אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תנועת שן אורתודונטית בעכברים ושיטות להדמיה תלת מימדית של סיבי הקולגן וכלי הדם של רצועה חניכיים ללא חתך.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אנו מציגים פרוטוקול ליצירת תנועת שן אורתודונטית בעכברים ושיטות להדמיה תלת מימדית של סיבי הקולגן וכלי הדם של רצועה חניכיים ללא חתך.
תנועת שן אורתודונטית היא תהליך ביולוגי מורכב של שינוי שיפוץ רקמות רכות וקשות כתוצאה מכוחות חיצוניים. על מנת להבין את תהליכי השיפוץ המורכבים הללו, חיוני לחקור את רקמות השן והתקופה בהקשר התלת מימדי שלהם ולכן למזער כל ניתוק וחפצי רקמות. מודלים של עכברים מנוצלים לעתים קרובות בביולוגיה התפתחותית ומבנית, כמו גם בביומכניקה בשל גודלם הקטן, קצב חילוף החומרים הגבוה, גנטיקה וקלות הטיפול. בעיקרון זה גם עושה אותם מודלים מצוינים עבור מחקרים הקשורים לרפואת שיניים. עם זאת, מכשול גדול הוא גודל השן הקטן שלהם, הטוחנות בפרט. נייר זה נועד לספק פרוטוקול צעד אחר צעד ליצירת תנועת שן אורתודונטית ושתי שיטות להדמיה תלת-ממדית של הרכיב הסיבי של רצועה חניכיים של טוחנת גברים של עכבר. השיטה הראשונה שהוצגה מבוססת על מערך מיקרו-CT המאפשר הדמיה של שיפור פאזה של רקמות קולגן טריות. השיטה השנייה היא שיטת ניקוי עצמות המשתמשת באתיל קינמט המאפשרת הדמיה דרך העצם ללא חתך ושומרת על פלואורסצנטיות אנדוגנית. שילוב שיטת סליקה זו עם עכברי כתב כמו Flk1-Cre; TdTomato סיפק הזדמנות ראשונה מסוגה לדמיין את כלי הדם 3D ב PDL ועצם מכתשית.
התהליך הביולוגי הבסיסי בתנועת השן האורתודונטית (OTM) הוא שיפוץ עצם. הטריגר לתהליך שיפוץ זה מיוחס לשינויים במבנה הרצועה התקופתית (PDL) כגון מטריצה חוץ-תאית (ECM), נמק, כמו גם הרס כלידםוהיווצרות 1,2,3. גורמים אפשריים אחרים לשיפוץ עצם מכתוש קשורים לחישת כוח על ידי אוסטאוציטים בעצם, כמו גם עיוות מכני של עצם מכתוש עצמו; עם זאת תפקידם ב- OTM עדיין אינו ברור לחלוטין4,5.
למרות מחקרים רבים שמטרתם לחשוף יחסי מבנה-פונקציה של PDL במהלך OTM, מנגנון תפקודי ברור עדיין לא הוגדר6,7. הסיבה העיקרית לכך היא האתגר באחזור נתונים של רקמה רכה (PDL) הממוקמת בין שתי רקמות קשות (מלט ועצם מכתשית). השיטות המקובלות לאיסוף מידע מבני מחייבות בדרך כלל קיבעון ומקטעים המשבשים ומשנים את מבנה ה- PDL. יתר על כן, רוב השיטות הללו מניבות נתונים דו-מימדיים שגם אם אינם מעוותים, נותנים מידע חלקי ומקומי בלבד. מכיוון שה- PDL אינו אחיד במבנה ובתפקודו, יש צורך בגישה המטפלת במבנה תלת-ממדי שלם של כל קומפלקס עצם השיניים-PDL.
מאמר זה יתאר שיטה ליצירת OTM בעכברים ושתי שיטות המאפשרות הדמיה תלת-ממדית של סיבי הקולגן ב- PDL ללא כל מקטע של המדגם.
מודלים מורין נמצאים בשימוש נרחב עבור ניסויים in-vivo ברפואה, ביולוגיה התפתחותית, אספקת תרופות ומחקרים מבניים. הם יכולים להיות מהונדסים גנטית כדי לחסל או לשפר חלבונים ספציפיים ותפקוד; הם מספקים שליטה התפתחותית מהירה, חוזרת וצפויה; הם גם קלים לדימוי בגלל גודלם הקטן8. למרות היתרונות הרבים שלהם, מודלים עכבר במחקר שיניים אינם משמשים לעתים קרובות, במיוחד כאשר מניפולציות קליניות מוצדקות, בעיקר בשל השיניים בגודל קטן. דגמים של בעליחייםכגון חולדות 9,10,11, כלבים12,13, חזירים14,15,16 וקופים17 משמשים לעתים קרובות יותר מאשר עכברים. עם ההתפתחות האחרונה של טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה, היתרונות של ניצול מודל העכבר כדי לפענח את התהליכים מפותלים OTM הם רבים. נייר זה מציג שיטה ליצירת תנועה mesial של השן הטוחנת בלסת התחתונה עם רמות כוח קבועות המפעילות שיפוץ העצם. רוב הניסויים OTM מכרסמים נעשים maxilla, שכן הניידות של הלסת התחתונה ואת נוכחות הלשון להוסיף רמת מורכבות נוספת. עם זאת, הלסת התחתונה יש יתרונות רבים כאשר שלמות מבנית 3D רצוי. זה יכול להיות מנותח בקלות כמו עצם שלמה; במינים מסוימים ניתן להפריד אותו לשני חמי-לסתות דרך סימפיזיס סיבי; הוא קומפקטי, שטוח ומכיל רק את השיניים ללא כל חללי סינוס. לעומת זאת, המקסילה היא חלק מהגולגולת וקשורה קשר הדוק לאיברים ומבנים אחרים, ולכן יש צורך בניתוח נרחב על מנת לנתח את עצם מכתוש עם השיניים הקשורות.
באמצעות תא לחות בבית יחד עם מערכת טעינה בתוך מיקרו CT ברזולוציה גבוהה המאפשרת שיפור פאזה, פיתחנו שיטה לדמיין רקמות סיביות טריות בתלת מימד כפי שתואר קודם לכן9,18,19,20,21,22,23. רקמות טריות נסרקות מיד לאחר ההקרבה של החיה ללא כל כתמים או קיבעון, אשר מפחית חפצי רקמות, כמו גם שינויים של תכונות ביומכניות. נתונים תלת מימדיים אלה יכולים להיות מנוצלים לניתוחי הפצה וכיוון של הסיבים כמתואר במקומות אחרים19.
שיטת הדמיית הרקמה השלישית כולה השנייה המוצגת כאן מבוססת על ניקוי אופטי של הלסת התחתונה המאפשר הדמיה של סיבי ה- PDL דרך העצם ללא כל חתך. מעניין שזה גם מאפשר הדמיה של סיבי הקולגן של העצם עצמה, אולם זה לא יידונו כאן. באופן כללי, ישנן שתי שיטות לניקוי רקמות. הראשון הוא סליקה מימית שבו המדגם הוא שקוע בתמיסה מימית עם אינדקס שבירה גדול מ 1.4 או באמצעות טבילה פשוטה, hyperhydration או הטמעת הידרוג'ל. עם זאת, שיטה זו מוגבלת ברמת השקיפות, כמו גם בשימור המבני של הרקמה ולכן מחייבת קיבעון של הרקמה. השיטה השנייה אשר מניב דגימות שקופות מאוד ואינו דורש קיבעון היא שיטת סליקה מבוססת ממס24,25. יצרנו שיטת סליקה מבוססת ממס שונה המבוססת על אתיל-3-פנילפרופ-2-אנואט (אתיל קינמאט, ECi) עבור דגימות הלסת התחתונה. לשיטה זו יש את היתרונות של שימוש בחומר ניקוי ברמה של מזון לא רעיל, הצטמקות רקמות מינימלית ושימור חלבונים פלואורסצנטיים.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה והנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת הרווארד (פרוטוקול מס' 01840).
1. תנועת שן אורתודונטית
2. סריקת מיקרו-CT של סיבי PDL בהמי-גמל טרי
3. שיטת סליקה (איור 3)
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
נייר זה מציג שיטה לייצור OTM, כמו גם שתי שיטות להדמיה תלת-ממדית של סיבי קולגן בתוך ה- PDL ללא כל חתך. למטרות מחקר בבעלי חיים, כאשר יישור השיניים אינו הכרחי, תנועת השן נחשבת אורתודונטית אם היא יוצרת שיפוץ של עצם מכתש בכל רמות השורש. נדרשת רמת כוח קבועה המופעלת על השיניים על מנת ליצור OTM אמין. כאן, סליל NiTi מופעל צורה זיכרון משמש כדי ליצור כוח עקבי של 10 גרם לאורך זמן הניסוי של 7 ימים ומעבר אם מוצדק. הפעלת הסליל המתוארת כאן (איור 1) יוצרת מתח בסליל NiTi בתוך השלב המרטנזיטי ומביאה את הסליל למ...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
יצירת OTM בעכברים רצויה מאוד בשל הגודל, הגנטיקה ויתרונות הטיפול. השימוש בלסת התחתונה מספק טיפול קל הן מבחינת ניתוח רקמות והן מבחינת הכנה והדמיה לדוגמה. כאן הצגנו שיטה ליצירת OTM עם תנועה תרגום של השן בתוך העצם בתוך 7 ימים של OTM. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן להאריך את משך הזמן הכולל של תנועת השן, שכן סליל מופעל מספק רמת כוח קבועה לתנועה של עד כ 1 מ"מ. עם זאת, הצד mesial של סליל קבוע החותך, אשר מתפרץ כל הזמן. כתוצאה מכך, וקטורי הכוח ישתנו בהדרגה ויתחילו לייצר כוחות שחול. ניתן להימנע מכך אם מתבצעת התאמה של רמת הקובץ המצורף בק...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין מה לחשוף.
מחקר זה נתמך על ידי NIH (NIDCR R00- DE025053, PI:Naveh). ברצוננו להודות למרכז הרווארד להדמיה ביולוגית על תשתיות ותמיכה. כל הדמויות נוצרות עם biorender.com.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 מ"ל BD Luer-Lok מזרק | BD | 309628 | |
| 1X פוספט חוצץ מלח | VWR מדעי החיים | 0780-10L | |
| 200 הוכחה אתנול | VWR Life Sciences | V1016 | |
| סגסוגת אלומיניום 5019 חוט | סיגמא-אולדריץ' | GF15828813 | חוט בקוטר 0.08 מ"מ, אורך 100, מזג קשה. משמש כקשירה תיל סביב טוחנת. |
| Avizo 9.7 | Thermo Fisher Scientific | N/A | משמש לניתוח סריקות microCT |
| Castroviejo מחזיקי מחטים מיקרו | כלי מדע עדינים | 12060-01 | |
| Clr Plan-Apochromat 20x/1.0, CorrVIS-IR M27 85mm | Zeiss | N/A | משמש להדמיה הרמונית מהדור השני |
| ידית שקע חרוט, קצה יחיד, בצורת יד | G.Hartzell ובנו | 126-CSH3 | ידית של מראה בדיקה |
| EC Plan-Neofluar 5x/0.16 | Zeiss | 440321-9902 | משמש להדמיית גיליון אור |
| Elipar DeepCure-S אור ריפוי LED | 3M ESPE | 76985 | |
| Eppendorf צינורות נעילה בטוחה, 1.5 מ"ל | Eppendorf | 22363204 | |
| אתיל צינמט, > = 98% | סיגמא-אולדריץ' | W243000-1KG-K | |
| מחט היפודרמית, 27G x 1/2 אינץ' | BD | 305109 | |
| Ketathesia 100 מ"ג/מ"ל | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | NDC:11695-0702-1 | |
| מגבי משימות עדינים KIMWIPES | קימברלי-קלארק | 21905-026 (מספר קטלוגי של VWR) | נרכש |
| ממערכת מיקרוסקופ תאורה כפולה VWR LightSheet Z.1 | Zeiss | LightSheet Z.1/LightSheet 7 | משמש להדמיית גיליון אור |
| LSM 880 NLO רב פוטון מיקרוסקופ | Zeiss | LSM 880 NLO | משמש להדמיה דו-פוטונית |
| MEGAmicro, מישור, קוטר 5 מ"מ, SS-Thread | Hahnenkratt | 6220 | MicroCT מראה מראה משטח קדמי |
| , MicroXCT-200 | Xradia | MICRO XCT-200 | |
| Mini-Colibri | Fine Science Tools | 17000-01 | |
| PermaFlo Flowable Composite | Ultradent | 948 | |
| פלטפורמת נוהל | N/A | N/A | מיוצר בהתאמה אישית מחומרי מעבדה |
| מיקרוסקופ סטריאו שגרתי M80 | Leica Micosystems | M80 | |
| Sentalloy NiTi קפיץ סליל פתוח | TOMY Inc. | סליל NiTi סגור בקוטר 0.15 מ"מ בקוטר סליל פנימי של 0.9 מ"מ מספק כוח של 10 גרם. ניתן לרכוש מוצרים דומים מ- Dentsply Sirona. | |
| חוט קשירה מנירוסטה T-304, קוטר 0.009 אינץ' | יישור שיניים | SBLW109 בקוטר | 0.009 אינץ' (0.23 מ"מ), מזג רך |
| X-Ject E (קסילזין) 100 מ"ג/מ"ל | הנרי שיין בריאות בעלי חיים | NDC: 11695-7085-1 | |
| Z100 משקם, גוון A2 | 3M ESPE | 5904A2 |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.