מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

Summary

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים וליפוזומים כדי לקבוע אם חלבון מחלץ ומעביר פוספטידילסרין או פוספטידילינוזיטול 4-פוספט במבחנה.

Abstract

לאחרונה נמצאו מספר חברים במשפחת החלבון המחייב אוקסיסטרול (OSBP) (ORP)/OSBP(Osh) המייצגים קבוצת חלבון העברת שומנים חדשני (LTP) בשמרים ובתאים אנושיים. הם מעבירים פוספטידילסרין (PS) מן reticulum אנדופלסמי (ER) לקרום הפלזמה (PM) באמצעות PS / פוספטידילינוזיטול 4-פוספט (PI(4)P) מחזורי חילופי. ממצא זה מאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו נ.ב., שהוא קריטי לתהליכי איתות, מופץ ברחבי התא וחקירת הקשר בין תהליך זה לבין חילוף החומרים של פוספינוסיטיד (PIP). הפיתוח של פרוטוקולים חדשים המבוססים על פלואורסצנטיות סייע בגילוי ואפיון של מנגנון תאי חדש זה במבחנה ברמה המולקולרית. מאמר זה מתאר את הייצור והשימוש בשני חיישני שומנים מתויגים פלואורסצנטית, NBD-C2_Lact ו- NBD-PH_FAPP, כדי למדוד את היכולת של חלבון לחלץ PS או PI(4)P ולהעביר שומנים אלה בין ממברנות מלאכותיות. ראשית, הפרוטוקול מתאר כיצד לייצר, לתייג ולקבל דגימות טוהר גבוה של שני מבנים אלה. שנית, מאמר זה מסביר כיצד להשתמש בחיישנים אלה עם קורא מיקרו-לוח פלואורסצנטי כדי לקבוע אם חלבון יכול לחלץ PS או PI(4)P ליפוזומים, באמצעות Osh6p כמקרה מבחן. לבסוף, פרוטוקול זה מראה כיצד למדוד במדויק את הקינטיקה של PS / PI(4)P להחליף בין ליפוזומים של הרכב שומנים מוגדרים כדי לקבוע את שיעורי העברת השומנים על ידי העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET) באמצעות פלואורומטר סטנדרטי.

Introduction

ההתפלגות המדויקת של שומנים בין ממברנות שונות ובתוך הממברנות של תאים אאוקריוטים^1,2 יש השלכות ביולוגיות עמוקות. פענוח האופן שבו תפקוד LTPs הוא נושא חשוב בביולוגיה של התא^3,4,5,6, וגישות במבחנה הן בעלות ערך רב בטיפול בבעיה זו^7,8,9,10,11. כאן, אין ויטרו, אסטרטגיה מבוססת פלואורסצנטיות מוצגת כי כבר אינסטרומנטלי לקבוע כי כמה חלבוני ORP / Osh להשפיע PS / PI(4)P חילופי בין קרום התא¹² ובכך מהווים סוג חדש של LTPs. PS הוא גליצריופוספוליפיד אניוני המייצג 2-10% מכלל שומנים ממברנה בתאים אוקריוטים^13,14,16. הוא מופץ לאורך שיפוע בין חדר המיון לבין ראש הממשלה, שם הוא מייצג 5-7% ועד 30% של גליצריופוספוליפידים, בהתאמה^17,18,19. יתר על כן, נ.ב. מרוכז בעצם בעלון הציטוטוסולי של ראש הממשלה. הצטברות זו והמחיצה הלא אחידה של PS בראש הממשלה הם קריטיים לתהליכי איתות סלולריים¹⁹. בשל המטען השלילי של מולקולות נ.ב. העלון הציטוסולי של ראש הממשלה הוא הרבה יותר אניוני מאשר העלון הציטוטוסולי של אברונים אחרים^1,2,19,20. זה מאפשר גיוס, באמצעות כוחות אלקטרוסטטיים, של חלבוני איתות כגון מצע C-kinase עשיר מאלנין myristoylated (MARCKS)²¹, סרקומה (Src)²², קירסטן-חולדת סרקומה ויראלי אונקוגן (K-Ras)²³, וראס הקשורים C3 botulinum רעלן מצע 1 (Rac1)²⁴ המכילים רצועה של חומצות אמינו טעונות חיובית וזנב שומניד.

נ.ב. מוכר גם על ידי חלבון קונבנציונאלי קינאז C באופן סטריאו-סלקטיבי באמצעות תחום C2²⁵. עם זאת, נ.ב. מסונתז ב- ER²⁶, המציין כי יש לייצא אותו לראש הממשלה לפני שיוכל למלא את תפקידו. לא היה ידוע כיצד זה הושג¹⁹ עד הממצא כי, בשמרים, Osh6p ו Osh7p להעביר PS מן המיון ל PM²⁷. LTPs אלה שייכים למשפחה שמורה אבולוציונית באאוקריוטים שחבר המייסד שלהם הוא OSBP ומכיל חלבונים (ORPs בחלבוני אדם, Osh בשמרים) המשלבים תחום הקשור ל- OSBP (ORD) עם כיס לארח מולקולת שומנים. Osh6p ו Osh7p מורכבים רק מ- ORD שתכונותיו המבניות מותאמות לאגד במיוחד את נ.ב. ולהעביר אותו בין הממברנות. עם זאת, לא היה ברור כיצד חלבונים אלה העבירו את נ.ב. ממיון לראש הממשלה. Osh6p ו Osh7p יכול ללכוד PI(4)P כמו ליגנד שומנים^{חלופי 12}. בשמרים, PI(4)P מסונתז מפוספטידילינוזיטול (PI) בגולגי ובראש הממשלה על ידי PI 4-kinases, Pik1p ו- Stt4p, בהתאמה. לעומת זאת, אין PI(4)P בקרום המיון, כמו שומנים זה הוא hydrolyzed PI על ידי פוספטאז Sac1p. לפיכך, מעבר צבע PI(4)P קיים הן בממשקי ER /Golgi והן בממשקי ER/PM. Osh6p ו- Osh7p מעבירים PS מחדר המיון לראש הממשלה באמצעות מחזורי חילופי PS/PI(4)P באמצעות מעבר צבע PI(4)P שקיים בין שתי הממברנות הללו¹².

בתוך מחזור אחד, Osh6p מחלץ PS מחדר המיון, מחליף PS עבור PI(4)P בראש הממשלה ומעביר PI(4)P בחזרה לחדר המיון כדי לחלץ מולקולת PS אחרת. Osh6p/Osh7p מתקשרים עם Ist2p²⁸, אחד החלבונים הבודדים שמחברים ומביאים את קרום המיון ואת ראש הממשלה לקרבה זה לזה כדי ליצור אתרי קשר ER-PM בשמרים^29,30,31. בנוסף, הקשר של Osh6p עם ממברנות טעונות שליליות הופך חלש ברגע שהחלבון מחלץ את אחד מהליגנדים השומנים שלו עקב שינוי קונפורמציה שמשנה את התכונות האלקטרוסטטוריות שלו³². זה מסייע Osh6p על ידי קיצור זמן התעכבות הממברנה שלה, ובכך לשמור על היעילות של פעילות העברת השומנים שלה. בשילוב עם האיגוד ל- Ist2p, מנגנון זה יכול לאפשר Osh6p/7p לבצע במהירות ובדייקות חילופי שומנים בממשק ER / PM. בתאים אנושיים, חלבוני ORP5 ו- ORP8 מבצעים חילופי PS/ PI(4)P באתרי מגע ER-PM באמצעות מנגנונים ברורים³³. יש להם ORD מרכזי, בדומה Osh6p, אבל הם מעוגנים ישירות לחדר המיון באמצעות קטע transmembrane מסוף C³³ לעגון לתוך ראש הממשלה באמצעות N-מסוף פלקסטרין הומוולוגיה (PH) תחום המזהה PI(4)P ו PI(4,5)P₂^33,34,35. ORP5/8 משתמש ב- PI(4)P כדי להעביר נ.ב., והוכח כי ORP5/8 מווסת בנוסף את רמות PM PI(4,5)P₂ וככל הנראה מווסת נתיבי איתות. בתורו, ירידה ברמות PI(4)P ו- PI(4,5)P₂ מורידה את פעילות ORP5/ORP8 מכיוון שחלבונים אלה מקשרים את ראש הממשלה בצורה תלוית PIP. סינתזת PS גבוהה באופן חריג, המובילה לתסמונת לנץ-מג'בסקי, משפיעה על רמות PI(4)P באמצעות ORP5/8³⁶. כאשר הפעילות של שני החלבונים נחסמת, נ.ב. הופך פחות שופע בראש הממשלה, מה שמוריד את היכולת האונקוגנית של חלבוני איתות³⁷.

לעומת זאת, ביטוי יתר ORP5 נראה לקדם פלישה לתאים סרטניים ותהליכים גרורתיים³⁸. לכן, שינויים בפעילות ORP5/8 יכולים לשנות באופן חמור את ההתנהגות התאית באמצעות שינויים בהומאוסטזיס השומנים. יתר על כן, ORP5 ו- ORP8 תופסים אתרי קשר עם ER-mitochondria ושומרים על כמה פונקציות מיטוכונדריאליות, אולי על ידי אספקת PS³⁹. בנוסף, ORP5 לוקליזציה לאתרי קשר טיפת שומנים ER כדי לספק PS טיפות שומנים על ידי PS / PI(4)P exchange⁴⁰. האסטרטגיה המתוארת בזאת למדידת (i) PS ו- PI(4)P מיצוי ליפוזומים ו- (ii) טרנספורט PS ו- PI(4)P בין ליפוזומים הומצאה כדי להקים ולנתח את פעילות החליפין PS/PI(4)P של Osh6p/Osh7p^12,32 ומשמשת קבוצות אחרות לניתוח הפעילות של ORP5/ORP8³⁵ ו- LTPs אחרים^{10, 41.} הוא מבוסס על השימוש בקורא לוחות פלואורסצנטי, ספקטרופלואורומטר סטנדרטי בפורמט L, ושני חיישנים פלואורסצנטיים, NBD-C2_Lact ו- NBD-PH_FAPP, שיכולים לזהות PS ו- PI(4)P, בהתאמה.

NBD-C2_לקט מתאים לתחום C2 של הגליקופרוטאין, לקטדרין, שהופצה מחדש כדי לכלול ציסטאין ייחודי חשוף ממס ליד אתר כריכת נ.ב. המשוער; פלואורופור NBD רגיש לקטבים (7-ניטרבנז-2-אוקסה-1,3-דיאזול) מקושר באופן קוולנטי לשאריות אלה(איור 1A)^12. ליתר דיוק, תחום C2 של לקטדהרין (Bos taurus, UniProt: Q95114, שאריות 270-427) שוכפל לווקטור pGEX-4T3 שבא לידי ביטוי בהיתוך עם גלוטתיון S-transferase (GST) ב Escherichia coli. רצף_{ה-C2 לקט} עבר מוטציה כדי להחליף שני שאריות ציסטאין נגישות לממס (C270, C427) בשאריות אלנין ולהכניס שאריות ציסטאין לאזור הסמוך לאתר כריכת PS הפואטי (מוטציה H352C) שניתן לתייג לאחר מכן עם N,N'-דימתיל-N-(iodoacetyl)-N'-(7-ניטרובנץ-2-אוקסה-1,3-דיאזול-4-yl) אתילן דיאמין (IANBD) ¹². אתר מחשוף עבור תרומבין קיים בין חלבון GST ואת N-terminus של תחום C2. יתרון מרכזי הוא כי דומיין זה מזהה באופן סלקטיבי PS באופן Ca^{2 +}- עצמאי בניגוד לתחומים ידועים אחרים C2 או Annexin A5⁴². NBD-PH_FAPP נגזר מתחום PH של חלבון 4-פוספט-מתאם אנושי 1 (FAPP1), אשר היה מהוהה מחדש כדי לכלול ציסטאין אחד חשוף ממס שניתן לתייג עם קבוצת NBD ליד PI(4)P איגוד אתר(איור 1A)^43. רצף הנוקלאוטידים של תחום ה- PH של חלבון FAPP האנושי (UniProt: Q9HB20, פלח שוק [1-100]) שוכפל לווקטור pGEX-4T3 שבא לידי ביטוי בד בבד עם תג GST. רצף_FAPP PH שונה כדי להכניס שאריות ציסטאין ייחודי בתוך ממשק מחייב הממברנה של חלבון⁴³. יתר על כן, מקשר תשע שאריות הוכנס בין אתר מחשוף תרומבין לבין N-terminus של דומיין PH כדי להבטיח נגישות לפרוטאז.

כדי למדוד מיצוי PS מליפוזומים, NBD-C2_לקט מעורבב עם ליפוזומים עשוי פוספטידילכולין (PC) המכיל כמויות זעירות של PS. בשל זיקתו ל- PS, מבנה זה נקשר לליפוזומים, והפלואורופור של NBD חווה שינוי בקוטביות כשהוא בא במגע עם הסביבה ההידרופובית של הממברנה, אשר מעוררת שינוי כחול ועלייה בפלואורסצנטיות. אם נ.ב. מופק כמעט לחלוטין על ידי כמות סטויצ'יומטרית של LTP, הבדיקה אינה מקשרת עם ליפוזומים, ואות NBD נמוך יותר (איור 1B)³². הבדל זה באות משמש כדי לקבוע אם LTP(למשל, Osh6p) מחלץ PS. אסטרטגיה דומה משמשת עם NBD-PH_FAPP למדידת PI(4)P חילוץ (איור 1B), כפי שתואר בעבר^12,32. שתי מבחניות מבוססות FRET תוכננו (i) למדוד הובלת PS מ- L_A ל- L_B ליפוזומים, המחקים את קרום המיון ואת ראש הממשלה, בהתאמה, ו- (ii) תחבורה PI(4)P בכיוון ההפוך. בדיקות אלה מבוצעות באותם תנאים (כלומר, אותו חיץ, טמפרטורה וריכוז שומנים) כדי למדוד חילופי PS / PI(4)P. כדי למדוד הובלת PS, NBD-C2_לקט מעורבב עם ליפוזומים L_A המורכבים ממחשב אישי ומסומם עם 5 מול% PS ו -2 מול% של פוספטידילטנולמין פלואורסצנטי (Rhod-PE) ו L_B ליפוזומים המשלבים 5 מול% PI(4)P.

בזמן אפס, FRET עם רוד-PE מרווה את פלואורסצנטיות NBD. אםנ.ב מועבר מ- L_A ל- L_B ליפוזומים ( למשל, עם הזרקת Osh6p), מתרחשת דהייה מהירה עקב טרנסלוקציה של מולקולות_Lact NBD-C2 מ- L_A ל- L_B ליפוזומים (איור 1C). בהתחשב בכמות ה- PS הנגיש, NBD-C2_Lact נשאר למעשה במצב של קרום קשור במהלך הניסוי¹². לכן, עוצמת האות NBD בקורלציה ישירה עם ההתפלגות של NBD-C2_Lact בין L_A ו L_B ליפוזומים וניתן לנרמל בקלות כדי לקבוע כמה נ.ב. מועבר. כדי למדוד את ההעברה של PI(4)P בכיוון ההפוך, NBD-PH_FAPP מעורבב עם ליפוזומים L_A ו- L_B; בהתחשב בכך שהוא נקשר רק ליפוזומים L_B המכילים PI(4)P, אבל לא Rhod-PE, הפלואורסצנטיות שלה גבוהה. אם PI(4)P מועבר לליפוזומים מסוג L_A, הוא מעביר את ה- ליפוזומים אלה, והאות פוחת עקב FRET עם Rhod-PE (איור 1C). האות מנורמל כדי לקבוע כמה PI(4)P מועבר⁴³.

Protocol

1. טיהור_הלק NBD-C2

הערה: למרות פרוטוקול זה מפרט את השימוש של משבש תא לשבור חיידקים, זה יכול להיות שונה להשתמש באסטרטגיות תמזה אחרות (למשל, עיתונות צרפתית). בתחילת הטיהור, חובה להשתמש חוצץ כי הוא טרי degassed, מסונן, בתוספת 2 mM dithiothreitol (DTT) כדי למנוע חמצון של ציסטאין. עם זאת, עבור שלב תיוג החלבון, זה חיוני כדי להסיר לחלוטין DTT. צעדים רבים חייבים להתבצע על קרח או בחדר קר כדי למנוע כל השפלת חלבון. דגימות של נפח 30 μL יש לאסוף בשלבים שונים של הפרוטוקול כדי לבצע ניתוח על ידי נתרן dodecylsulfate-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) באמצעות ג'ל אקרילאמיד 15% כדי לבדוק את התקדמות הטיהור. מערבבים מספיק חיץ מדגם לאמלי עם כל aliquot, ומחממים את התערובת ב 95 °C (70 °F). להקפיא ולאחסן את הצינורות ב -20 °C (50 °F) עד ניתוח.

1. ביטוי של_Lact GST-C2 ב Escherichia coli
   1. לערבב 20 μL של BL21 זהב תאים מוסמכים עם 18 μL של מים מעוקרים. לאחר מכן, לערבב 2 μL של pGEX-C2_Lact plasmid (ב ~ 65 ng / μL) עם החיידקים, ולהפוך אותם על ידי אלקטרופורציה. Resuspend החיידקים עם 150 μL של לנוקס ליסוגניה-מרק אוטומטי (LB) בינוני (10 גרם / L טריפטון, 5 גרם / L תמצית שמרים, 5 גרם / L NaCl במים deionized, ללא גלוקוז). תן לחיידקים לגדול ב 37 °C (55 °F) במשך 1 שעות בצינור microcentrifuge 2 מ"ל.
   2. לחסן 25 מ"ל של בינוני LB, בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצ'ין, עם 150 μL של השעיה חיידקית בבקבוק ארלנמייר סטרילי 125 מ"ל. מניחים את הבקבוקון בשייקר מסלולית ב 37 °C (7 °F), ולתת לחיידקים לגדול בן לילה עם עצבנות ב 185 סל"ד.
   3. מלא שני צלוחיות סטריליות 2 L Erlenmeyer עם 500 מ"ל של בינוני LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל אמפיסילין, ולהוסיף 5 מ"ל של השעיה preculture. תן לחיידקים לגדול ב 37 °C עם עצבנות ב 220 סל"ד.
   4. מדי פעם למדוד את הצפיפות האופטית (OD) של ההשעיה באורך גל (λ) של 600 ננומטר. כאשר OD מגיע לערך של ~ 0.6-0.7, הוסף 500 μL של פתרון מניות של 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לכל בקבוקון כדי ליזום את הביטוי של_LactGST-C2 . לנער את הבקבוקונים ב 185 סל"ד במשך 4 שעות ב 37 °C (50 °F).
   5. מעבירים את תכולת כל בקבוקון לבקבוק צנטריפוגה פוליפרופילן. צנטריפוגה שני הבקבוקים במשך 30 דקות ב 4600 × גרם ב 4 °C (50 °F) כדי כדורי החיידקים. השליכו את הסופר-נט, ושיספו מחדש כל גלולה ב-50 מ"ל של תמיסת מלח קרה עם פוספט.
   6. העבר את ההשעיה החיידקית הכלולה בכל בקבוק לצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל. צנטריפוגה שני הצינורות במשך 30 דקות ב 2300 × גרם ב 4 °C (55°F). הסר את supernatant, ולאחסן את הצינורות, שכל אחד מהם מכיל גלולה חיידקית, ב -20 °C (70 °F).
2. טיהור C2_לקט
   1. על קרח, מלא שני צינורות צנטריפוגליים חרוטיים 50 מ"ל עם 50 מ"ל של חוצץ המכיל 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, ו 150 mM NaCl (להלן נקרא חיץ TN), בעבר מסונן ו degassed על ידי סינון ואקום ממברנה.
   2. כדי להכין את חיץ התמוגה בכל צינור, להמיס טבליה של אתילנדיאמין טטראצטית ללא חומצה מעכב פרוטאז קוקטייל במאגר TN על ידי sonication קל או מערבולת. הוסף אנטי-פרוטאזים אחרים (10 μM bestatin, 1 מיקרוגרם / מ"ל פפסטטין A, ו 10 μM phosphoramidon). חשוב לציין, להשלים את המאגר עם 2 mM DTT.
   3. מלא את שני הצינורות המכילים את כדורי החיידקים שהוכנו בשלב 1.1.6, עם חוצץ תמיס כדי להשיג נפח סופי של 30 מ"ל בכל צינור, לאט להפשיר את הכדורים על קרח במשך 10 דקות. לרסק כל גלולה עם מרית נירוסטה, ו resuspend אותם על ידי מערבולת הצינורות ו / או על ידי pipetting המתלה הלוך ושוב עם בקר פיפטה 25 מ"ל pipette עד השעיה הומוגני מתקבל.
   4. בצע תמוז באמצעות משבש תא מכובס מראש (ראה טבלת החומרים) על-ידי טעינת 30 מ"ל של המדגם בתוך המאגר והפעלת מחזור שבירה במצב רציף עם לחץ של 1.6 בר. לאסוף את lysate באותו צינור, לשמור את הצינור על קרח, ומיד להוסיף 250 μL מפתרון מלאי של 200 mM פנילמתילסולפוניל פלואוריד (PMSF) מוכן איזופרופנול.
   5. התבדח על המדגם האחר לאחר אותו הליך. השתמש בשאר מאגר תמיסת הלטף כדי לשטוף את משבש התא, ולאסוף את הכביסה כדי לכוונן את עוצמת הקול של כל ליסאט (~ 30 מ"ל) לנפח סופי של 50 מ"ל.
   6. להשלים כל ליסאט עם 5 מ"מ MgCl_2,ולהוסיף 20 מיקרוגרם / מ"ל של DNAse I כדי לפצל את ה- DNA ובכך להפחית את הצמיגות של המדגם. דגירה על קרח במשך 30 דקות. לאסוף מדגם לניתוח ג'ל.
   7. מעבירים כל 50 מ"ל ליסייט לצינור אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט (שניים בסך הכל, ראו את טבלת החומרים). צנטריפוגה ב 186,000 × g ב 4 °C (50 °F) לפחות 1 שעה באמצעות אולטרה צנטריפוגה.
   8. במקביל לשלב הצנטריפוגה, מחלקים 1.4 מ"ל של תרחיף המכיל גלוטתיון בשילוב עם 4% חרוזי אגרוז לשני צינורות צנטריפוגליים חרוטיים 50 מ"ל, הוסיפו 20 מ"ל של חוצץ TN בתוספת 1 mM DTT (חיץ TND) לכל צינור, צנטריפוגה ב 1200 × g למשך 5 דקות, והשליכו את supernatant. חזור על שלב הכביסה הזה פעמיים.
   9. לאחר הצנטריפוגה של ליסאט חיידקי, להסיר דגימה 30 μL מן supernatant, ולהעביר את supernatant מכל צינור ultracentrifuge צינור צנטריפוגה 50 מ"ל המתאים המכיל חרוזים נקיים. לניתוח ג'ל, resuspend גלולה פסולת באחד צינורות ultracentrifuge עם 50 מ"ל של חוצץ TND, ולאסוף מדגם 30 μL.
   10. מניחים את הצינורות על סיבוב במשך 3-4 שעות ב 4 °C (4 °F) כדי לקבל השעיית חרוז הומוגני. בריכה את מתלים החרוזים בעמודה כרומטוגרפית ריקה של 25 מ"ל. תן החרוזים decant, ולהסיר את החץ וחלבונים לא מאוגדים על ידי זרימת הכבידה. קח דגימה מהאלואט לניתוח.
   11. resuspend החרוזים עם 20 מ"ל של חוצץ TND, ולאסוף את eluate על ידי זרימת הכבידה. חזור על שלב זה פעמיים כדי לשטוף לחלוטין את החרוזים. מאגר eluates שנאספו, ולשמור על מדגם 30 μL לניתוח נוסף.
       הערה: לאחר decantation קצר, נפח של ~ 2 מ"ל של השעיית חרוזים, שאליו GST-C2_Lact מצורף, משקעים בתחתית העמודה.
   12. הוסף 1 מ"ל של השעיית חרוזים לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל. מלא כל צינור במאגר TND לנפח סופי של 1.970 מ"ל. קח דגימת 30 μL מצינור אחד לניתוח נוסף (דגימת B1). הוסף 10 μL של פתרון 10 mM CaCl₂ ו 25 μL מפתרון מלאי של פתרון פרוטאז תרומבין אנושי ב 0.02 U / μL.
   13. מניחים את שני הצינורות על סיבוב ב 4 °C בלילה כדי לאפשר תרומבין להיצמד את תג GST מן התחום_Lact C2. למחרת, בכל צינור, לערבב 10 μL של פתרון PMSF 200 mM עם השעיית חרוזים כדי לעכב את פעולת תרומבין.
   14. צנטריפוגות הצינורות ב 700 × g במשך 5 דקות, ולאסוף את supernatant, אשר מכיל מסיס C2_Lact תחום, מכל צינור, מבלי לקחת את החרוזים. איחדו את מזונות העל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל (E1 eluate) שנשמר על קרח.
   15. הוסף 1 מ"ל של חוצץ TND לכל צינור כדי resuspend החרוזים, ולשטוף אותם; חזור על שלב 1.2.14. בצע שלב זה שלוש פעמים נוספות כדי לשחזר כמות מקסימלית של חלבון. בכל פעם, לאסוף את supernatants שנאסף לתוך צינור חדש 2 מ"ל (E2, E3, E4, ו E5 eluates), ולקחת aliquot לניתוח נוסף. בסוף שלבי הכביסה, יש לקחת אליקואט מהשעיית החרוזים (aliquot B2).
   16. לנתח את 30 דגימות μL שנאספו בשלבים השונים של פרוטוקול הטיהור על ידי הפרדת SDS-PAGE על ג'ל אקרילאמיד 15%.
   17. הסר חרוזים מזהמים פוטנציאליים על ידי איגום כל supernatants(כלומר,~ 10 מ"ל) שנאספו במהלך שלבים 1.2.14 ו 1.2.15 לתוך עמוד כרומטוגרפיה 10 מ"ל. לאסוף את eluate על ידי זרימת הכבידה, ולשמור על החרוזים בתחתית העמוד.
   18. מרכז את דגימת_הלק C2 באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית עם חיתוך משקל מולקולרי (MWCO) של 3 kDa ומהירות צנטריפוגה של 2300 × גרם. עצור את הליך הריכוז כאשר נפח דגימת החלבון הוא ~ 1 מ"ל.
3. הכנה וטיהור של NBD-C2_לקט
   1. שידוי עמודת התפלה (ראה טבלת החומרים) באמצעות מאגר TN. טען את העמודה עם 1 מ"ל של דגימת_Lact C2 מרוכזת. אפשר לדגימה להיכנס למיטת הג'ל לחלוטין, הוסף 1.5 מ"ל של חיץ TN טרי ללא גיהוי DTT לעמוד, ולאסוף את eluate על ידי זרימת הכבידה לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל snap-cap.
   2. לדלל 50 μL של eluate בנפח סופי של 300 μL TN חוצץ, ולרשום ספקטרום ספיגה מ 230 ל 450 ננומטר באמצעות מאגר TN טהור ריק. לקבוע את ריכוז_הלק C2 בהתבסס על הספיגה נמדד ב 280 ננומטר, בהתחשב מקדם הכחדה ε שווה 44,920 M^-1.cm^-1.
   3. כדי לתייג את מבנה_{ה-C2 Lact} עם פלואורופור NBD, מערבבים את החלבון עם עודף טוחן פי עשרה של N,N'-דימתיל-N-(iodoacetyl)-N'-(7-ניטרובנץ-2-אוקסה-1,3-דיאזול-4-yl)אתילנדיאמין (IANBD amide).
      1. יש להמיס 1 מ"ג של IANBD בדימתילפורמיד נטול מים (DMF), תוך התחשבות כי הנפח הסופי של DMF המשמש לתיוג מבנה_{ה-C2 Lact} אינו יכול לחרוג מ-5% (v/v) של נפח דגימת החלבון.
      2. כדי לקבוע את הנפח של DMF (V_DMF) כדי להמיס IANBD, תחילה לחשב את הכמות הנדרשת של IANBD (מ ', לידי ביטוי מ"ג) כדי לתייג את החלבון באמצעות פורמולה 1.
         m = 10,000 × C × V × MW_IANBD (1)
         כאשר C הוא הריכוז של_Lact C2 נמדד בשלב 1.3.2, V הוא הנפח של מדגם_Lact C2, ו MW_IANBD הוא המשקל המולקולרי של פלואורופור (420 גרם / מול).
      3. חשב V_DMF באמצעות formulae 2 (עם m₀=1) ו- 3.
         V_DMF= (m₀/m) × V_IANBD (2)
         V_IANBD=0.05 × V (3)
         איפה m₀ היא הכמות של אבקת IANBD מ"ג, V_IANBD הוא הנפח של פתרון IANBD להתווסף מדגם_Lact C2.
      4. הוסף נפח V_IANBD של פתרון IANBD מוכן טרי לדגימת_Lact C2, ולנער את תערובת התגובה ב 800-900 סל"ד במשך 30 דקות ב 25 °C באמצעות thermomixer מוגן מפני אור. תן לתגובה להמשיך במשך 90 דקות על קרח. בינתיים, לנקות יחידת מסנן צנטריפוגלי (MWCO = 3 kDa) עם 10 מ"ל של חוצץ TN.
   4. הוסף L-ציסטאין (בעודף טוחנת פי 10 ל- IANBD) לתערובת התגובה כדי לאיטח IANBD חינם.
   5. הוסף 15 מ"ל של מאגר TN לפתרון_הלק NBD-C2, והעבר את פתרון_ההקט NBD-C2 ליחידת המסנן הצנטריפוגלית. מרכז את המדגם ל 2 מ"ל כדי להפריד את רוב NBD חינם מן החלבון על ידי צנטריפוגה ב 2300 × גרם. חזור על שלב הכביסה פעמיים. צנטריפוגה הדגימה בצינור צנטריפוגה snap-cap 2 מ"ל במשך 10 דקות ב 19,000 × גרם ב 4 °C (55 °F) כדי גלולה אגרגטים פוטנציאליים, ולאסוף את supernatant.
   6. לדלל 50 μL של eluate בנפח הסופי של 300 μL של חוצץ TN. תיעד את ספקטרום הספיגה מ-230 ל-650 ננומטר באמצעות האלאט שנאסף במהלך הליך הריכוז כריקים. קבעו את ריכוז_הלק NBD-C2 באמצעות הספיגה המקסימלית ב- λ = 280 ו 495 ננומטר ומקדם הכחדה ε = 44,920 M^-1.cm^-1 (חלבון) ו 25,000 M^-1.cm^-1 (פלואורופור NBD).
      הערה: אם שני ערכי הריכוז זהים, הדבר מציין כי מבנה_הלק C2 מסומן ביחס של 1:1 עם קבוצת NBD.
   7. אם ריכוז_הלק NBD-C2 המוערך ממדידת ספיגת NBD עולה על הריכוז המוערך מספיגת שאריות טריפטופן (Trp), חזור על שלב 1.3.5 כדי להסיר עוד יותר NBD חינם.
   8. הוסף גלילסול למדגם כדי לקבל ריכוז סופי של 10% (v/v) כדי להגן על מבנה_הלק NBD-C2 במהלך הקפאת הבזק. מדוד את ריכוז החלבון הסופי.
   9. הכן 50 עליקוטים μL של חלבון בצינורות microcentrifuge 0.5 מ"ל. להקפיא את הצינורות בחנקן נוזלי, ולאחסן אותם ב -80 מעלות צלזיוס.

2. טיהור NBD-PH_FAPP

הערה: ההליך לייצר ולתייג_{PH FAPP} זהה לזה של NBD-C2_Lact עד להעברת פתרון NBD-C2_Lact ליחידת מסנן צנטריפוגלית בשלב 1.3.4. מצעד זה ואילך, בצע את הפרוטוקול המתואר להלן.

1. לאחר שלב הריכוז, לשמור על 2 מ"ל של NBD-PH_FAPP ב 4 °C (5 °F) בחושך לא יותר מיום אחד לפני ביצוע כרומטוגרפיה גודל-הדרה. לפני כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל, ודא כי אין הפקדה כתומה (צבירה במהלך הריכוז) בתחתית הצינור. אם זה המקרה, צנטריפוגה הדגימה ב 540,000 גרם × במשך 10 דקות ב 4 °C (5 °F), ולטהר את supernatant על ידי כרומטוגרפיה גודל-הדרה.
   הערה: כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל מבוצעת על עמודה עמוסה בקופולימר דקסטרן-אקרילאמיד מוצלב (ראה טבלת החומרים),ששוקל בעבר עם חיץ TND, באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהירה (ראה טבלת החומרים). יש להגן על העמודה מפני אור. נעשה שימוש בקצב זרימה של 1 מ"ל/דקה, וההתלבטות של מבנה ה-_FAPP NBD-PH לוותה ברישום הספיגה ב- λ = 280 (חלבון) ו- 480 ננומטר (NBD) ביציאת העמודה.
   1. הזרק את דגימת ה-_FAPP NBD-PH שנטענה בלולאת הזרקה של 2 מ"ל על העמודה, ומידאסוף שברי 2.5 מ"ל של אלאט.
2. נתח את כל השברים המתאימים לשיא הראשי שזוהה ב- 280 ו- 480 ננומטר על ג'ל SDS-PAGE של 15%. מערבבים מדגם 25 μL של כל שבר עם 15 μL של חוצץ מדגם Laemmli לפני חימום וטעינה על הג'ל.
   הערה: שיא ראשי, אשר מזוהה בו זמנית ב λ = 280 ו 480 ננומטר, מופיע לאחר נפח של ~ 150 מ"ל מאגר מועבר דרך העמודה.
3. מאגר השברים המכילים באופן בלעדי חלבון NBD-PH_FAPP (~ 12.2 kDa), ולהוסיף גליצל בריכוז סופי של 10% (v/ v). מרכז את המדגם באמצעות יחידת סינון צנטריפוגלית עם MWCO של 3 kDa לנפח סופי של 1 מ"ל באמצעות מהירות צנטריפוגה של 2300 × גרם.
4. הכן עליקוטים, ורשום ספקטרום ספיגה כמתואר עבור_LactNBD-C2 . השתמש מקדם הכחדה ε = 29,450 M^-1.cm^-1 כדי לקבוע את ריכוז החלבון בהתבסס על הספיגה נמדד ב λ = 280 ננומטר.

3. הכנת ליפוזומים עבור נ.ב. ו PI(4)P מיצוי או העברות

הערה: בצעו את כל השלבים בטמפרטורת החדר אלא אם צוין אחרת. יש לטפל בממסים אורגניים, רוטוואפור וחנקן נוזלי בזהירות.

1. הכן חומצה טרייה, מסוננת ומוגזלת 50 mM 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינתאנסולניק (HEPES)-אשלגן הידרוקסיד (KOH), pH 7.4, 120 mM אשלגן אצטט (HK) חוצץ.
2. עבור כל סוג של ליפוזום, לקחת כמויות מדויקות של שומנים שונים מפתרונות מלאי, ולערבב אותם בקבוק זכוכית בצורת אגס 25 מ"ל(טבלה 1). הוסף כלורופורם טהור כדי להתאים את הנפח של כל תערובת ל 1 מ"ל. תייגו כל בקבוקון בשם הליפוזום. עוטפים את הבקבוקונים המכילים תערובת שומנים מסוממים עם Rhod-PE עם רדיד אלומיניום.
3. מניחים את הבקבוקון על מאיד סיבובי. יבש את השומנים תחת ואקום וב 25 °C לפחות 30 דקות במהירות סיבוב של 500 סל"ד. עבור סרטי שומנים המכילים PI(4)P, יש לקדם את הבקבוקון ב-32-34 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, תחת סיבוב עדין, כדי לערבב כראוי PI(4)P עם שומנים אחרים לפני יצירת ואקום בבקבוק כדי להסיר את הממס, אשר ישאיר מאחוריו סרט של שומנים יבשים על קיר הבקבוק.
4. נתק את הבקבוקון מן המאייד, ומניחים אותו בתא ואקום במשך 45 דקות כדי להסיר את כל עקבות הנותרים של ממס. מלא את הבקבוקון עם 2 מ"ל של חוצץ HK, ולהוסיף כמה חרוזי זכוכית בקוטר 4 מ"מ לפתרון. מערבולת בעדינות את הבקבוק במשך 2 דקות כדי resuspend השומנים ולהכין שלפוחיות שומנים multilamellar (MLVs) עם ריכוז שומנים של 4 מ"מ. הכן 0.5 מ"ל aliquots של MLVs ב 1.5 מ"ל בורג מכסה צינורות microcentrifuge.
5. להפשיר להקפיא את הצינורות 5x (באמצעות חנקן נוזלי ואמבט מים ב 37 °C (37 °F), בהתאמה). לתבל את הליפוזומים או לאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס.
6. השתמש מפלט מיני כדי להכין את הליפוזומים(כלומר, שלל חד-צדדי גדול) מן MLVs על פי הנחיות היצרן. השתמש מסנן פוליקרבונט עם נקבוביות גליליות אחידות בקוטר 200 ננומטר.
7. כדי להכין כל סוג של ליפוזום, לפרט לפחות 250 μL של ההשעיה המקבילה של MLVs. לאחסן את ליפוזומים extruded ב 4 °C (75 °F) בחושך אם הם מכילים Rhod-PE. השתמש ליפוזומים בתוך 2 ימים.

		קומפוזיציה שומנים בדם (מול/מול)	השומנים
	שם ליפוזום		DOPC (25 מ"ג/מ"ל)	אבא (10 מ"ג/מ"ל)	16:0 ליס רוד-PE (1 מ"ג/מ"ל)	C16:0/C16:0-PI(4)P (1 מ"ג/מ"ל)
מיצוי תוחם	ליפוזום 2 מול% נ.ב.	מחשב/נ.ב. 98/2	247 μL	12.5 μL
	ליפוזום 2 מול% PI(4)P	PC/PI(4)P 98/2	247 μL			153 μL
	ליפוזום מחשב אישי	מחשב 100	252 μL
עבירות תחבורה	LA	מחשב/נ.ב./רוד-PE 93/5/2	234 μL	31.4 μL	200 μL
	LA ללא נ.ב.	מחשב/רוד-PE 98/2	247 μL		200 μL
	LB	PC/PI(4)P 95/5	237 μL			383 μL
	LB ללא PI(4)P	מחשב 100	252 μL
	LA-Eq	מחשב/נ.ב./PI(4)P/רוד-PE 93/2.5/2.5/2	234 μL	15.7 μL	200 μL	191 μL
	LB-Eq	מחשב/נ.ב./PI(4)P 95/2.5/2.5	239 μL	15.7 μL		191 μL

טבלה 1: כמויות של פתרונות מלאי שומנים להיות מעורב להכנת ליפוזום. קיצורים: נ.ב. = פוספטידילסרין; PC = פוספטידילכולין; PI(4)P = פוספטידילינוזיטול 4-פוספט; רוד-PE = רודמין-תווית פוספטידילטנולמין; DOPC = דיאולאוילפוספטידילכולין; POPS= 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-גליצרי-3-פוספו-L-סרין; 16:0 ליס רוד-PE = 1,2-דיפלמיטויל-סן-גליקרו-3-פוספוטנולמין-N-(ליסאמין רודמין B סולפוניל).

4. מדידת נ.ב. או PI(4)P מיצוי

הערה: יש לבצע מדידות באמצעות צלחת שחורה 96-באר וקורא לוחות פלואורסצנטי המצויד בשחור-כרומטורים: אחד לערעור פלואורסצנטי ואחד לפליטה, עם רוחב פס משתנה.

1. הכן חוצץ HK טרי, מסונן ומנוטר בתוספת 1 מ"מ MgCl₂ (חוצץ HKM). הכן ליפוזומים טהורים PC וליפוזומים PC מסוממים עם 2 מול% PS או 2 מול% PI(4)P (4 mM ריכוז השומנים הסופי, ראה טבלה 1).
   הערה: שמור את הצינורות מלאים בהשעיה של ליפוזומים בולטים בטמפרטורת החדר לאורך כל הניסוי, ולשמור את החלבונים על קרח. בנוסף, להגן על חיישני השומנים מפני אור.
2. לבדיקת החילוץ של נ.ב. בבאר אחת, לערבב ליפוזומים המכילים 2 מול% PS (80 מיקרומטר ריכוז שומנים סופיים, 0.8 מיקרומטר נגיש PS ריכוז) עם NBD-C2_לקט (250 nM ריכוז סופי) בנפח סופי של 100 μL. מלא באר שנייה עם אותה כמות של ליפוזום (80 μM, 2 מול% PS) ו NBD-C2_Lact (250 ננומטר) מעורבב עם 3 μM LTP (Osh6p כמו שליטה חיובית או חלבון של עניין).
   הערה: זמן דגירה של 5 דקות מספיק עבור Osh6p כדי להשיג מיצוי שומנים בדם.
3. מלא באר שלישית עם NBD-C2_לקט (250 ננומטר) מעורבב עם ליפוזומים PC טהור (80 מיקרומטר). מלא באר רביעית רק עם ליפוזומים PC טהור (80 מיקרומטר). חזור על שלבים 4.2-4.3 כדי להכין שלוש סדרות נוספות של ארבע בארות.
4. עבור כל באר, הקלט ספקטרום NBD מ 505 עד 650 ננומטר (רוחב פס 5 ננומטר) על עירור ב 490 ננומטר (רוחב פס 5 ננומטר) ב 25 °C (5 °F). עבור כל סדרה, הפחת את הספקטרום שנרשם רק עם ליפוזומים מהספקטרום האחר.
   הערה: F ו- F_max תואמים את העוצמה ב 536 ננומטר נמדד עם ליפוזומים המכילים PS בנוכחות או היעדר LTP, בהתאמה, בעוד F₀ הוא העוצמה באותו אורך גל עם ליפוזומים PC טהורים. עבור כל סדרה, אחוז ה-PS הנגיש המופק על ידי החלבון ניתן באמצעות הנוסחה הבאה.
   100 × (1-(F-F₀)/(F_{מקסימום}-F₀))) (4)
5. לבדיקת החילוץ PI(4)P, הכינו ליפוזומים מסוממים עם 2 מול% PI(4)P, ובצעו מדידות עם בדיקת_ה-FAPP NBD-PH. בצע ניסויי בקרה וקבע את אחוז החילוץ באותו אופן שתואר לעיל.
   הערה: ריכוז ליפוזום וחלבון זהים לאלה המשמשים בבחאי החילוץ של PS.

5. מדידה בזמן אמת של הובלת נ.ב.

הערה: פלורומטר סטנדרטי (תבנית 90° ) המצויד במחזיק תא מבוקר טמפרטורה ומערבב מגנטי משמש להקלטת קינטיקה להעברת שומנים. כדי להשיג נתונים במדויק, זה המפתח לשמור על המדגם לצמיתות באותה טמפרטורה (להגדיר בין 25 ל 37 °C (37 °F) בהתאם למקור החלבון(למשל.,,שמרים או אדם)) ולערבב אותו כל הזמן. הפרוטוקול המתואר להלן הוא למדידה של הובלת שומנים בדם במדגם 600 μL הכלול בתא קוורץ גלילי.

1. הכן מאגר HKM מסונן ומסונן. שמור את הצינורות המכילים ליפוזומים בולטים בטמפרטורת החדר. עטפו צינורות המכילים ליפוזומים עם Rhod-PE בנייר אלומיניום, ו/או אחסנו אותם בקופסה אטומה כדי למנוע הלבנה.
2. התאם את מונוכרומאטורים עירור ופליטה ב λ = 460 ננומטר (עם רוחב פס קצר (1-3 ננומטר)) וב λ = 530 ננומטר (עם רוחב פס גדול (≥ 10 ננומטר)), בהתאמה. הגדר את זמן הרכישה ב 25 דקות עם רזולוציית זמן ≤ 1 s.
3. בקובט קוורץ, לדלל 30 μL של השעיית L_A ליפוזום ונפח של NBD-C2_Lact פתרון מלאי במאגר HKM מחמם מראש כדי להכין מדגם 570 μL המכיל 200 μM סה"כ שומנים ו 250 nM NBD-C2_Lact. מוסיפים מוט ערבוב מגנטי קטן, וממקמים את הקובט במחזיק הפלואורומטר.
4. לאחר המדגם הוא שפל תרמית (לאחר 3-5 דקות), להפעיל את המדידה. לאחר 1 דקות, להוסיף 30 μL של השעיית ליפוזום L_B (ריכוז סופי של 200 μM ליפידים הכולל) לדגימה. לאחר 3 דקות, להזריק LTP לתוך המדגם, כך הריכוז הסופי של LTP הוא 200 ננומטר, ולרכוש את האות עבור 21 דקות הנותרות.
5. בצע ניסוי מקביל כדי לנרמל את אות NBD. לערבב 30 μL של L_A-Eq ליפוזום מתלה עם 250 nM NBD-C2_Lact במאגר HKM (נפח סופי של 570 μL). לאחר 1 דקות, להזריק 30 μL של השעיית ליפוזום L_B-Eq.
   הערה: הרכב השומנים של ליפוזומים L_A-Eq ו- L_B-Eq דומים לזה של ליפוזומים L_A ו- L_B המשמשים בבדיקת ההעברה, אלא שכל אחד מהם מכיל 2.5 מול% PS ו- 2.5 מול% PI(4)P. כתוצאה מכך, אות NBD הנמדד, המכונה F_Eq, מתאים לאות שיש למדוד אם נ.ב. היה מכויל לחלוטין בין ליפוזומים L_A ו- L_B על ידי תהליך העברה.
6. המר את העקומות הקינטיות הנמדדות עם LTP של עניין כדי לקבוע את כמות PS (ב- μM) שהועברה מ- L_A ל- L_B ליפוזומים לאורך זמן. נרמל כל נקודת נתונים (F) של העקומה באמצעות הנוסחה הבאה.
   F_נורמה = (F-F₀)/(F_Eq-F₀) (5)
   שבו F_{0 מתאים} לאות NBD ממש לפני התוספת של LTP, ו- F_Eq הוא האות הנמדד בשלב 5.5.
   הערה: כמות PS (ב μM) מועבר L_A כדי L_B ליפוזומים מתאים 2.5 × F_נורם, בהתחשב בכך שיווי המשקל מתאים למצב שבו מחצית מולקולות נ.ב. נגיש, הכלול בעלון החיצוני של ליפוזומים L_A, (כלומר,המקביל 5 מול% של 0.5 × 200 μM ליפידים הכולל) הועבר לתוך ליפוזומים L_B.

6. מדידה בזמן אמת של תחבורה PI(4)P

1. הגדר את הפלורימטר (עירור ואורך גל פליטה, רוחב פס, זמן רכישה, רזולוציית זמן) כפי שנעשה עבור תפילת העברת PS. כמו כן, השתמש באותו חוצץ, cuvette, ליפוזומים כדי לבצע את הניסויים תחת ערבוב מתמיד באותה טמפרטורה.
2. ב cuvette, לערבב 30 μL של השעיית ליפוזום L_B ו- NBD-PH_FAPP עם חוצץ HKM מחמם מראש כדי להשיג נפח סופי של 570 μL (200 μM סה"כ שומנים, 250 nM NBD- PH_FAPP). לאחר השתוות תרמית של המדגם הוא הגיע, להתחיל את המדידה, ולאחר 1 דקות, להזריק 30 μL של L_השעיית ליפוזום. לאחר 3 דקות, להזריק את LTP של עניין (ריכוז סופי של 200 ננומטר), ולתעד את האות.
3. בצע ניסוי שני כדי לנרמל את אות NBD. לערבב 30 μL של L_B-Eq ליפוזום השעיה עם 250 nM NBD-PH_FAPP ב 570 μL של חוצץ HKM. לאחר 1 דקות, להזריק 30 μL של L_A-Eq השעיה ליפוזום.
   הערה: כאן, אות NBD, המכונה F_Eq, מתאים לזה שיש למדוד אם PI(4)P היה מכויל לחלוטין בין ליפוזומים L_A ו- L_B.
4. המר את העקומות הקינטיות כדי לקבוע את כמות ה- PI(4)P (ב- μM) המועבר מ- L_B ל- L_A ליפוזומים לאורך זמן. כל נקודת נתונים (F) מנורמלת באמצעות נוסחה 5 שבה F_{0 מתאים} לאות NBD לפני הוספת LTP, ו- F_Eq הוא האות הנמדד בשלב 6.3.
   הערה: כמות PI(4)P (ב- μM) המועברת מ- L_B ל- L_{ליפוזומים} תואמת ל- 2.5 × F_נורם, בהתחשב בכך שיווי המשקל מתאים למצב שבו מחצית מה- PI (4)P הכלול בעלון החיצוני של ליפוזומים L_B (כלומר, 0.5 × 5 μM) הועברה בליפוזומים L_A.

7. ניתוח עקומות קינטיקה

1. לכמת את המידה שבה LTP יעיל על ידי קביעת המהירות שבה LTP זה מעביר שומנים מאוכלוסיית ליפוזום אחת לאחרת בשניות הראשונות לאחר הזרקתו לקובט.
   1. בצע רגרסיה ליניארית של נקודות הנתונים הראשונות של קינטיקה ההעברה כדי להשיג שיפוע. חלק את ערך השיפוע בריכוז LTP בתערובת התגובה כדי לקבוע את מספר מולקולות השומנים המועברות לכל חלבון ליחידת זמן (דקות או ים).

Results

איור 1: תיאור חיישני השומנים הפלואורסצנטיים ובבדיקות במבחנה. (A)דגמים תלת-ממדיים של NBD-C2_Lact ו- NBD-PH_FAPP המבוססים על מבנה הגביש של תחום C2 של לקטדרין בקר (מזהה PDB: 3BN6⁴⁸⁾ומבנה NMR של תחום ה- PH של חלבון FAPP1 האנושי (מזהה PDB: 2KCJ^46). N,N'-דימתיל-<...

Discussion

התוצאות של בדיקות אלה מסתמכות ישירות על האותות של חיישני השומנים הפלואורסצנטיים. לכן, הטיהור של בדיקות אלה שכותרתו ביחס 1:1 עם NBD וללא זיהום פלואורופור NBD חינם הוא צעד קריטי בפרוטוקול זה. כמו כן, חובה לבדוק אם ה- LTP הנבדק מקופל כראוי ולא צבור. כמות ה- LTP שנבדקה בבדיקות החילוץ חייבת להיות שווה או גבוהה מזו של מולקולות PS או PI(4)P נגישות כדי למדוד כראוי אם LTP זה מחלץ ביעילות שומנים אלה. ואכן, NBD-C2_לקט ו- NBD-PH_FAPP נקשרים ל- PS ו- PI(4)P, בהתאמה, בעקבות עקומת כריכת רוויה קלאסית. בהתחשב זיקתם בה...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
L-ציסטאין ו-GE; 97 % (מהשדה)	סיגמא	W326305-100G	הכן תמיסת מלאי L-ציסטאין של 10 מ"מ במים. האליקוטים מאוחסנים ב-20 מעלות;
C 2 מ"ל בקבוקון ענבר, PTFE/Rub Lnr, לאחסון שומנים ב-CHCL3	Wheaton	W224681
חרוזי זכוכית בקוטר 4 מ"מ	Sigma	Z265934-1EA
50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי	Falcon
Ä מטהר KTA	GE healthcare		FPLC
רדיד
Amicon Ultra-15 עם MWCO של 3 ו-10 kDa	Merck	UFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 עם MWCO של 3 ו-10 kDa	Merck	UFC800324, UFC801024
Ampicillin			הכן תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל עם מים מסוננים ומעוקרים ואחסן אותה ב-20 & deg;C.
בסטטין	סיגמא	B8385-10 מ"ג
BL21 תאים מוכשרים זהב	Agilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) ב-CHCl3 (1 מ"ג/מ"ל)	Avanti Polar Lipids	810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P	Echelon Lipids	P-4016-3	ממיסים 1 מ"ג של אבקת C16:0/C16:0-PI(4)P ב-250 ומיקרו; L של MeOH ו-250 ומיקרו; L של CHCl3. לאחר מכן השלם עם CHCl3 עד 1 מ"ל. הפתרון חייב להתבהר.
C16:0/C18:1-PS (POPS) ב-CHCl3 (10 מ"ג/מ"ל)	Avanti Polar Lipids	840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) ב-CHCl3 (25 מ"ג/מ"ל)	Avanti Polar Lipids	850375C-500mg
CaCl2	סיגמא		הכינו תמיסת מלאי CaCl2 10 מ"מ במים.
משבש תאים	דינמיקה
קבועה כלורופורם (CHCl3) RPE-ISO	Carlo Erba	438601
קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTA	Roche	5056489001
נטולי יונים (Milli-Q)
דימתילפורממיד (DMF), נטול מים, >99% טהור
DNAse I רקומביננטי, ללא RNAse, באבקה	Roche	10104159001
DTT	Euromedex	EU0006-B	הכן תמיסת מלאי DTT 1 M במי Milli-Q.  הכן 1 מ"ל אליקוטים ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 °C.
עמודות כרומטוגרפיה אקונו-פאק (1.5 ופעמים; 12 ס"מ).	Biorad	7321010
קובטת אלקטרופורציה 2 מ"מ	Ozyme	EP102
Electroporator Eppendorf 2510	Eppendorf
רוטור זווית קבועה Ti45 ו-Ti45 צינורות	בקמן	מסתובב את הליזטים
מזרקי זכוכית (10, 25 ו-50 ומיקרו; L) לניסוי פלואורסצנטי	המילטון
(25, 100, 250, 500 ו-1000 ומיקרו; L) לטיפול בתמיסות מלאי שומנים	המילטון	1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
גלוטתיון ספרוז 4B חרוזים	GE Healthcare	17-0756-05
גליצרול (99% טהור)	Sigma	G5516-500ML
צינורות המוליזה עם מכסה
HEPES, >99% טהור	Sigma	H3375-500G
Illustra NAP 10 עמוד התפלה	GE healthcare	GE17-0854-02
איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Euromedex	EU0008-B	הכן תמיסת מלאי IPTG של 1 M ב-Milli-Qwater. הכן 1 מ"ל אליקוטים ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 °C.
K-אצטט	Prolabo	26664.293
Lennox LB מדיום מרק ללא גלוקוז			מוכן עם מי מילי Q ועובר חיטוי.
חנקן נוזלי	לינדה
מתנול (MeOH) ≥ 99.8%	VWR	20847.24
MgCl2	Sigma		הכן תמיסה של 2 מ' MgCl2. סנן את התמיסה באמצעות 0.45 & micro; מסנן M.
Microplate 96 Well PS F-Botom שחור לא מחייב	Greiner Bio-one	655900
מיני מכבש עם שני מזרקי המילטון אטומים לגז 1 מ"ל	Avanti Polar Lipids	610023
קורא צלחות פלואורסצנטי מבוסס מונוכרומטור	TECAN	M1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)	בדיקות מולקולריות		ממיסות 25 מ"ג של IANBD ב-2.5 מ"ל של דימתיל-סולפוקסיד (DMSO) ומכינים 25 מנות של 100 ומיקרו; L בצינורות פקק בורג של 1.5 מ"ל. אל תבריג את המכסה לחלוטין. לאחר מכן, הסר DMSO במייבש הקפאה כדי לקבל 1 מ"ג IANBD יבש לכל שפופרת. הצינורות סגורים ומאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; C בחושך.
NaCl	Sigma	S3014-1KG
PBS			137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ NaH<תת>2PO<תת>4, 1.8 מ"מ KH<תת>2PO<תת>4, אוטוקלאב ומאוחסן ב-4&°C.
צלוחיות זכוכית בצורת אגס (25 מ"ל, 14/23, זכוכית דוראן)	דוראן
פפסטאטין	סיגמא	p5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmid			זמין על פי בקשה מהמעבדה שלנו
pGEX-PHFAPP פלסמיד			זמין על פי בקשה מהמעבדה שלנו
פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) ≥ 98.5% (GC)	Sigma	P7626-25g	הכן תמיסת מלאי PMSF של 200 מ"מ במסנני פוליקרבונט איזופרופנול
פוספורמידון	סיגמא	R7385-10 מ"ג
(קוטר 19 מ"מ) בגודל נקבוביות של 0.2 ומיקרו; m	Avanti Polar Lipids	610006
עמודת כרומטוגרפיה Poly-Prep (עם נפח מיטה של 0-2 מ"ל ומאגר של 10 מ"ל)	Biorad	7311550
Prefilters (קוטר 10 מ"מ).	ליפידים קוטביים של Avanti	610014
PyMOL	http://pymol.org/		בניית המודלים התלת-ממדיים של החלבונים (איור 1A)
קובטה קוורץ עבור UV/פלואורסצנטיות גלויה (נפח מינימלי של 600 ומיקרו; L)	Hellma
Quartz cuvettes	Hellma
צנטריפוגה מקוררת  מאייד סיבובי Eppendorf 5427R	Eppendorf
	Buchi	B-100
צינורות מיקרוצנטריגוג עם מכסה בורג (1.5 מ"ל)	Sarsted
מוט ערבוב PFTE מגנטי קטן (5 ופעמים; 2 מ"מ)
צינורות מיקרוצנטריגוג עם מכסה הצמד (0.5, 1 ו-2 מ"ל)	Eppendorf
SYPRO תפוז			כתם פלואורסצנטי לזיהוי חלבון בג'ל SDS-PAGE
Thermomixer	Starlab
THROMBIN, מפלזמה אנושית	Sigma	10602400001	ממיסים 20 יחידות ב-1 מ"ל מים מילי-Q ומכינים 25 ומיקרו; L מכילות בצינורות אפנדורף של 0.5 מ"ל. לאחר מכן מקפיאים ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
Tris, אולטרה טהור	MP	819623
אולטרה-צנטריפוגה L90K	בקמן
ספקטרופוטומטר UV / ספיגה גלויה	SAFAS
UV / ספקטרופלואורומטר גלוי עם מחזיק תא מבוקר טמפרטורה ומכשיר ערבוב	Jasco או Shimadzu	Jasco FP-8300 או Shimadzu RF-5301PC
תא			ואקום
אמבט מים	Julabo
XK 16/70 עמוד עמוס Sephacryl S200HR	GE בריאות