), להתחיל את תרבות ALI. שנה את המדיום הבסיסי למדיום בידול, והסר את המדיום מתא האפי. הוסיפו מדיום לתא הבסיס רק מבלי להוסיף אותו לתא האפי בעת שינוי המדיום כל 2-3 ימים, כפי שצוין באיור 3 ובשלב 2.3.5.
      הערה: בינוני משתנה למדיום בידול כדי לקדם את ההבחנה של hNESPCs ל- hNECs ב- ALI. hNESPCs לוקח בערך 3-4 שבועות כדי להגיע לבגרות מלאה כדי להפוך hNECs ב- ALI, בשלב זה התאים היו גדלים לתוך multilayer עם אוכלוסיות שונות של תאים בכל שכבה. Cilia צריך גם להיות נצפה בהגדלה של 400x (cilia ניתן לזהות על ידי תנועת המכות שלהם, אשר גורמים לשדה המיקרוסקופ להיראות כאילו הוא רוטט). בשלב זה, התאים מוכנים לשימוש לניסויי התרבות המשותפת. עיינו באיור 4 לחתך של שכבת hNEC מובחנת לחלוטין.
    2. לאחר קבלת hNECs בוגרים, לשטוף את התאים בתא apical 3x עם 1x dPBS במרווחי 2-3 ימים במשך שבוע אחד לפני הניסוי לתרבות משותפת. סינרגיה שלב הכביסה עם השינויים הבינוניים הבסיסיים, ולבצע את השטיפות כדלקמן.
      1. הוסף 50 μL (24-well)/150 μL (12-well) של 1x dPBS לתוך התא האפילי של תוספת הממברנה, ודגר את התאים ב 37 °C (10 °F) במשך 10 דקות. הסר את dPBS לאחר 10 דקות של דגירה כדי להסיר ריר מצטבר ותאים מתים במהלך ההבחנה.
        הערה: בהתאם לאופי הניסוי, פתרון סודיום ביקרבונט יכול לשמש כדי לשטוף את שכבת הריר לחלוטין. עם זאת, עבור זיהום ויראלי בניסויים בתרבות משותפת, שכבת הריר נשמרת, ורק ריר עודף מוסר עם שטיפת dPBS. שימור זה הוא לחקות את שכבת ריר פיזיולוגית נוכח על אפיתליה האף כי יהיה אינטראקציה עם זיהום ויראלי נכנס.

3. מדידת התנגדות חשמלית טרנס-אפיתלאלית (TEER)

הערה: אישור של שלמות האפיתל חשוב כדי להבטיח כי שכבה אפיתל שלמה ובריאה מתקבלת. שכבת אפיתל שלמה נקבעת באמצעות מדידת TEER המבוצעת על 4 בארות אקראיות באמצעות וולטוהמטר.

  1. יש לשטוף את האלקטרודה ב-70% אתנול, ולעקר אותה באור אולטרה סגול למשך 15 דקות לפני השימוש כדי להבטיח סטריליות. יש לשטוף עם 1x dPBS לאחר עיקור.
  2. הוסף 100 μL (עבור 24-well) או 300 μL (עבור 12-well) של 1x dPBS לתא apical של תוספת הממברנה. לדגור על הצלחת ב 37 °C (50 °F) במשך 10 דקות; לאחר מכן, הסר את ה- dPBS.
  3. כדי שכל באר תימדד, הכן באר לא מנוצלת עם 1 מ"ל (עבור 24-well) או 3 מ"ל (עבור 12-well) של מדיום בידול לפני המלחמה (עד 37 °C ).? מניחים את הקרום להוסיף היטב מוכן, ולהוסיף 200 μL (עבור 24-well) או 600 μL (עבור 12-well) של מדיום בידול לפני המלחמה לתא apical. שיווי משקל ב 37 °C (בכפוף לטמפרטורת הדגירה של סוג הנגיף הוסיף, למשל, 35 °C (50 °F) עבור שפעת) במשך 15 דקות.
    הערה: הכן ריק (הוספת קרום ריק) באותו אופן לחישוב TEER.
  4. שיווי משקל צינור 15 מ"ל של מדיום בידול לפני המלחמה באותה טמפרטורה במשך 15 דקות גם כן. מניחים את האלקטרודות בצינור 15 מ"ל, ולהפעיל את voltohmmeter.
    הערה: בשלב זה, הקריאה צריכה להיות 0 התנגדות, כמו האלקטרודות הן באותו מדיום. אם מתקבלת קריאה אחרת, שיווי משקל האלקטרודה בצינור 15 מ"ל עד הקריאה היא 0.
  5. החל מהריק, מקם את האלקטרודות בכל באר כך שאלקטרודה אחת שקועה במדיום התא האפוי והשנייה במדיום תא הבסיס. הקלט את הקריאה רק כאשר מתקבלת קריאה מתמדת לתקופה של 5 דקות לפחות.
  6. לאחר כל מדידה, לשטוף את האלקטרודה עם PBS לפני המדידה הבאה. עבור כל נבדק היטב, לקחת מדידות עבור שלוש דגימות במיקומים שונים של הממברנה. כדי לחשב את ה- TEER נטו של כל דגימה, הפחת את עמידות הרקע, שניתנה על-ידי הוספת הממברנה הריקה, מכל מדידה.
  7. חשב את קריאת TEER הכוללת עבור באר באמצעות המשוואה הבאה:
    שלמות אפיתל (Ωcm2) = Net TEER(ohms) × אזור הממברנה (ס"מ2)
    הערה: ערכי TEER של hNECs לניסויי זיהום ויראליים צריכים להיות >1000 Ωcm2 13,15,16. 

4. בידוד של מונוציטים דם היקפיים ותאי NK

הערה: יש להשיג דגימות דם ממתנדבים בריאים ולהשתמש בהן באותו יום של בידוד.

  1. לאסוף 30-40 מ"ל של דם שלם מכל תורם בצינורות איסוף דם 10 מ"ל.
  2. בודדו את מחשבי ה-PBMCs באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות, וקבלו מחשבי PBMCs ממעיל הבאפי לאחר השלבים הבאים (ראו גם טבלת החומרים).
    1. יש לערבב ביסודיות ~ 10 מ"ל של דם מצינור איסוף הדם ב vacutainer לפני דילול עם נפח שווה של פתרון מלח מאוזן (PBS).
    2. הוסף 15 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות לבסיס של צינור 50 מ"ל.
      הערה: היחס בין שיפוע צפיפות בינוני לדם מדולל צריך להיות 2:3-3.5.
    3. שכבה 35 מ"ל של דם מדולל על המדיום שיפוע הצפיפות עם אקדח פיפטה (עם הגדרת לוותר מוגדרת לנמוך ביותר האפשרי) על ידי הטיית הצינור על ידי הטיית הצינור על ידי 45 ° ומאפשר את הדם המדולל ליפול טיפה על הקיר הפנימי של הצינור, כך שכבת מדיום שיפוע צפיפות לא מופרע.
    4. צנטריפוגה lysate ב 500 × גרם, 18-20 °C (30 °F) במשך 30 דקות (בלם: כבוי). הסר בזהירות והשלך את שכבת הפלזמה העליונה מבלי להפריע לשכבה התחתונה.
    5. מעבירים את שכבת הבאפי לצינור חדש מבלי לערבב את שכבת תאי הדם האדומים, את השכבה הבינונית בצפיפות ההדרגתית או את מעיל הבאפי. לאחר שמעיל הבאפי נאסף בצינור חדש של 50 מ"ל, העלה את הנפח ל-50 מ"ל עם 1x PBS.
    6. צנטריפוגה lysate ב 800 × גרם, 18-20 °C (8 °F),8 דקות (בלם: כבוי), ולהסיר את supernatant עם אקדח פיפטה. Resuspend את גלולה התא עם 50 מ"ל של 1x PBS, וצנטריפוגה ב 120 × גרם, 18-20 °C (60 °F), 10 דקות כדי להסיר טסיות דם.
    7. להשליך את supernatant על ידי צינורות, מבלי להפריע גלולה התא.
      הערה: כמו גלולה התא עשוי להיות רופף, זה לא מומלץ להשליך את supernatant על ידי שפיכה.
    8. Resuspend גלולה התא עם מלא RPMI (מכון הזיכרון רוזוול פארק) מדיום. בצע ספירת תאים על ידי הוספת 10 μL של 3% חומצה אצטית עם מתילן כחול ל 10 μL של השעיית התא resuspended. מערבבים היטב, ומוסיפים 10 μL של התערובת להמוציטומטר כדי לספור את התאים.
  3. לדלל PBMCs עם מדיום RPMI מלא לצפיפות של 2 × 106/mL (עבור 24-well) או 4 × 106/mL (עבור 12-well).

5. זיהום נגיפי hNEC ומעבר ל- hNEC:PBMC תרבות משותפת

הערה: H3N2 (A/Aichi/2/1968) משמש כזן היציג של זיהום בפרוטוקול זה. ריבוי של זיהום (MOI) של 0.1 משמש MOI הייצוגי בפרוטוקול זה.

  1. יום 0 (זיהום של hNECs)
    הערה: באר אחת מן hNECs גדל מאותו תורם משמש כדי לקבל ספירת תאים מייצגת עבור כל היטב בשימוש בניסוי.
    1. בבאר הייצוגית, להוסיף 150 μL של 1x טריפסין-EDTA לתא apical של הכנס הממברנה ו 350 μL של 1x טריפסין-EDTA לתא הבסיס, ודגר ב 37 °C (60 °F) במשך 10 דקות, או עד התאים להתנתק מן הממברנה.
    2. לשטוף את התאים על הממברנה על ידי צנרת למעלה ולמטה, ולאסוף את ההשעיה בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. הוסף 200 μL של DMEM מלא כדי להרוות פעילות טריפסין. לספור תאים באמצעות כתמים כחולים טריפאן כדי להשיג את ספירת התאים לבאר.
    3. חשב את ה- MOI הנדרש של הנגיף בהתבסס על ספירת התאים לבאר, ודלל את מלאי הווירוסים בהתאם עם RPMI מלא על קרח.
      הערה: MOI 0.1 של 1.26 × 106 hNECs לבאר = 1.26 × 105 חלקיקים ויראליים H3N2 לבאר ב 30 μL (עבור 24-well)/100 μL (עבור 12-well)
    4. עבור הבארות הנותרות לניסוי הזיהום, להוסיף 50 μL (עבור 24-well)/150 μL (עבור 12-well) של 1x dPBS לתוך התאים האפיים של מוסיף הממברנה, לדגור ב 37 °C (10 °C ( 10 דקות, ולהסיר את 1x dPBS.
    5. שנה את המדיום הבסיסי בממברנה מוסיף כדי להשלים מדיום RPMI על ידי העברת התוספות ללוח חדש עם RPMI מלא הוסיף הבארות (350 μL (עבור 24-well)/700 μL (עבור 12-well)).
      הערה: כאשר hNESPCs נבדלו באופן מלא ל- hNECs, הם סובלניים/מתירניים למדיה שונה עבור עד 72 שעות, ללא שינויים במורפולוגיה או בארגון כאשר המדיום עובר ל- RPMI12. RPMI משמש לתמיכה בצמיחה ותחזוקה של אוכלוסיית PBMC.
    6. הוסף את 30 μL מוכן (עבור 24-well)/100 μL (עבור 12-well) של הנגיף inoculum לתוך התא האפוי של תוספת הממברנה, לדגור ב 35 °C (5 ° C ) באטמוספירה 5% CO2 עבור 1 שעות, ולהסיר את אינוקולום הנגיפי מתא apical.
    7. שנה את המדיום הבסיסי של תוספת הממברנה למדיום RPMI מלא טרי ודגר ב 35 °C (5° C) באטמוספירה של 5% CO2 במשך 24 שעות.
  2. יום 1 (הקמת hNECs + תרבות משותפת של מחשבים אישיים)
    1. זרע את המספר הנדרש של PBMCs ב 150 μL (עבור 24-well)/300 μL (עבור 12-well) של מדיום RPMI מלא על ידי הוספת ישירות את ההשעיה PBMC לתוך התא הבסיסי של כל באר של כל באר של hNECs נגועים או נגועים מיום 0 (1.5 × 106 עבור צלחות 24-well ו 3 × 1010 6 עבור צלחות 12-well). דגירה ב 37 °C (50 °F) עבור 24/48 שעות.
      הערה: הכרך הסופי בתא הבסיס לאחר הקמת התרבות המשותפת הוא 500 μL (עבור 24-well)/1000 μL (עבור 12-well).
  3. ימים 2-3 (קצירת PBMCs 48/72 h זיהום לאחר ויראלי)
    1. אוסף של supernatants apical (48/72 שעות זיהום פוסט ויראלי)
      1. הוסף 50 μL (עבור 24-well)/150 μL (עבור 12-well) של 1x dPBS לכל תא apical, ודגור ב 37 °C ((37 °F) במשך 10 דקות. לאסוף את 1x dPBS בצינורות 1.5 מ"ל. Aliquot 25 μL (עבור 24-well)/50 μL (עבור 12-well) של supernatant עבור פלאק לבדוק בצינור חדש 1.5 מ"ל, ומיד להקפיא הן את המלאי ואת aliquots ב -80 °C (80 °F).
    2. אוסף של RNA סלולרי מ hNECs (48/72 שעות זיהום פוסט ויראלי)
      1. מעבירים את תוספת הממברנה לבאר נקייה, מוסיפים 300 μL (עבור 24-well)/600 μL (עבור 12-well) של חיץ תמוגה RNA לתא האפי, ודגור ב RTP במשך 5 דקות. לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל, ולאחסן אותו ב -80 °C (80 °F) עד מיצוי RNA לניתוח מולקולרי.
    3. קצירת PBMCs (48/72 שעות לאחר זיהום ויראלי)
      1. עם בסיס רחב של קצה פיפטה סטרילי, לגרד בעדינות את פני השטח של הבאר כדי לעקור את PBMCs מופעל שעשוי להיות דבק על פני השטח באר. לאסוף את המדיום הבסיסי המכיל PBMCs בצינור צנטריפוגה 2 מ"ל.
      2. לשטוף את הבארות 2x עם 300 μL של 1x dPBS, ולאסוף את הכביסה באותו צינור 2 מ"ל. צנטריפוגה צינור 2 מ"ל (500 × גרם, 5 דקות, RTP), ולאסוף את supernatant בצינור 2 מ"ל טרי ללא גלולה תאים מפריעה. לאחסן את supernatant ב -80 °C (80 °F) לניתוח ציטוקינים וכימוקין; resuspend גלולה התא ב 200 μL של 1x dPBS.

6. ציטומטריית זרימה

הערה: סעיף זה של הפרוטוקול ממשיך ישירות מהסעיף הקודם באמצעות השעיית התא PBMC משלב 5.3.3.2. הבטח חשיפה מינימלית לאור במהלך השלבים הבאים בסעיף זה. לוח מדגם של סמני כתמי משטח ניתן למצוא בטבלה 2.

  1. כתמי פני השטח
    1. מעבירים את גלולה התא PBMC המחודשת לצלחת באר תחתונה של 96-V. צנטריפוגה lysate ב 800 × g במשך 3 דקות, ולהסיר את supernatant.
    2. לדגור על כל מחשבי PBMCs (למעט "לא נגוע") עם 100 μL של כתם הכדאיות במשך 15 דקות ב RTP. למעלה עד 200 μL עם 150 μL של מאגר מיון תאים המופעלים מגנטית (MACS). צנטריפוגה lysate ב 800 × גרם במשך 3 דקות, ולהשליך את supernatant.
    3. הכן פאנל של נוגדנים מכתימים פני השטח של עניין עם יחסי דילול מתאימים ונפח סופי של 50 μL לכל תגובה (למעלה עם מאגר MACS כדי לקבל את הנפח הסופי). בצע כתמי משטח על ידי הוספת 50 μL של תערובת הנוגדנים המוכן לתאים באמצעות פיפטה רב ערוצית. דגירה ב 4 °C (4 °F) במשך 15 דקות בחושך.
    4. לשטוף על ידי הוספת 150 μL של מאגר MACS. צנטריפוגה lysate ב 800 × גרם במשך 3 דקות, ולהשליך את supernatant. אם אין צורך בהכתמה תאית, המשך ישירות לדגירה של 15 דקות בשלב 6.3.
  2. כתמים תאיים (במידת הצורך)
    1. הוסף 100 μL של פתרון קיבעון וחדירות לכל באר. דגירה ב 4 °C (65 °F) במשך 20 דקות בחושך. מלא את הבארות עם 100 μL של מאגר MACS 1x.
    2. צנטריפוגה (800 × גרם, 3 דקות, 25 מעלות צלזיוס), ולהסיר את supernatant. חזור על הכביסה על ידי הוספת 200 μL של 1x מאגר לשטוף פרמביליזציה. צנטריפוגה (500 × גרם, 3 דקות, 25 מעלות צלזיוס), ולהסיר את supernatant.
    3. הכן את הדילולים עבור לוח הנוגדנים של עניין כדי להשיג נפח סופי של 50 μL באמצעות 1x מאגר שטיפת Permeabilization. דגירה על קרח במשך 30 דקות בחושך. הוסף 200 μL של 1x מאגר שטיפת פרמביליזציה.
    4. צנטריפוגה התאים (800 × גרם, 3 דקות, 4 °C (50 °F), ולהסיר את supernatant. resuspened התאים ב 100 μL של מאגר מיון תאים המופעלים פלואורסצנטיות.
  3. פיפטה 200 μL של פתרון lysing לתוך כל באר. דגירה במשך 15 דקות ב RTP. צנטריפוגה lysate ב 800 × g במשך 3 דקות ולהשליך את supernatant.
  4. resuspend את כדורי התא ב 200 μL של מאגר MACS. בצע ציטומטריית זרימה בהתאם להגדרות שתוארו קודם לכן13, או לאחסן ב 4 °C (60 °F) בחושך.

7. קביעת רמות ציטוקינים וכימוקין

  1. תהליך 25 μL של supernatant תא הבסיס באמצעות בדיקת מולטיפלקס אימונולוגיה על פי פרוטוקולהיצרן 18.
  2. חשב את הריכוז של כל ניתוח באמצעות תוכנת מנהל מולטיפלקס המשתמשת באלגוריתם התאמת עקומה (5 פרמטרים) עבור העקומה הסטנדרטית.

8. הערכה של זיהום ויראלי

  1. לחלץ RNA ויראלי באמצעות ערכת חילוץ על 4 סטים של פתרונות: פתרון H3N2 המלאי, דילול MOI 0.1 לזיהום, דילול סדרתי 10x של MOI 0.1, ואת המדיום הבסיסי מן הדגימות (הן 48 ו 72 שעות זיהום פוסט ויראלי)12.
  2. בחר גן לא מבני (NS1) ומטריצה (M1) כיעדים לתגובת שרשרת פולימראז (PCR) (עיין בטבלת החומרים עבור פריימרים המשמשים בניסוי הייצוגי).
  3. בצע הפוך תמלול-PCR (RT-PCR) (42 °C, 60 דקות) כדי להמיר את ה- RNA הנגיפי ל- cDNA לפני ביצוע PCR כמותי (qPCR) כדי למדוד את רמות NS1 ו- M1 כבאקסי לנוכחות ויראלית, ולהתאים את הרמות לעקומה הסטנדרטית המתקבלת מה- RT-qPCR המבוצעת על דילול סדרתי 10x של MOI 0.1 aliquot. עיין בטבלה 3 להרכב תערובות התגובה, והשתמש בתנאים הבאים: קדם-דגירה בטמפרטורה של 95 °C (10 °F) למשך 10 דקות, ואחריו הגברה של 3 שלבים עבור 40 מחזורים: 95 °C (95 °F) עבור 10 s, 60 °C (60 °F) עבור 10 s, 72 °C (72 °F) עבור 30 s; עקומת התכה: 95 °C (10 °F) עבור 10 s, 65°C עבור 60 s, ו 97 °C עבור 1 s.

9. בדיקת פלאק

  1. יום 0: זריעת MDCK (כליה כלב מאדין דארבי) בצלחות 24-well
    1. הסר את המדיום מבקבוק T75 של תאי MDCK זורמים. לשטוף 2x עם 1x PBS כדי להסיר את כל שאריות של סרום. טריפסין תאי MDCK על ידי הוספת 10 מ"ל של טריפסין ודירה ב 37 °C (5° C) באטמוספרה 5% CO2 במשך 20-30 דקות עד התאים להתנתק.
      הערה: אל תקישו על הבקבוקון מכיוון שהדבר עלול לגרום לגושים.
    2. פיפטה השעיית התא לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של מדיום חיוני מינימלי מלא של נשר (EMEM). צנטריפוגה (300 × גרם, 5 דקות, RTP), ולהסיר את supernatant.
    3. התקן מחדש את התאים ב-6 מ"ל של EMEM מלא. ספור את התאים לפי כתמים כחולים טרייפן.
    4. לדלל את ההשעיה התא MDCK לריכוז של 1 × 105 תאים / מ"ל, וזרע 1 מ"ל של ההשעיה מדוללת בכל באר של צלחת סטרילית 24-well. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 למשך 24 שעות כדי להשיג מונולייר משולב של תאי MDCK בכל באר.
  2. יום 1: זיהום של תאי MDCK
    1. הכן את מדיום הזיהום. הסר את המדיום מן monolayer MDCK בצלחת 24-well, ולשטוף 2x עם 1x dPBS. לכביסה השנייה, להשאיר את PBS בבארות תוך הכנת דילול סדרתי של הנגיף.
    2. להפשיר את דגימות הנגיף על קרח, ולדלל אותם באופן סדרתי בלוח 24-well כדי להשיג דילול סדרתי מ 10-1 ל 10-6.
      הערה: כדוגמה, מלא כל באר בצלחת של 24 בארות עם 270 μL של מדיום זיהום.
    3. הוסף 30 μL של דגימת הווירוס לבאר הראשונה בשורה. עם טיפ פיפטה חדש, לערבב היטב ולהעביר לבאר הבאה בשורה כדי לדלל את המדגם על ידי 10x. המשך עד 10-6 דילול הושג; בצע שלבים 9.2.1-9.2.3 עבור כל דגימות הווירוסים.
    4. הסר PBS מצלחת MDCK, ולהדביק כפול עם 100 μL של דילול ויראלי מוכן. עבור בארות שליטה, להוסיף 100 μL של מדיום הזיהום (ללא המדגם הנגיפי). דגירה בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 למשך שעה אחת, מנענעת את הצלחת כדי למנוע כתמים יבשים כל 15 דקות.
    5. הסר את inoculum הנגיפי, ולהוסיף 1 מ"ל של כיסוי נוזלי עבור כל באר. דגירה בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס באטמוספירה של 5% CO2 למשך 72 שעות.
  3. יום 4 (72 שעות לאחר ההדבקה): הדמיה פלאק
    1. הסר את שכבת-העל הנוזלית, ותקן את התאים עם 4% פורמלדהיד ב 1x PBS במשך 1 שעות. הסר את פתרון פורמלדהיד, ולשטוף פעם אחת עם 1x PBS או מים מזוקקים.
    2. להכתים את התאים הקבועים על ידי הוספת 1% פתרון סגול קריסטל במשך 15 דקות. הסר את צבע סגול קריסטל, ולשטוף את התאים עם מים זורמים. יבש את הצלחת ב RTP.
    3. לאחר הייבוש, ספור לוחות וחשב את הטייטר הנגיפי בהתאם לנוסחה הבאה:
      מספר לוחות × פקטור דילול = מספר פלאק - יוצר יחידות ב 100 μL

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

למרות שתאי T קונבנציונליים מהווים את הרפרטואר העיקרי של תגובה חיסונית אדפטיבית נגד זיהום ויראלי כדי להקל על הסיווג הנגיפי, אוכלוסיית תאי ה- T המולדת פועלת על פני ספקטרום רחב יותר כדי לדכא את העומס הנגיפי לשחרור יעיל בשלב מאוחר יותר. לכן, פרוטוקול זה יוצר באופן ספציפי מצב חזק לחקור תאי T מולדים, ההפעלה שלהם, ואת האוכלוסייה התפקודית שלהם בעקבות זיהום שפעת, ללא צורך בדגימות אפיתל ותא חיסוני מאותו תורם. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על וירוסים אחרים, אם כי זה עשוי להיות מוגבל וירוסים עם שחר...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

תגובות חיסוניות מולדות נגד וירוסים הן תחום מחקר שלא נחקר בניהול אנטי-ויראלי. תאי האפיתל בדרכי הנשימה ותאי החיסון המולדים פועלים בתיאום כדי לדכא שכפול ויראלי במהלך זיהום, מלבד לשמש כגורם דטרמיננטה של תגובה אדפטיבית מוגזמת אם העומס הנגיפי אינו נשמר בבדיקה 12,13,17. עם זאת, הפיתוח של מודל אנושי רלוונטי לחקר האפיתל-מולד מערכת החיסון crosstalk כדי לחקור את ההפעלה של תאי מערכת החיסון המולדת כדי להעניק תגובה אנטי ויראלית מתאימה נשאר את...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

כל המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

תודות

ברצוננו להודות לצוות המחקר במחלקה לאוטולרנגולוגיה של NUS ולמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה על עזרתם בעבודה הקשורה לתרבות HNEC ולתרבות ויראלית. ברצוננו גם להודות למנתחים ולצוות הכירורגי בבית החולים האוניברסיטאי הלאומי, המחלקה לאוטולרנגולוגיה, על עזרתם באספקת דגימות התא והדם הנדרשות למחקר.
מחקר זה מומן על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי, סינגפור לא. NMRC/CIRG/1458/2016 (לדה יון וואנג) ו-MOH-OFYIRG19may-0007 (לקאי סן טאן). קאי סן טאן הוא מקבל תמיכה מלגה ממלגת מחקר לאלרגיה ואימונולוגיה קלינית (EAACI) אירופאית לשנת 2019.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.5% Trypsin-EDTAGibco15400-054
0.5 M חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), pH 8.0, RNaseללא ThermofisherAM9260G0.5M EDTA
1.5 מ"ל צינורות SafeLock Eppendorf00301200861.5 מ"ל צינור צנטריפוגה
10 מ"ל K3EDTA צינורות ואקוטיינרBD36664310 מ"ל צינורות איסוף דם
10x dPBSGibco14200-075
10x PBSVivantisPC0711
12 בארות צלחתקורנינג 3513
12 בארות Transwell הכנסקורנינג 3460ממברנה
הכנס 1x FACS תמיסת ליסהBD349202
2.0 מ"ל צינורות SafeLockEppendorf00301200942 מ"ל צינור צנטריפוגה
24 בארותצלחת קורנינג 3524
24 בארות Transwell הכנסקורנינג 3470
3% חומצה אצטית עם מתילן כחולSTEMCELL Technologies07060
3,3',5-triiodo-l-thyronineSigmaT-074
37% תמיסת פורמלדהיד עם 15% מתנול כמייצב ב-H2Oסיגמא533998
5810R צנטריפוגהאפנדורף5811000320
5 מ"ל פוליפרופילן צינורות (צינורות זרימה)BD352058
70 ומיקרו; מסננת תאיםm קורנינג 
A-4-62 רוטורEppendorf5810709008
AccutaseGibcoA1110501מגיב דיסוציאציה של תאים
אנטיביוטי-אנטימיקוטיGibco15240-062
Avicel CL-611FMC BiopolymerNALiquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard SoftwareBio-Rad Laboratories, Inc171STND01Multiplex Manager תוכנה
מחט פרפר 21 גרםBD367287
כולרה טוקסיןסיגמאC8052
קריסטל סגול MerckC6158
תמיסת ציטופיקס/ציטופרםBDתמיסת קיבוע וחדירה
554722 Dispase IISigmaD4693פרוטאז ניטרלי
DMEM/גלוקוז גבוהGE Healthcare מדעי החייםSH30243.01
תערובת DMEM/תזונה F-12Gibco-Invitrogen11320033
dNTP MixPromegaU1515dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)ATCC30-2003
EVOM מכשיר וולטוממטרWPI, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב300523
FACS Lysing SolutionBD3492021x תמיסת ליזינג
פלקון שפופרת 15 מ"לCellStar18827115 מ"ל שפופרת
פלקון 50 מ"לCellStar22726150 מ"ל צינור
התחלה מהירה בדיקות DNA חיוניות מאסטררוש6402682001qPCR מאסטר מיקס
Ficoll Paque מכשירימחקר17544203צפיפות שיפוע
מדיה H3N2 (A/Aichi/2/1968) ATCCVR547
H3N2 M1 רצף פריימר קדימהסיגמא5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2
M1 רצף פריימר הפוךסיגמא5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'H3N2
NS1 רצף פריימר קדימהסיגמא5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2
NS1 סיגמא פריימר הפוך5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'סרום
בקר עוברי מומת בחוםGibco10500-064
hNESPCsתורמים אנושייםNA
גורם גדילה אפיתל אנושיGibco-InvitrogenPHG0314
הידרוקורטיזוןSTEMCELL Techonologies7925נאסף מביופסיות אף במהלך ניתוחי
סטיית מחיצהאינסוליןSigmaI3536
Lightcycler 96Roche5815916001qPCR מכשיר
חי/מת כחול תא כתמים ערכת *לעירור UVThermofisherL23105כדאיות כתם
MILLIPLEX MAP אנושי ציטוקין/כימוקין מגנטי חרוז פאנל II - Premixed 23 PlexMerck Pte LtdHCP2MAG-62K-PX23אימונולוגיה מולטיפלקס מבחן
מיטומיצין CSigmaM4287
M-MLV 5x BufferPromegaM1705RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse TranscriptasePromegaM1706Reverse Transcriptase
N-2 supplementGibco-Invitrogen17502-048
NIH/3T3ATCCCRL1658
מאגר סלסול/שטיפהBD554723פרמביליזציה מאגר שטיפה
PneumaCult-ALI 10x תוסףTECHONOLOGIES של תאי גזע5001
פנאומהCult-ALIטכונולוגיות תאי גזע5001
תוסף תחזוקה של פנאומהCult-ALI (פי 100)טכונולוגיות של תאי גזע5001
פריימרים אקראייםPromegaC1181פריימרים אקראיים
מעכב רנזין רנאז רקומביננטיPromegaN2511RNase מעכב
RNA מאגר ליזהQiagenחלק מ-52904
RPMI 1640 (עם L-גלוטמין)ATCC30-2001
STX2 אלקטרודותWPI, סרסוטה, פלורידה, ארה"בSTX2אלקטרודה
T25 בקבוקקורנינג430639
T75 בקבוקקורנינג430641U
TPCK TrypsinSigmaT1426
Trypan BlueHycloneSV30084.01
ערכת מיצוי RNA ויראליQiagen52904ערכת מיצוי RNA ויראלי
בצורת V 96 בארות צלחתקורנינג3894
431751 פרימיום בינוניות

מקורות

  1. Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
  2. Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364(2013).
  3. Gerdil, C. The annual production cycle for influenza vaccine. Vaccine. 21 (16), 1776-1779 (2003).
  4. Putri, W., Muscatello, D. J., Stockwell, M. S., Newall, A. T. Economic burden of seasonal influenza in the United States. Vaccine. 36 (27), 3960-3966 (2018).
  5. Mas-Coma, S., Jones, M. K., Marty, A. M. COVID-19 and globalization. One Health. 9, 100132(2020).
  6. Guo, Y. R., et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Military Medical Research. 7 (1), 11(2020).
  7. Guan, W. J., et al. Clinical characteristics of coronavirus disease 2019 in China. New England Journal of Medicine. 382, 1708-1720 (2020).
  8. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells are activated during human viral infections. Nature Communications. 7, 11653(2016).
  9. Chien, Y. H., Meyer, C., Bonneville, M. Gammadelta T cells: first line of defense and beyond. Annual Review of Immunology. 32, 121-155 (2014).
  10. van Wilgenburg, B., et al. MAIT cells contribute to protection against lethal influenza infection in vivo. Nature Communications. 9 (1), 4706(2018).
  11. Dias, J., Leeansyah, E., Sandberg, J. K. Multiple layers of heterogeneity and subset diversity in human MAIT cell responses to distinct microorganisms and to innate cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (27), 5434-5443 (2017).
  12. Yan, Y., et al. Human nasal epithelial cells derived from multiple individuals exhibit differential responses to H3N2 influenza virus infection in vitro. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (1), 276-281 (2016).
  13. Luukkainen, A., et al. A co-culture model of PBMC and stem cell derived human nasal epithelium reveals rapid activation of NK and innate T cells upon Influenza A virus infection of the nasal epithelium. Frontiers in Immunology. 9, 2514(2018).
  14. Tan, K. S., et al. RNA sequencing of H3N2 influenza virus-infected human nasal epithelial cells from multiple subjects reveals molecular pathways associated with tissue injury and complications. Cells. 8 (9), 986(2019).
  15. Kim, N., et al. Effect of lipopolysaccharide on diesel exhaust particle-induced junctional dysfunction in primary human nasal epithelial cells. Environmental Pollution. 248, 736-742 (2019).
  16. Tan, K., et al. In vitro model of fully differentiated human nasal epithelial cells infected with rhinovirus reveals epithelium-initiated immune responses. Journal of Infectious Diseases. 217 (6), 906-915 (2018).
  17. Tan, K. S., et al. Comparative transcriptomic and metagenomic analyses of influenza virus-infected nasal epithelial cells from multiple individuals reveal specific nasal-initiated signatures. Frontiers in Microbiology. 9, 2685(2018).
  18. Cytokine /Chemokine Panel II 96 Well Plate Assay. Millipore Corporation. , Available from: https://www.merckmillipore.com/SG/en/product/MILLIPLEX-MAP-Human-Cytokine-Chemokine-Magnetic-Bead-Panel-II-Premixed-23-Plex-Immunology-Multiplex-Assay,MM_NF-HCP2MAG-62K-PX23?#documentation (2020).
  19. Gamage, A. M., et al. Infection of human nasal epithelial cells with SARS-CoV-2 and a 382-nt deletion isolate lacking ORF8 reveals similar viral kinetics and host transcriptional profiles. PLoS Pathogens. 16 (12), 1009130(2020).
  20. Zhao, X. N., et al. The use of nasal epithelial stem/progenitor cells to produce functioning ciliated cells in vitro. American Journal of Rhinology & Allergy. 26 (5), 345-350 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הפעלה של מערכת החיסון המולדתתאי אפיתל נזאלייםתאי T מולדיםתאים חד גרעיים של דם היקפי (PBMC)ציטומטריית זרימהזיהום בנגיף השפעתתקשורת חיסונית-אפיתליתאנליזת ציטוקינים
מודל תרבות משותפת ללא מגע לחקר הפעלת תאי מערכת החיסון המולדת במהלך זיהום בנגיף הנשימה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.