כאן אנו מציגים כיצד לחשוף את גנגליון geniculate של עכבר מעבדה חי, מרדים וכיצד להשתמש הדמיית סידן כדי למדוד את התגובות של הרכבים של נוירונים אלה לטעום גירויים, המאפשר ניסויים מרובים עם ממריצים שונים. זה מאפשר השוואות מעמיקות של אילו נוירונים מגיבים לאו תיוהמים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם
במאמר זה
סיכום
תקציר
בעשר השנים האחרונות, ההתקדמות במדדי סידן (GECIs) המקודדים גנטית קידמה מהפכה בהדמיה תפקודית של vivo. באמצעות סידן כבא כוח לפעילות עצבית, טכניקות אלה מספקות דרך לפקח על התגובות של תאים בודדים בתוך הרכבים עצביים גדולים למגוון גירויים בזמן אמת. אנחנו, ואחרים, יישמנו טכניקות אלה כדי לדמיין את התגובות של נוירונים גנגליון geniculate בודדים לטעום גירויים להחיל על הלשונות של עכברים מרדים חיים. הגנגליון הגנולט מורכב מגופי התא של נוירונים גוסטטוריים המחדירים את הלשון והחך העורפיים, כמו גם כמה נוירונים סומטוסנסוריים המחדירים את הפינה של האוזן. הדמיית התגובות מעוררות הטעם של נוירוני גנגליון geniculate בודדים עם GCaMP סיפק מידע חשוב על פרופילי כוונון של נוירונים אלה בעכברים מסוג בר, כמו גם דרך לזהות פנוטיפים טעם היקפי miswiing בעכברים מניפולציה גנטית. כאן אנו מדגימים את ההליך הכירורגי כדי לחשוף את גנגליון geniculate, רכישת תמונה פלואורסצנטית GCaMP, צעדים ראשוניים לניתוח נתונים, ופתרון בעיות. טכניקה זו יכולה לשמש עם GCaMP מקודד מהונדס, או עם ביטוי GCaMP בתיווך AAV, וניתן לשנות אותה לתמונה תת-קבוצות גנטיות מסוימות של עניין (כלומר, ביטוי GCaMP בתיווך Cre). בסך הכל, בהדמיית סידן ויו של נוירוני גנגליון geniculate היא טכניקה רבת עוצמה לניטור הפעילות של נוירונים גוסטטוריים היקפיים ומספקת מידע משלים להקלטות מסורתיות יותר של chorda tympani עצב שלם או טעם התנהגות ישבן.
מבוא
מרכיב מרכזי במערכת הטעם ההיקפית של היונקים הוא גנגליון geniculate. בנוסף לכמה נוירונים סומטוסנסוריים המ innervate את הפינה של האוזן, geniculate מורכב מגופי התא של נוירונים gustatory innervating הלשון והחך הצפוניים. בדומה לנוירונים חושיים היקפיים אחרים, נוירוני הגנגליון הגנולטים הם פסאודו-חד קוטביים עם אקסון ארוך המקרין באופן היקפי לבלוטות הטעם, ובמרכז לגרעין גזע המוח של מערכת הבודדת1. נוירונים אלה מופעלים בעיקר על ידי שחרור של ATP על ידי תאי קולטן טעם המגיבים לגירויים טעם בחלל הפה2,3. ATP הוא נוירוטרנסמיטר חיוני עבור איתות טעם, קולטני P2rx לידי ביטוי על ידי נוירונים גנגליון gustatory נח....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקולים של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדות הטיפול והשימוש בבעלי חיים המוסדיים של אוניברסיטת טקסס סן אנטוניו.
1. התקנה טרום ניתוחית
הערה: שים לב כי ההתקנה הראשונית של הציוד אינה מטופלת כאן, שכן היא תשתנה בהתאם למערכת המשאבה, המיקרוסקופ, המצלמה ותוכנת ההדמיה שבה נעשה שימוש. לקבלת הוראות התקנה, עיין בחומרי הדרכה המסופקים על-ידי ספק הציוד. עבור ציוד המשמש את המחברים, עיין בטבלת החומרים.
- ודא נוזל זורם דרך כל הרכב (מים) וקווים טעימים. אם הקו חסום, התנתק ושטוף במים. אם הקו הוא סטיה, לעסות עד נוזל זורם. ודא שהנוזל מתחיל ונעצר לפי סימן.
- לאחר כל הקווים מאושרים ללא חסימה, להפעיל ר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הפרוטוקול, חיה מהונדסת Snap25-GCaMP6s היה מסומם, גרעינים geniculate נחשפו, ו tastant הוחל על הלשון בזמן וידאו הוקלט. מטרת הניסוי הייתה להגדיר אילו תיחומות עוררו תגובות מכל תא. תמציתים (30 מ"מ AceK, 5 mM כינין, 60 mM NaCl, 50 mM IMP + 1 mM MPG, 50 מ"מ חומצת לימון)18 היו מומסים במי DI והוחלו על הלשון עבור 2 s מופרדים על ידי 13 s של מים DI.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עבודה זו מתארת פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לחשוף בניתוח את גנגליון geniculate ולתעד חזותית את הפעילות של הנוירונים שלה עם GCaMP6s. הליך זה דומה מאוד לזה שתואר קודם לכן17, עם כמה יוצאים מן הכלל בולטים. ראשית, השימוש בתנוחת ראש מאפשר התאמה קלה של מיצוב הראש במהלך הניתוח. שנית, לגבי משלוח גירוי, הגישה על ידי וו ו Dvoryanchikov זורם גירויים טעם דרך צינורות הוושט17, ואילו פרוטוקול זה מספק נוזל ישירות לתוך הפה עם מחט מחלק. כל שיטה יכולה לשמש כדי לעורר בהצלחה תגובות נוירון גנגליון ge.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגוד אינטרסים לדווח.
תודות
המחברים מודים לס. הומאיון על גידול העכברים. מימון עבור עבודה זו ניתן בחלקו על ידי בוגר הקונסורציום לבריאות המוח של UTSA ומענק זרע פוסט-דוקטורט (B.E.F.) ו- NIH-SC2-GM130411 ל- L.J.M.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 1 x #5 מלקחיים Inox | Fine Science Tools | NC9792102 | |
| מזרק 1 מ"ל עם מנעול luer | פישר סיינטיפיק | 14-823-30 | |
| 2 x #3 מלקחיים Inox | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| 27 מד קהה מחלק מחט | פישר מדעי | NC1372532 | |
| 3M Vetbond | Fisher Scientific | NC0398332 | |
| 4-40 מכונה בורג אגוזי משושה | מהדקים | 3SNMS004C | |
| 4-40 בורג כובע ראש שקע | מהדק | 3SSCS04C004 | |
| נקודות סופגות | פישר סיינטיפיק | 50-930-668 | |
| Acesulfame K | Fisher Scientific | A149025G | |
| דמעות מלאכותיות | Akorn | 59399-162-35 | |
| מגשי אלרגיסט BD עם מחט מחוברת לצמיתות | פישר מדעי | 14-829-6D | |
| מחזירים קהים | FST | 18200-09 | |
| לוח לחם | Thor Labs | MB8 | |
| חומצת לימון | פישר מדעי | A95-3 | |
| Cohan-Vannas מספריים אביב | כלים מדעיים עדינים | 15000-02 | |
| נוזל אורתו-סילון עכשווי | לאנג | 1504 | |
| אבקת אורתו-סילון עכשווית | Lang | 1520 | |
| אפליקטורים עם קצה כותנה | פישר | 19-062-616 | |
| מחזיק עמוד ראש מותאם אישית | eMachineShop | ראה קובץ מצורף 202410.ems | |
| מותאם אישית ראש מתכת פוסט | eMachineShop | ראה קובץ מצורף 202406.ems | |
| בקר טמפרטורת DC | FHC | מצלמה דיגיטלית 40-90-8D | |
| , sCMOS OrcaFlash4 מיקרוסקופ רכוב | Hamamatsu | C13440 | |
| היקף חתך | Leica | M80 | |
| קוצץ שיער | קנט סיינטיפיק | CL7300-Kit | |
| IMP | פישר AAJ6195906 | ||
| מדעי קטמין קטאבד | NDC 50989-996-06 | ||
| אור קר LED מקור | Leica Mcrosystems | KL300LED | |
| Luer Lock מתאמי צינורות 1/16 אינץ' | פישר | 01-000-116 | |
| מיקרוסקופ | אולימפוס | BX51WI | |
| מיני סדרה עמודים אופטיים | Thorlabs | MS2R | |
| MPG | פישר סיינטיפיק | AAA1723230 | |
| MXC-2.5 בדיקה מסתובבת מהדק | Siskiyou | 14030000E | |
| NaCl | Fisher Scientific | 50-947-346 | |
| צלחות פטרי | פישר סיינטיפיק | FB0875713A | |
| אוויר בלחץ | Airgas | AI Z300 | |
| כינין | פישר AC163720050 | ||
| הדבקה עצמית סרט תיוג | פישר סיינטיפיק | 159015R | |
| צינורות שסתום צביטה סיליקון 1/32 אינץ' x 1/16 אינץ' OD (לכל רגל) | אוטומציה מדעית | 05-14 | |
| Sola SM מנוע אור | Lumencor | ||
| Snap25-2A-GCaMP6s-D | JAX | 025111 | |
| מספריים עדינים לסטודנטים | כלי מדע עדינים | 91460-11 | |
| בדיקה כירורגית | Roboz חנות כירורגית | RS-6067 | |
| כירורגית מחזיק בדיקה | Roboz חנות כירורגית | RS-6061 | |
| חוט | Gü termann | 02776 | |
| BD צינורות תוך-רפואיים | פישר סיינטיפיק | 22-046941 | |
| ווסת גז דו-שלבי | Airgas | Y12FM244B580-AG | |
| צינורות ויניל Tygon - 1/16 אינץ' | Automate Scientific | 05-11 | |
| Valvelink8.2 בקר דיגיטלי/ידני | Automate Scientific | 01-18 | |
| Valvelink8.2 שסתום צביטה מערכת זלוף | אוטומציה מדעית | 17-pp-54 | |
| קסילזין | Anased | NADA# 139-236 |
מקורות
- Krimm, R. F. Factors that regulate embryonic gustatory development. BMC Neuroscience. 8, Suppl 3 4(2007).
- Taruno, A., Matsumoto, I., Ma, Z., Marambaud, P., Foskett, J. K. How do taste cells lacking synapses mediate neurotransmission? CALHM1, a voltage-gated ATP....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
