פרוטוקול זה מפרט חקירה של האינטראקציות המוקדמות בין תאי אפיתל האף נגועים ויראלית והפעלת תאים מולדים. ניתן להבחין בין תת-קבוצות בודדות של תאי מערכת החיסון בהתבסס על הפעלתם בתגובה לזיהומים ויראליים. לאחר מכן הם יכולים להיחקר עוד יותר כדי לקבוע את השפעתם על תגובות אנטי ויראליות מוקדמות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מודל תרבות משותפת ללא מגע לחקר הפעלת תאי מערכת החיסון המולדת במהלך זיהום בנגיף הנשימה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
האינטראקציות המוקדמות בין שכבת האפיתל באף לבין תאי החיסון המולדים במהלך זיהומים ויראליים נותרות אזור שלא נחקר. המשמעות של איתות חסינות מולדת בזיהומים ויראליים גדלה באופן משמעותי כמו חולים עם זיהומים בדרכי הנשימה המציגים הפעלה גבוהה של תאי T מולד להראות תוצאה טובה יותר של המחלה. לפיכך, ניתוח אינטראקציות חיסוניות מולדות מוקדמות אלה מאפשר הבהרה של התהליכים השולטים בהם ועשוי להקל על פיתוח מטרות טיפוליות פוטנציאליות ואסטרטגיות לשיכוך או אפילו למניעת התקדמות מוקדמת של זיהומים ויראליים. פרוטוקול זה מפרט מודל רב-תכליתי שניתן להשתמש בו כדי לחקור שיחות צולבות מוקדמות, אינטראקציות והפעלה של תאי חיסון מולדים מגורמים המופרשים על ידי תאי אפיתל נגועים בדרכי הנשימה. באמצעות נגיף שפעת H3N2 (A/Aichi/2/1968) כמודל הנגיף המייצג, הפעלה מולדת של תאים מונו-גרעיניים של דם היקפי בתרבית משותפת (PBMCs) נותחה באמצעות ציטומטריית זרימה כדי לחקור את תת-קבוצות התאים המופעלים על ידי הגורמים המסיסים המשתחררים מהאפיתל בתגובה לזיהום הנגיפי. התוצאות ממחישות את אסטרטגיית ההצטיידות להבחנה בין תת-קבוצות התאים וחושפות את ההבדלים הברורים בין האוכלוסיות הפעילות של PBMCs לבין השיחה הצולבת שלהם עם האפיתל הנגוע והבקרה. לאחר מכן ניתן לנתח עוד יותר את קבוצות המשנה המופעלות כדי לקבוע את תפקודן, כמו גם שינויים מולקולריים ספציפיים לתאים. ממצאים מחקירה צולבת כזו עשויים לחשוף גורמים החשובים להפעלת אוכלוסיות תאים מולדות חיוניות, המועילות לשליטה ודיכוי התקדמות הזיהום הנגיפי. יתר על כן, גורמים אלה יכולים להיות מיושמים באופן אוניברסלי על מחלות ויראליות שונות, במיוחד על וירוסים חדשים המתעוררים, כדי לדכא את ההשפעה של וירוסים כאלה כאשר הם מסתובבים לראשונה באוכלוסיות אנושיות תמימות.
מבוא
וירוסים נשימתיים הם אולי בין הפתוגנים הנפוצים ביותר הגורמים לנטל בריאותי וכלכלי חמור. מההתפרצויות הגלובליות התקופתיות של זני מגיפה מתפתחים (למשל, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) ועד לזנים העונתיים של שפעת מדי שנה, וירוסים מהווים איום מתמיד על בריאות הציבור. למרות שחיסונים מהווים את עיקר התגובה לאתגרים גלובליים אלה של בריאות הציבור, זה מפוכח לציין כי אמצעי נגד אלה הם רק מגיבים 1,2. יתר על כן, עיכוב בין הופעתו של זן זיהומי חדש לבין הפיתוח המוצלח של החיסון שלו הוא בלתי נמנע3, מה שמוביל לתקופה שבה האמצעים הזמינים לריסון התפשטות הנגיף מוגבלים מאוד.
עיכובים אלה מ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: עיין בטבלה 1 לקבלת מתכונים של מדיה המשמשת בפרוטוקול זה.
הערה: hNECS גדל על טרנסוול 12-well נמצאו לגדול לתוך עובי אופטימלי יותר עבור גורמים מסיסים להגיע לתא הבסיס בקלות כאשר נגועים בנגיף שפעת. לפיכך מומלץ להשתמש בטרנסוול בגודל 12 היטב לתרבות משותפת.
1. הקמת שכבת המזין 3T3
- הקמה ממניות קפואות
- להפשיר cryovial של NIH / 3T3 פיברובלסטים ממניות קפואות. הוסף את התוכן של cryovial ל 2 מ"ל של מדיה חיונית מינימלית מלאה של Dulbecco (DMEM) ו resuspend התאים.
- צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 300 × גרם וטמפרטורת החדר / לחץ (RTP), ולהסיר את supernatant. הזן מחדש את התאים ב- DMEM מלא.
- ספור את ה....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
למרות שתאי T קונבנציונליים מהווים את הרפרטואר העיקרי של תגובה חיסונית אדפטיבית נגד זיהום ויראלי כדי להקל על הסיווג הנגיפי, אוכלוסיית תאי ה- T המולדת פועלת על פני ספקטרום רחב יותר כדי לדכא את העומס הנגיפי לשחרור יעיל בשלב מאוחר יותר. לכן, פרוטוקול זה יוצר באופן ספציפי מצב חזק לחקור תאי T מולדים, ההפעלה שלהם, ואת האוכלוסייה התפקודית שלהם בעקבות זיהום שפעת, ללא צורך בדגימות אפיתל ותא חיסוני מאותו תורם. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם גם על וירוסים אחרים, אם כי זה עשוי להיות מוגבל וירוסים עם שחר.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
תגובות חיסוניות מולדות נגד וירוסים הן תחום מחקר שלא נחקר בניהול אנטי-ויראלי. תאי האפיתל בדרכי הנשימה ותאי החיסון המולדים פועלים בתיאום כדי לדכא שכפול ויראלי במהלך זיהום, מלבד לשמש כגורם דטרמיננטה של תגובה אדפטיבית מוגזמת אם העומס הנגיפי אינו נשמר בבדיקה 12,13,17. עם זאת, הפיתוח של מודל אנושי רלוונטי לחקר האפיתל-מולד מערכת החיסון crosstalk כדי לחקור את ההפעלה של תאי מערכת החיסון המולדת כדי להעניק תגובה אנטי ויראלית מתאימה נשאר את.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
כל המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.
תודות
ברצוננו להודות לצוות המחקר במחלקה לאוטולרנגולוגיה של NUS ולמחלקה למיקרוביולוגיה ואימונולוגיה על עזרתם בעבודה הקשורה לתרבות HNEC ולתרבות ויראלית. ברצוננו גם להודות למנתחים ולצוות הכירורגי בבית החולים האוניברסיטאי הלאומי, המחלקה לאוטולרנגולוגיה, על עזרתם באספקת דגימות התא והדם הנדרשות למחקר.
מחקר זה מומן על ידי המועצה הלאומית למחקר רפואי, סינגפור לא. NMRC/CIRG/1458/2016 (לדה יון וואנג) ו-MOH-OFYIRG19may-0007 (לקאי סן טאן). קאי סן טאן הוא מקבל תמיכה מלגה ממלגת מחקר לאלרגיה ואימונולוגיה קלינית (EAACI) אירופאית לשנת 2019.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 0.5% Trypsin-EDTA | Gibco | 15400-054 | |
| 0.5 M חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA), pH 8.0, RNase | ללא Thermofisher | AM9260G | 0.5M EDTA |
| 1.5 מ"ל צינורות SafeLock Eppendorf | 0030120086 | 1.5 מ"ל צינור צנטריפוגה | |
| 10 מ"ל K3EDTA צינורות ואקוטיינר | BD | 366643 | 10 מ"ל צינורות איסוף דם |
| 10x dPBS | Gibco | 14200-075 | |
| 10x PBS | Vivantis | PC0711 | |
| 12 בארות צלחת | קורנינג | 3513 | |
| 12 בארות Transwell הכנס | קורנינג | 3460 | ממברנה |
| הכנס 1x FACS תמיסת ליסה | BD | 349202 | |
| 2.0 מ"ל צינורות SafeLock | Eppendorf | 0030120094 | 2 מ"ל צינור צנטריפוגה |
| 24 בארות | צלחת קורנינג | 3524 | |
| 24 בארות Transwell הכנס | קורנינג | 3470 | |
| 3% חומצה אצטית עם מתילן כחול | STEMCELL Technologies | 07060 | |
| 3,3',5-triiodo-l-thyronine | Sigma | T-074 | |
| 37% תמיסת פורמלדהיד עם 15% מתנול כמייצב ב-H2O | סיגמא | 533998 | |
| 5810R צנטריפוגה | אפנדורף | 5811000320 | |
| 5 מ"ל פוליפרופילן צינורות (צינורות זרימה) | BD | 352058 | |
| 70 ומיקרו; מסננת תאים | m קורנינג | ||
| A-4-62 רוטור | Eppendorf | 5810709008 | |
| Accutase | Gibco | A1110501 | מגיב דיסוציאציה של תאים |
| אנטיביוטי-אנטימיקוטי | Gibco | 15240-062 | |
| Avicel CL-611 | FMC Biopolymer | NA | Liquid Overlay |
| Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software | Bio-Rad Laboratories, Inc | 171STND01 | Multiplex Manager תוכנה |
| מחט פרפר 21 גרם | BD | 367287 | |
| כולרה טוקסין | סיגמא | C8052 | |
| קריסטל סגול | Merck | C6158 | |
| תמיסת ציטופיקס/ציטופרם | BD | תמיסת קיבוע וחדירה | |
| 554722 Dispase II | Sigma | D4693 | פרוטאז ניטרלי |
| DMEM/גלוקוז גבוה | GE Healthcare מדעי החיים | SH30243.01 | |
| תערובת DMEM/תזונה F-12 | Gibco-Invitrogen | 11320033 | |
| dNTP Mix | Promega | U1515 | dNTP Mix |
| EMEM (w L-Glutamine) | ATCC | 30-2003 | |
| EVOM מכשיר וולטוממטר | WPI, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב | 300523 | |
| FACS Lysing Solution | BD | 349202 | 1x תמיסת ליזינג |
| פלקון שפופרת 15 מ"ל | CellStar | 188271 | 15 מ"ל שפופרת |
| פלקון 50 מ"ל | CellStar | 227261 | 50 מ"ל צינור |
| התחלה מהירה בדיקות DNA חיוניות מאסטר | רוש | 6402682001 | qPCR מאסטר מיקס |
| Ficoll Paque מכשירי | מחקר | 17544203 | צפיפות שיפוע |
| מדיה H3N2 (A/Aichi/2/1968) | ATCC | VR547 | |
| H3N2 M1 רצף פריימר קדימה | סיגמא | 5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'H3N2 | |
| M1 רצף פריימר הפוך | סיגמא | 5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'H3N2 | |
| NS1 רצף פריימר קדימה | סיגמא | 5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'H3N2 | |
| NS1 סיגמא פריימר הפוך | 5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'סרום | ||
| בקר עוברי מומת בחום | Gibco | 10500-064 | |
| hNESPCs | תורמים אנושיים | NA | |
| גורם גדילה אפיתל אנושי | Gibco-Invitrogen | PHG0314 | |
| הידרוקורטיזון | STEMCELL Techonologies | 7925 | נאסף מביופסיות אף במהלך ניתוחי |
| סטיית מחיצהאינסולין | Sigma | I3536 | |
| Lightcycler 96 | Roche | 5815916001 | qPCR מכשיר |
| חי/מת כחול תא כתמים ערכת *לעירור UV | Thermofisher | L23105 | כדאיות כתם |
| MILLIPLEX MAP אנושי ציטוקין/כימוקין מגנטי חרוז פאנל II - Premixed 23 Plex | Merck Pte Ltd | HCP2MAG-62K-PX23 | אימונולוגיה מולטיפלקס מבחן |
| מיטומיצין C | Sigma | M4287 | |
| M-MLV 5x Buffer | Promega | M1705 | RT-PCR 5x Buffer |
| M-MLV Reverse Transcriptase | Promega | M1706 | Reverse Transcriptase |
| N-2 supplement | Gibco-Invitrogen | 17502-048 | |
| NIH/3T3 | ATCC | CRL1658 | |
| מאגר סלסול/שטיפה | BD | 554723 | פרמביליזציה מאגר שטיפה |
| PneumaCult-ALI 10x תוסף | TECHONOLOGIES של תאי גזע | 5001 | |
| פנאומהCult-ALI | טכונולוגיות תאי גזע | 5001 | |
| תוסף תחזוקה של פנאומהCult-ALI (פי 100) | טכונולוגיות של תאי גזע | 5001 | |
| פריימרים אקראיים | Promega | C1181 | פריימרים אקראיים |
| מעכב רנזין רנאז רקומביננטי | Promega | N2511 | RNase מעכב |
| RNA מאגר ליזה | Qiagen | חלק מ-52904 | |
| RPMI 1640 (עם L-גלוטמין) | ATCC | 30-2001 | |
| STX2 אלקטרודות | WPI, סרסוטה, פלורידה, ארה"ב | STX2 | אלקטרודה |
| T25 בקבוק | קורנינג | 430639 | |
| T75 בקבוק | קורנינג | 430641U | |
| TPCK Trypsin | Sigma | T1426 | |
| Trypan Blue | Hyclone | SV30084.01 | |
| ערכת מיצוי RNA ויראלי | Qiagen | 52904 | ערכת מיצוי RNA ויראלי |
| בצורת V 96 בארות צלחת | קורנינג | 3894 |
מקורות
- Monto, A. S. Vaccines and antiviral drugs in pandemic preparedness. Emerging Infectious Diseases. 12 (1), 55-60 (2006).
- Lightfoot, N., Rweyemamu, M., Heymann, D. L. Preparing for the next pandemic. The British Medical Journal. 346, 364(2013).
- Gerdil, C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
