הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV

3.2K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62137

⸱

21 בינואר 2021

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להקים מודל עכברוש חדש של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי (EcoHIV), שהוא קריטי לשיפור ההבנה שלנו של מאגרים נגיפיים HIV-1 במוח ומציע מערכת לחקור הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות ל- HIV ותחלואה נלווית (כלומר, שימוש בסמים).

תקציר

נחקר היטב כי מודל העכבר הנגוע EcoHIV הוא בעל תועלת משמעותית בחקירת סיבוכים נוירולוגיים הקשורים ל- HIV. הקמת מודל עכברוש נגוע EcoHIV למחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות, יהיה מועיל במחקר של neuroHIV ו- HIV-1 הקשורים הפרעות נוירוקוגניטיביות (HAND). במחקר הנוכחי, אנו מדגימים את היצירה המוצלחת של מודל חולדה של זיהום HIV פעיל באמצעות HIV כימרי (EcoHIV). ראשית, המבנה lentiviral של EcoHIV נארז בתאי FT 293 תרבותיים במשך 48 שעות. לאחר מכן, המדיום המותנה היה מרוכז וטריטר. לאחר מכן, ביצענו זריקות סטראוטקסיות דו-צדדיות של EcoHIV-EGFP לתוך רקמת מוח עכברוש F344/N. שבוע לאחר ההדבקה, אותות פלואורסצנטיים EGFP זוהו ברקמת המוח הנגועה, המציין כי EcoHIV בהצלחה גורם לזיהום HIV פעיל בחולדות. בנוסף, בוצעה חיסון עבור סמן התא המיקרוגליאלי, Iba1. התוצאות הצביעו על כך שמיקרוגליה היו סוג התא השולט ב-EcoHIV. יתר על כן, חולדות EcoHIV הציגו שינויים בעיבוד הטמפורלי, מנגנון נוירו-התנהגותי פוטנציאלי של HAND, כמו גם תפקוד סינפטי שמונה שבועות לאחר ההדבקה. באופן קולקטיבי, המחקר הנוכחי מרחיב את מודל EcoHIV של הידבקות ב- HIV-1 לחולדה המציעה מערכת ביולוגית בעלת ערך לחקר מאגרים נגיפיים HIV-1 במוח, כמו גם HAND ותחלואה נלווית כגון שימוש בסמים.

מבוא

מערכות ביולוגיות שיפרו את ההבנה שלנו של הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות HIV-1 (HAND) ואת המנגנונים העצביים הבסיסיים שלהם2. קביעת איזו מערכת ביולוגית מתאימה ביותר לכל מחקר נתון תלויה לעתים קרובות בשאלת הריבית2. המגבלה של מגוון המודלים המארחים של בעלי חיים מאתגרת מחקרים על התפתחות מחלת HIV-1. כדי לחקור HIV-1 שכפול ויראלי פתוגנזה, אשלג ואח'3 יצר מודל העכבר של זיהום פעיל HIV-1, החלפת אזור הקידוד של גליקופרוטאין מעטפת משטח HIV, gp120, עם gp80 MLV ecotropic, אשר הוביל שכפול ויראלי מוצלח בעכברים4. לאחר זריקות וריד הזנב בעכברים HIV כימרי (EcoHIV), מאפיינים רבים נצפו דומים לאלה של אנשים seropositive HIV-1 (למשל, לימפוציטים נגועים מקרופאגים, ממוקד לתגובות חיסוניות אנטי ויראליות, ודלקת3,5,6).

למרות עכברים וחולדות הם שניהם חברים של Muridae, הבדלים מינים בסיסיים עשויים להשפיע על התאמתם לשאלות ניסיוניות ספציפיות7. לכן, ההרחבה של מודל זיהום EcoHIV לחולדות (נפוץ במחקרים של שימוש בסמים והפרעות נוירוקוגניטיביות) יהיה יתרון במחקר של neuroHIV. לדוגמה, גודלם הגדול יותר הופך את השתלת הקטטר הצווארי להליכי ניהול עצמי של תרופות למעשית יותר8. טכניקות ניהול עצמי סמים בחולדות נוצלו כדי להעריך את המוטיבציה ב-HIV-1 9. יתר על כן, משימות נוירוקוגניטיביות / התנהגותיות רבות תוכננו בתחילה עבור חולדות10. כאן, אנו מדווחים על ניצול של זריקות סטראוטקסיות של EcoHIV בחולדות כדי להרחיב את מודל הזיהום EcoHIV ולאפשר הזדמנות מפתח כדי לענות על שאלות חדשות הקשורות neuroHIV ו HAND.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים באוניברסיטת דרום קרוליינה (מספר הבטחה פדרלית: D16-00028). שישה זכר בוגר F344 / N חולדה שוכנה בסביבה מבוקרת תחת אור 12/12: מחזור כהה עם גישה libitum המודעה למזון ומים. כל בעלי החיים טופלו באמצעות הנחיות שנקבעו על ידי המכונים הלאומיים לבריאות במדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. אריזת וירוסים בתאי FT 293

  1. תרבות 293 תאי FT (5×105/ מ"ל) בג'לטין מצופה 75 ס"מ2 בקבוקים עם DMEM בתוספת 10% FBS11. לגדל תאים ב 37 °C (69 °F) להיות 50% קונדיטוריה ב transfection.
  2. לדלל 22.5 μL של מגיב transfection (למשל, Lipofectamine 3000) ב 750 μL של בינוני (למשל, Opti-MEM) בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 mL ומערבולת עבור 3 s.
  3. לדלל 20 מיקרוגרם של EcoHIV פלסמיד DNA ב 750 μL של מדיום בצינור מיקרו צנטריפוגה 1.5 מ"ל ומערבבים היטב.
  4. מוסיפים דנ"א מדולל לצינור של מגיב טרנס-פקציה מדולל ומערבבים בעדינות. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
  5. מוסיפים את התערובת ל-10 מ"ל של מדיום DMEM שנחמר מראש בבקבוק 75 ס"מ2. דגירה תאים במשך 2 ימים ב 37 °C (69 °F).
  6. קציר ולשלב 24 מ"ל של מדיום מותנה משני בקבוקונים הכוללים lentivirus ארוז.
  7. צנטריפוגה כל 24 מ"ל של בינוני מותנה ב 500 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. להעביר את supernatant הבהיר לצינור סטרילי 50 מ"ל.
  8. שלב 8 מ"ל של רכז Lenti-x עם 24 מ"ל של על-טבעי מובהק (יחס של 1:3). מערבבים על ידי היפוך עדין. תערובת דגירה ב 4 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
  9. תערובת צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 45 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בזהירות להסיר את supernatant.
  10. בעדינות להשעות את גלולה עם 100 μL של 100 מ"מ PBS.
  11. ריכוז וירוס טיטר עם ערכת אליזה p24.

2. ניתוחים סטראוטקסיים של וירוס EcoHIV-EGFP

  1. הרדמה חולדות באמצעות 3% sevoflurane. המשך לשלב 2.2 כאשר החולדות אינן מגיבות לגירויים רעילים ורפלקסים נעדרים.
  2. גילחו את השערות מאזור המוח ועקרו את העור פעמיים עם 70% אתנול וקרצוף על בסיס כלורקסידין. אבטח את החולדה בעמדה מועדת במנגנון הסטריאוטאקסי.
  3. בצע חתך (5-6 ס"מ) דרך העור לאורך קו האמצע הקרקפת.
  4. סמן שתי עמדות קידוח ב 0.8 מ"מ לרוחב, 1.2 מ"מ rostral כדי bregma. לקדוח חור (קוטר 0.4 מ"מ) בכל מיקום גולגולת.
  5. מלא פתרון לנטיוירוס EcoHIV (1.04 × 106 TU / mL) במזרק הזרקת 10 μL. אבטחו את המזרק למנגנון הסטריאוטאקסי.
  6. הזז במורד המחט קרוב לפני השטח של חור קידוח. למדוד ולהזיז 2.5 מ"מ לעומק.
  7. להחדיר 1 μL של פתרון וירוס בקצב של 0.2 μL / min. שמור את המחט בתוך אזור ההזרקה במשך 5 דקות. תזיז לאט את המחט עד שהיא מחוץ לגולגולת החולדה.
  8. לתפור את העור עם חוט משי 4-0.
  9. לעקר את החתך עם 70% אתנול פעם אחת. תת עורית להזריק butorphenol (דורולקס, 0.1 מ"ג / קילוגרם משקל גוף).
  10. מעבירים את החולדה לתא התאוששות עם כרית חימום עד שהיא מתעוררת.

3. הדמיה של חלקי מוח

הערה: המתן שבוע עד שמונה שבועות לאחר עירוי ויראלי EcoHIV.

  1. הרדמה החולדה עם 5% sevoflurane. המשך לשלב 3.2 כאשר החולדות אינן מגיבות לגירויים רעילים ורפלקסים נעדרים.
  2. תקן את החולדה בתנוחת על-חוש בתוך מכסה המנוע של אדים.
  3. להסית את העור לאורך קו האמצע של בית החזה. חותכים את הסרעפת ופותחים את חלל בית החזה.
  4. הכנס מחט 20 G × 25 מ"מ לתוך החדר השמאלי.
  5. מיד לפתוח את האטריום הנכון עם מספריים.
  6. לעיין 50 מ"ל של PBS מראש 100 מ"מ בקצב של 5 מ"ל / דקה.
  7. לחלחל 100 מ"ל של קר 4% paraformaldehyde בקצב של 5 מ"ל / דקה.
  8. לערוף את ראש החולדה, לפתוח את הקרקפת ולהסיר את המוח.
  9. פוסטפיקס לילה עם 4% פארפורמלדהיד.
  10. להעביר את המוח 40 מ"ל של 30% סוכרוז ב 100 מ"מ PBS בצינור 50 מ"ל עד המוח צף למטה (כ 3 ימים).
  11. הצמד להקפיא את המוח במתילבוטנול במשך 2 דקות ב - 80 מעלות צלזיוס.
  12. לאבטח את רקמת המוח על פלטפורמת מתכת בתוך -20 מעלות צלזיוס cryostat.
  13. חותכים 50 מיקרומטר עבה חלקי coronal באמצעות cryostat.
  14. מעבירים את פרוסות המוח לשקופיות זכוכית בעזרת מברשת עדינה.
  15. הר קטעים ב 0.3 מ"ל של בינוני נגד פשתן לכסות עם 22 מ"מ 50 מ"מ coverlips.
  16. שמור את מגלשות הזכוכית בחושך בטמפרטורת החדר עד לייבוש.
  17. תמונה נוירונים ממוקדים עם מיקרוסקופ confocal באמצעות מחסנית Z מבוסס על גבולות אזור המוח ומאפיינים מורפולוגיים של נוירונים.
    הערה: הגדרות המיקרוסקופ הקונפוקל בהן נעשה שימוש היו: הגדלה של 60 X (A/1.4, שמן), ומרווח מישור Z של 0.15 מיקרומטר (גודל חור סיכה 30 מיקרומטר; רדיוס חור סיכה מוקרן לאחור 167 ננומטר) באמצעות אורך גל של 488 ננומטר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

המדיום מותנה נאסף מ lentivirus של EcoHIV-EGFP נגוע 293FT תאים. לאחר מכן, הוא היה מרוכז ו titered, אז מוזרק באופן סטריאוטקסי לתוך המוח (אזור קליפת המוח) של חולדות F344/N. שבעה ימים לאחר ההזרקה, חולדות הוקרבו ותמונות נלקחו מפרוסות מוח קורונל החל bregma 5.64 מ"מ כדי bregma -4.68 מ"מ. באיור 1A, ישנם אותות EcoHIV-EGFP משמעותיים בכל המוח, במיוחד בקליפת המוח ובג'ירואים משומנים בהיפוקמפוס. יתר על כן, שתי תיוג עם Iba1and EcoHIV-EGFP בדיקות סיפק ראיות חזקות כי microglia היו סוג התא השולט מחסה ביטוי Ec...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

בפרוטוקול זה, הקמנו מודל זיהום איידס הנגרמת על ידי EcoHIV בחולדות. באופן ספציפי, תיארנו הזרקה סטראוטקסית דו-צדדית של EcoHIV לתוך קליפת המוח אשר בהצלחה גרמה לזיהום HIV פעיל במוח החולדה 7 ימים לאחר הזרקה. פית'מור, אנו מראים כי זיהום EcoHIV בחולדות יכול להיות מערכת ביולוגית טובה ללמוד היבטים מרכזיים של HAND. שמונה שבועות לאחר זיהום EcoHIV, חולדות הפגינו ליקויים נוירוקוגניטיביים משמעותיים, שכללו את השינויים בעיבוד זמני ותפקוד סינפטי ב- MSNs של NAc. בהתחשב בחשיבותם של מודלים של בעלי חיים לחקר neuroHIV ו HAND...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

לאף אחד מהכותבים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו מומנה על ידי NIH מענקי HD043680, MH106392, DA013137, ו NS100624.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תאי 293FTThermoFisher ScientificR70007
תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתיתCellgro30004CI100X
Corning BioCoatGelatin 75 ס"מ² בקבוק תרבית תאי צוואר מלבני עם כובע מאווררLife Technologies354488
Corning DMEM עם L-גלוטמין, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ונתרן פירובטLife Technologies10013CV
כיסוי זכוכיתVWR637-137
מקדחה
Dumont #5 מלקחייםWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 ForcepsWorld Precision Instruments14097
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock TubesLife Technologies22600028
Ethicon Vicryl Plus אנטיבקטריאלי, 4-0 פוליגלקטין 910 תפר, 27 אינץ'. FS-2Med Vet InternationalVCP422H
מזרק המילטוןהמילטון1701
Invitrogen Lipofectamine 3000 TransfectionReagent Life TechnologiesL3000015
Iris ForcepsWorld Precision Instruments15914
Iris ScissorsWorld Precision Instruments500216
ערכת p24 ELISA הקשורה ל-LentivirusCell Biolabs, inc.VPK-107-5
Lenti-X רכזTakaraPT4421-2
Opti-MEM I סרום מופחתטכנולוגיות חיים בינוניות11058021
ParaformaldehydeSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldehydeSigmaP6148
ProLong GoldFisher ScientificP36930
SevofluraneMerritt אספקה וטרינרית347075
מכשיר סטריאוטקסיKopf מכשיריםדגם 900
SuperFrost Plus שקופיותפישר סיינטיפיק12-550-154%
Vannas מספרייםמכשירי דיוק עולמיים500086

מקורות

  1. Illenberger, J. M., et al. HIV Infection and Neurocognitive Disorders in the Context of Chronic Drug Abuse: Evidence for Divergent Findings Dependent upon Prior Drug History. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 15 (4), 715-728 (2020).
  2. Joseph, S. B., Swanstrom, R. The evolution of HIV-1 entry phenotypes as a guide to changing target cells. Journal of Leukocyte Biology. 103 (3), 421-431 (2018).
  3. Potash, M. J., et al. A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (10), 3760-3765 (2005).
  4. Albritton, L. M., Tseng, L., Scadden, D., Cunningham, J. M. A putative murine ecotropic retrovirus receptor gene encodes a multiple membrane-spanning protein and confers susceptibility to virus infection. Cell. 57, 659-666 (1989).
  5. Geraghty, P., Hadas, E., Kim, B. H., Dabo, A. J., Volsky, D. J., Foronjy, R. HIV infection model of chronic obstructive pulmonary disease in mice. American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 312 (4), 500-509 (2017).
  6. Gu, C. J., et al. EcoHIV infection of mice establishes latent viral reservoirs in T cells and active viral reservoirs in macrophages that are sufficient for induction of neurocognitive impairment. PLoS Pathogens. 14 (6), 1007061(2018).
  7. Ellenbroek, B., Youn, J. Rodent models in neuroscience research: is it a rat race. Disease Models, Mechanisms. 9 (10), 1079-1087 (2016).
  8. Feduccia, A. A., Duvauchelle, C. L. Novel apparatus and method for drug reinforcement. Journal of Visualized Experiments. (42), e1998(2010).
  9. Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Harrod, S. B., Moran, L. M., Booze, R. M. HIV-1 proteins dysregulate motivational processes and dopamine circuitry. Scientific Reports. 8 (1), 7869(2018).
  10. McGaughy, J., Sarter, M. Behavioral vigilance in rats: task validation and effects of age, amphetamine, and benzodiazepine receptor ligands. Psychopharmacology. 117 (3), Berl. 340-357 (1995).
  11. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), (2016).
  12. McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era. Scientific Reports. 9 (1), 827(2019).
  13. McLaurin, K. A., Moran, L. M., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. The Power of Interstimulus Interval for the Assessment of Temporal Processing in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (146), e58659(2019).
  14. Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture. Journal of Visualized Experiments. (158), (2020).
  15. Ko, A., et al. Macrophages but not Astrocytes Harbor HIV DNA in the Brains of HIV-1-Infected Aviremic Individuals on Suppressive Antiretroviral Therapy. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 14 (1), 110-119 (2019).
  16. Sopper, S., et al. The effect of simian immunodeficiency virus infection in vitro and in vivo on the cytokine production of isolated microglia and peripheral macrophages from rhesus monkey. Virology. 220 (2), 320-329 (1996).
  17. Llewellyn, G. N., Alvarez-Carbonell, D., Chateau, M., Karn, J., Cannon, P. M. HIV-1 infection of microglial cells in a reconstituted humanized mouse model and identification of compounds that selectively reverse HIV latency. Journal of NeuroVirology. 24 (2), 192-203 (2018).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מודל חולדה של EcoHIVזיהום HIV במוחהזרקה סטריאוטקסיסטיתהפרעות נוירו-קוגניטיביותזיהום מיקרוגליאליעיבוד זמנימורפולוגיה של קוצי דנדריטיםמיקרוסקופיה קונפוקליתאריזה לנטיויריליתמאגרי נגיף HIV
מודל עכברוש של זיהום מוחי EcoHIV
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.