Method Article

מדידות מבוססות פלואורסצנטיות של פוספטידילסרין/פוספטידילינוזיטול 4-חילופי פוספט בין ממברנות

DOI:

10.3791/62177

⸱

March 14th, 2021

 ,  ,  , 
1Université Côte d’Azur, Centre National de la Recherche Scientifique, Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות חיישני שומנים פלואורסצנטיים וליפוזומים כדי לקבוע אם חלבון מחלץ ומעביר פוספטידילסרין או פוספטידילינוזיטול 4-פוספט במבחנה.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לאחרונה נמצאו מספר חברים במשפחת החלבון המחייב אוקסיסטרול (OSBP) (ORP)/OSBP(Osh) המייצגים קבוצת חלבון העברת שומנים חדשני (LTP) בשמרים ובתאים אנושיים. הם מעבירים פוספטידילסרין (PS) מן reticulum אנדופלסמי (ER) לקרום הפלזמה (PM) באמצעות PS / פוספטידילינוזיטול 4-פוספט (PI(4)P) מחזורי חילופי. ממצא זה מאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו נ.ב., שהוא קריטי לתהליכי איתות, מופץ ברחבי התא וחקירת הקשר בין תהליך זה לבין חילוף החומרים של פוספינוסיטיד (PIP). הפיתוח של פרוטוקולים חדשים המבוססים על פלואורסצנטיות סייע בגילוי ואפיון של מנגנון תאי חדש זה במבחנה ברמה המולקולרית. מאמר זה מתאר את הייצור והשימוש בשני חיישני שומנים מתויגים פלואורסצנטית, NBD-C2Lact ו- NBD-PHFAPP, כדי למדוד את היכולת של חלבון לחלץ PS או PI(4)P ולהעביר שומנים אלה בין ממברנות מלאכותיות. ראשית, הפרוטוקול מתאר כיצד לייצר, לתייג ולקבל דגימות טוהר גבוה של שני מבנים אלה. שנית, מאמר זה מסביר כיצד להשתמש בחיישנים אלה עם קורא מיקרו-לוח פלואורסצנטי כדי לקבוע אם חלבון יכול לחלץ PS או PI(4)P ליפוזומים, באמצעות Osh6p כמקרה מבחן. לבסוף, פרוטוקול זה מראה כיצד למדוד במדויק את הקינטיקה של PS / PI(4)P להחליף בין ליפוזומים של הרכב שומנים מוגדרים כדי לקבוע את שיעורי העברת השומנים על ידי העברת אנרגיה תהודה פלואורסצנטית (FRET) באמצעות פלואורומטר סטנדרטי.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ההתפלגות המדויקת של שומנים בין ממברנות שונות ובתוך הממברנות של תאים אאוקריוטים1,2 יש השלכות ביולוגיות עמוקות. פענוח האופן שבו תפקוד LTPs הוא נושא חשוב בביולוגיה של התא3,4,5,6, וגישות במבחנה הן בעלות ערך רב בטיפול בבעיה זו7,8,9,10,11. כאן, אין ויטרו, אסטרטגיה מבוססת פלואורסצנטיות מוצגת כי כבר אינסטרומנטלי ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. טיהורהלק NBD-C2

הערה: למרות פרוטוקול זה מפרט את השימוש של משבש תא לשבור חיידקים, זה יכול להיות שונה להשתמש באסטרטגיות תמזה אחרות (למשל, עיתונות צרפתית). בתחילת הטיהור, חובה להשתמש חוצץ כי הוא טרי degassed, מסונן, בתוספת 2 mM dithiothreitol (DTT) כדי למנוע חמצון של ציסטאין. עם זאת, עבור שלב תיוג החלבון, זה חיוני כדי להסיר לחלוטין DTT. צעדים רבים חייבים להתבצע על קרח או בחדר קר כדי למנוע כל השפלת חלבון. דגימות של נפח 30 μL יש לאסוף בשלבים שונים של הפרוטוקול כדי לבצע ניתוח על ידי נתרן dodecylsulfate-polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) באמצעות ג'ל אקרילאמיד 15% כדי לבדוק את התקדמות הטיהור. מערבבים מספיק חיץ מדגם לאמלי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
איור 1: תיאור חיישני השומנים הפלואורסצנטיים ובבדיקות במבחנה. (A)דגמים תלת-ממדיים של NBD-C2Lact ו- NBD-PHFAPP המבוססים על מבנה הגביש של תחום C2 של לקטדרין בקר (מזהה PDB: 3BN648)ומבנה NMR של תחום ה- PH של חלבון FAPP1 האנושי (מזהה PDB: 2KCJ46). N,N'-דימתיל-<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התוצאות של בדיקות אלה מסתמכות ישירות על האותות של חיישני השומנים הפלואורסצנטיים. לכן, הטיהור של בדיקות אלה שכותרתו ביחס 1:1 עם NBD וללא זיהום פלואורופור NBD חינם הוא צעד קריטי בפרוטוקול זה. כמו כן, חובה לבדוק אם ה- LTP הנבדק מקופל כראוי ולא צבור. כמות ה- LTP שנבדקה בבדיקות החילוץ חייבת להיות שווה או גבוהה מזו של מולקולות PS או PI(4)P נגישות כדי למדוד כראוי אם LTP זה מחלץ ביעילות שומנים אלה. ואכן, NBD-C2לקט ו- NBD-PHFAPP נקשרים ל- PS ו- PI(4)P, בהתאמה, בעקבות עקומת כריכת רוויה קלאסית. בהתחשב זיקתם בה.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר א. קאטריס על הגהתה הקפדנית של כתב היד. עבודה זו ממומנת על ידי מענק ExCHANGE של סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-16-CE13-0006) ועל ידי CNRS.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  L-ציסטאין ו-GE; 97 % (מהשדה) סיגמאW326305-100Gהכן תמיסת מלאי L-ציסטאין של 10 מ"מ במים. האליקוטים מאוחסנים ב-20 מעלות;
C 2 מ"ל בקבוקון ענבר, PTFE/Rub Lnr, לאחסון שומנים ב-CHCL3WheatonW224681
חרוזי זכוכית בקוטר 4 מ"מSigmaZ265934-1EA
50 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטיFalcon
Ä מטהר KTAGE healthcareFPLC
רדיד
Amicon Ultra-15 עם MWCO של 3 ו-10 kDaMerckUFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 עם MWCO של 3 ו-10 kDaMerckUFC800324, UFC801024
Ampicillinהכן תמיסת מלאי של 50 מ"ג/מ"ל עם מים מסוננים ומעוקרים ואחסן אותה ב-20 & deg;C.
בסטטיןסיגמאB8385-10 מ"ג
BL21 תאים מוכשרים זהבAgilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) ב-CHCl3 (1 מ"ג/מ"ל)Avanti Polar Lipids810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P   Echelon LipidsP-4016-3ממיסים 1 מ"ג של אבקת C16:0/C16:0-PI(4)P ב-250 ומיקרו; L של MeOH ו-250 ומיקרו; L של CHCl3. לאחר מכן השלם עם CHCl3 עד 1 מ"ל. הפתרון חייב להתבהר.
C16:0/C18:1-PS (POPS) ב-CHCl3 (10 מ"ג/מ"ל)Avanti Polar Lipids840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) ב-CHCl3 (25 מ"ג/מ"ל)Avanti Polar Lipids850375C-500mg
CaCl2 סיגמאהכינו תמיסת מלאי CaCl2 10 מ"מ במים.
משבש תאיםדינמיקה
קבועה כלורופורם (CHCl3) RPE-ISOCarlo Erba438601
קוקטייל מעכב פרוטאז שלם ללא EDTARoche5056489001
נטולי יונים (Milli-Q)
דימתילפורממיד (DMF), נטול מים, >99% טהור
DNAse I רקומביננטי, ללא RNAse, באבקהRoche10104159001
DTTEuromedexEU0006-Bהכן תמיסת מלאי DTT 1 M במי Milli-Q.  הכן 1 מ"ל אליקוטים ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 °C. 
עמודות כרומטוגרפיה אקונו-פאק (1.5 ופעמים; 12 ס"מ).Biorad7321010
קובטת אלקטרופורציה 2 מ"מOzymeEP102
Electroporator Eppendorf 2510Eppendorf
רוטור זווית קבועה Ti45 ו-Ti45 צינורותבקמןמסתובב את הליזטים
מזרקי זכוכית (10, 25 ו-50 ומיקרו; L) לניסוי פלואורסצנטיהמילטון
(25, 100, 250, 500 ו-1000 ומיקרו; L) לטיפול בתמיסות מלאי שומניםהמילטון1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
גלוטתיון ספרוז 4B חרוזיםGE Healthcare17-0756-05
גליצרול (99% טהור)SigmaG5516-500ML
צינורות המוליזה עם מכסה
HEPES, >99% טהורSigmaH3375-500G
Illustra NAP 10 עמוד התפלהGE healthcareGE17-0854-02
איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) EuromedexEU0008-Bהכן תמיסת מלאי IPTG של 1 M ב-Milli-Qwater. הכן 1 מ"ל אליקוטים ואחסן אותם בטמפרטורה של -20 °C. 
K-אצטטProlabo26664.293
Lennox LB מדיום מרק ללא גלוקוזמוכן עם מי מילי Q ועובר חיטוי.
חנקן נוזלילינדה
מתנול (MeOH) ≥ 99.8%VWR20847.24
MgCl2Sigmaהכן תמיסה של 2 מ' MgCl2. סנן את התמיסה באמצעות 0.45 & micro; מסנן M. 
Microplate 96 Well PS F-Botom שחור לא מחייבGreiner Bio-one655900
מיני מכבש עם שני מזרקי המילטון אטומים לגז 1 מ"לAvanti Polar Lipids610023
קורא צלחות פלואורסצנטי מבוסס מונוכרומטורTECANM1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)בדיקות מולקולריותממיסות 25 מ"ג של IANBD ב-2.5 מ"ל של דימתיל-סולפוקסיד (DMSO) ומכינים 25 מנות של 100 ומיקרו; L בצינורות פקק בורג של 1.5 מ"ל. אל תבריג את המכסה לחלוטין. לאחר מכן, הסר DMSO במייבש הקפאה כדי לקבל 1 מ"ג IANBD יבש לכל שפופרת. הצינורות סגורים ומאוחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; C בחושך.   
NaClSigmaS3014-1KG
PBS137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ NaH<תת>2PO<תת>4, 1.8 מ"מ KH<תת>2PO<תת>4, אוטוקלאב ומאוחסן ב-4&°C.
צלוחיות זכוכית בצורת אגס (25 מ"ל, 14/23, זכוכית דוראן)דוראן
פפסטאטיןסיגמאp5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmidזמין על פי בקשה מהמעבדה שלנו
pGEX-PHFAPP פלסמידזמין על פי בקשה מהמעבדה שלנו
פניל-מתיל-סולפוניל פלואוריד (PMSF) ≥ 98.5% (GC)SigmaP7626-25gהכן תמיסת מלאי PMSF של 200 מ"מ במסנני פוליקרבונט איזופרופנול
פוספורמידוןסיגמאR7385-10 מ"ג
(קוטר 19 מ"מ) בגודל נקבוביות של 0.2 ומיקרו; mAvanti Polar Lipids610006
עמודת כרומטוגרפיה Poly-Prep (עם נפח מיטה של 0-2 מ"ל ומאגר של 10 מ"ל)Biorad7311550
Prefilters (קוטר 10 מ"מ).ליפידים קוטביים של Avanti610014
PyMOLhttp://pymol.org/בניית המודלים התלת-ממדיים של החלבונים (איור 1A)
קובטה קוורץ עבור UV/פלואורסצנטיות גלויה (נפח מינימלי של 600 ומיקרו; L)Hellma
Quartz cuvettesHellma
צנטריפוגה מקוררת  מאייד סיבובי Eppendorf 5427REppendorf
BuchiB-100
צינורות מיקרוצנטריגוג עם מכסה בורג (1.5 מ"ל)Sarsted
מוט ערבוב PFTE מגנטי קטן (5 ופעמים; 2 מ"מ)
צינורות מיקרוצנטריגוג עם מכסה הצמד (0.5, 1 ו-2 מ"ל)Eppendorf
SYPRO תפוזכתם פלואורסצנטי לזיהוי חלבון בג'ל SDS-PAGE
ThermomixerStarlab
THROMBIN, מפלזמה אנושיתSigma10602400001ממיסים 20 יחידות ב-1 מ"ל מים מילי-Q ומכינים 25 ומיקרו; L מכילות בצינורות אפנדורף של 0.5 מ"ל. לאחר מכן מקפיאים ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
Tris, אולטרה טהורMP819623
אולטרה-צנטריפוגה L90Kבקמן
ספקטרופוטומטר UV / ספיגה גלויהSAFAS
UV / ספקטרופלואורומטר גלוי עם מחזיק תא מבוקר טמפרטורה ומכשיר ערבובJasco או ShimadzuJasco FP-8300 או Shimadzu RF-5301PC
תאואקום
אמבט מיםJulabo
XK 16/70 עמוד עמוס Sephacryl S200HRGE בריאות
אלומיניום מים הבטאריאליים מזרקי זכוכית קבוצת

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drin, G. Topological regulation of lipid balance in cells. Annual Review of Biochemistry. 83, 51-77 (2014).
  2. Bigay, J., Antonny, B. Curvature, lipid packing, and electrostatics of membrane organelles: defining cellul....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Phosphatidylserine ExchangePhosphatidylinositol 4 PhosphateLipid Transfer ProteinFluorescence MeasurementsLiposome AssayNBD C2 LactNBD PH FAPPLipid Transfer KineticsFluorescence Resonance Energy TransferOsh6p Protein

Related Articles