כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי להתאים את שיטת הבהירות של רקמות המוח עבור רטינות הר שלם כדי לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ואת המבנים התת תאיים שלהם.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
במאמר זה
סיכום
תקציר
שיטת ההזיה הידרוג'ל רקמה (CLARITY), שפותחה במקור על ידי מעבדת Deisseroth, שונתה בשימוש נרחב עבור immunostaining והדמיה של דגימות מוח עבות. עם זאת, טכנולוגיה מתקדמת זו עדיין לא שימשה עבור רטינות הר שלם. למרות הרשתית היא שקופה חלקית, עובי של כ 200 מיקרומטר (בעכברים) עדיין מגביל את החדירה של נוגדנים לתוך הרקמה העמוקה, כמו גם הפחתת חדירת אור להדמיה ברזולוציה גבוהה. כאן, התאמנו את שיטת הבהירות עבור רשתית עכבר הר שלם על ידי פילמור אותם עם מונומר אקרילאמיד כדי ליצור הידרוג'ל nanoporous ולאחר מכן לנקות אותם נתרן דודקיל סולפט כדי למזער את אובדן החלבון ולמנוע נזק לרקמות. רשתיות מעובדות בהירות היו immunostained עם נוגדנים עבור נוירונים ברשתית, תאי גליה, וחלבונים סינפטיים, רכוב בתמיסת התאמת אינדקס שבירה, ודימוי. הנתונים שלנו מראים כי CLARITY יכול לשפר את האיכות של כתמים אימונוהיסטוכימיים סטנדרטיים והדמיה עבור נוירונים ברשתית ותאי גליה בהכנה לכל ההר. לדוגמה, רזולוציה תלת-ממדית של מבנים דקים דמויי אקסון ודנדריטי של תאי אמקרין דופאמין השתפרה בהרבה על ידי CLARITY. בהשוואה לרטינות לא מעובדות של הרכבה שלמה, CLARITY יכולה לחשוף חיסונים לחלבונים סינפטיים כגון חלבון בצפיפות פוסט-סינפטית 95. התוצאות שלנו מראות כי CLARITY הופך את הרשתית לשקופה יותר מבחינה אופטית לאחר הסרת השומנים ומשמר מבנים עדינים של נוירונים ברשתית וחלבונים שלהם, אשר ניתן להשתמש בהם באופן שגרתי להשגת הדמיה ברזולוציה גבוהה של נוירונים ברשתית ומבנים תת-תאיים שלהם בהכנה לכל ההר.
מבוא
הרשתית החולייתנית היא אולי החלק הנגיש ביותר במערכת העצבים המרכזית (CNS), והיא משמשת מודל מצוין לחקר ההתפתחות, המבנה והתפקוד של המוח. חמישה סוגים של נוירונים ברשתית מופצים בשלוש שכבות גרעיניות המופרדות על ידי שתי שכבות plexiform. השכבה הגרעינית החיצונית (ONL) מורכבת מצלמי פוטורצפטורים קלאסיים (מוטות וקונוסים) הממירים אור לאותות חשמליים. אותות חשמליים מעובדים על ידי נוירונים בשכבה הגרעינית הפנימית (INL), כולל תאים דו קוטביים, אופקיים ואמקרין, ולאחר מכן מועברים לתאי גנגליון ברשתית (RGCs) בשכבת תא הגנגליון (GCL). RGCs הם נוירוני הפלט של הרשתית, כאשר האקסונים מקרינים למוח לתרום לתפקוד חזותי יוצר תמונה ולא יוצר תמונה. בנוסף, שלושה סוגים של תאי גליה (תאי מולר, אסטרגליה ומיקרוגליה) מספקים חומרים מזינים לנוירונים ומגנים על נוירונים מפני שינויים מזיקים בסביבה החוץ-תאית שלהם.
תת-אוכלוסין מיוחד אחד של תאי אמקרין מייצר ומשחרר דופמין, נוירומודולטור חשוב במערכת העצבים המרכזית, מגדיר מחדש מעגלים עצביים ברשתית במהלך הסתגלות אור1,2. לתאי אמקרין דופאמין (DACs) יש תכונה ייחודית של פרופילים מורפולוגיים. הסומטה שלהם ממוקמים INL proximal עם דנדריטים ramifying בחלק הדיסטלי ביותר של שכבת plexiform הפנימית (IPL). תהליכים דמויי אקסון של DACs הם unmyelinated, רזה וארוך, מסועף בדלילות, לשאת varicosities (האתרים של שחרור דופמין). הם יוצרים מקלעת צפופה עם דנדריטים ב- IPL, כולל מבנים דמויי טבעת סביב הסומטה של תאי אמקרין AII. האקסונים גם לרוץ דרך INL לכיוון OPL, יצירת מסלול צנטריפוגלי על פני הרשתית3. הוכחנו כי תהליכי DAC מבטאים קולטנים בתגובה לשחרור גלוטמט מתאי עצב פרה-קוטביים, כולל תאים דו קוטביים ותאי גנגליון רשתית רגישים באופן מהותי (ipRGCs)4,5,6. עם זאת, לא ברור אם קולטני גלוטמט מבטאים על האקסונים, הדנדריטים, או שניהם מכיוון שהם מנותקים בקטעי רשתית אנכיים ולא ניתן להבחין ביניהם5,6. חיסון צריך להתבצע ברשתיות הר שלם כדי לחשוף הסתעפות תלת מימדית של DACs ואת נוכחותם של קולטני גלוטמט על תאים תת תאיים. למרות הרשתית היא שקופה יחסית, עובי של רשתית הר עכבר כולו הוא כ 200 מיקרומטר, אשר מגביל את החדירה של נוגדנים לתוך הרקמה העמוקה, כמו גם מפחית חדירת אור להדמיה ברזולוציה גבוהה עקב פיזור אור רקמה. כדי להתגבר על מגבלות אלה, התאמנו את שיטת ההידרוגל התואמת לרקמות (CLARITY) שפותחה לאחרונה עבור מקטעי מוח עבים לרטינות עכבר הר שלם7.
שיטת CLARITY פותחה במקור על ידי מעבדת Deisseroth עבור immunostaining והדמיה של דגימות מוחעבות 7. הוא משתמש בחומר ניקוי חזק, נתרן דודציל סולפט (SDS) ואלקטרופרזה כדי להסיר את רכיבי השומנים (הגורמים לפיזור אור רקמות), ומשאיר את החלבונים וחומצות הגרעין במקומם. השומנים שהוסרו מוחלפים בפיגום שקוף המורכב ממונומרים הידרוג'ל כגון אקרילאמיד לתמיכה במבנה החלבון הנותר. ניתן לתייג את הרקמה המנוקה באמצעות אימונוהיסטוכימיה ולצלם אותה עם עומק חדירת אור מוגבר באופן משמעותי דרך הרקמה (עד כמה מילימטרים מתחת לפני השטח של הרקמה). מאז, שיטת CLARITY עברה אופטימיזציה ופישוט על ידי מספר קבוצות מחקר8,9,10. פרוטוקול CLARITY שונה משתמש בטכניקת סליקה פסיבית כדי למנוע את הנזק האפשרי לרקמות המיוצר על ידי אלקטרופורזה לניקוי המוח כולו ואיברים שלמים אחרים11. עם זאת, שיטה זו עדיין לא הוחלה על רשתית הר שלם. כאן, התאמנו את טכניקת הבהירות הפסיבית עבור רטינות הר שלם כדי להפוך אותם שקופים יותר עבור אימונוהיסטוכימיה והדמיה. מצאנו כי רוב החלבונים ברשתית שנבדקו נשמרו במהלך תהליך זה עבור אימונוהיסטוכימיה. באמצעות פתרון התאמת אינדקס שבירה, הצלחנו לדמיין נוירונים ברשתית על פני עובי של כ 200 מיקרומטר מן ONL ל- GCL ברשתית הרכבה שלמה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
טיפול בעכבר וכל ההליכים הניסיוניים נערכו על פי הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות עבור חיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדות המוסדיות לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת אוקלנד (פרוטוקול מס ' 18071).
הערה: שמות הפתרונות והיצירות שלהם מפורטים בטבלה 1.
1. הכנת רקמות
- המתת עכבר עם מנת יתר של CO2, ואחריו נקע בצוואר הרחם.
- להסב את העיניים עם מלקחיים מעוגלים ולהעביר אותם לצלחת פטרי קטנה עם 0.1 M PBS(טבלה 1). תחת מיקרוסקופ ניתוח, לתקוע חור קטן לאורך צומת הקרנית-סקלרה עם מחט. מעבירים ל-4% פארפורמלדהיד (PFA) למשך שעה.
- מעבירים את העין בחזרה למנה עם PBS. תחת מיקרוסקופ ניתוח, להשתמש מספריים ניתוח לחתוך את כל הדרך סביב צומת קרנית-סקלרה. מוציאים את הקרנית והעדשה. חותכים בבסיס עצב הראייה ומקלפים בזהירות את הסקלרה במלקחיים כדי לבודד את הרשתית.
- בצע ארבעה חתכים קטנים באופן שווה סביב הרשתית ולהשתמש מברשת קצה דק טבול PBS להניח אותו שטוח (GCL בצד למטה) בצורה דמוית תלתן על חתך מרובע קטן מנייר מסנן nitrocellulose כדי לייצב את הרשתית.
- מעבירים את הרשתית באמצעות מלקחיים כדי להחזיק את הפינה של נייר nitrocellulose (מבלי לגעת ברשתית רכוב) ומניחים אותו בצלחת 48-well עם 4% PFA במשך שעה אחת.
- מעבירים את נייר המסנן והרשתית לבאר עם PBS ושוטפים (3x למשך 5 דקות כל אחד).
- מעבירים ל-A4P0(שולחן 1)ומדגרת לילה ב-4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
- שמן צמחי פיפטה לתוך הבאר כדי לכסות לחלוטין את הפתרון A4P0. דגירה באמבט מים ב 40 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות ללא רעידות.
- לשטוף (3x במשך 5 דקות כל אחד) ב PBS, לוודא את כל השמן כבר שטף. במידת הצורך, השתמש בצינור כדי להסיר בזהירות את השמן שנותר מהחלק העליון של הבאר לפני השטיפה האחרונה.
- דגירה ב 10% SDS ב 40 מעלות צלזיוס במשך יומיים עם רעידות עדינות. החלף SDS עם פתרון טרי ביום השני.
- העבר את נייר המסנן והרשתית ל- PBS עם Triton-X-100 (PBST, טבלה 1) ושטוף (5x עבור 1.5 שעות כל אחד).
- יש לאחסן ב-4°C ב-PBST עם 0.01% נתרן אזיד (NaN3)או לעבור ישירות לחיסון.
2. התאמת אינדקס חיסוני ושבירה
- הסר את הרשתית מנייר הסינון על-ידי קילוף עדין שלה באמצעות מברשת קצה עדינה ב- PBST.
- דגירה הרשתית בנוגדן ראשוני (טבלה 2) מדולל בתמיסת חסימה (טבלה 1) במשך 2 ימים ב 40 מעלות צלזיוס עם טלטול עדין.
- לשטוף (5x, 1.5 שעות כל אחד) ב PBST.
- דגירה עם הנוגדנים המשניים המתאימים (טבלה 3) מדוללת בתמיסת חסימה במשך יומיים ב 40 מעלות צלזיוס עם רעידות עדינות ולהגן מפני אור לאורך שארית ההליך.
- לשטוף (5x, 1.5 שעות כל אחד) במאגר פוספט 0.02 M (ראה טבלה 1).
- דגירה בפתרון התאמת אינדקס שבירה מבוסס סורביטול (sRIMS, ראה טבלה 1)ב 40 °C (70 °F) לילה עם רעידות עדינות.
3. הרכבה על הרכבה
- מיתאר כיסויי זכוכית בגודל 18 מ"מ x 18 מ"מ x 1.5 מ"מ עם סמן קבוע עדין לסימון גבול מרובע בגב שקופית מיקרוסקופ זכוכית.
- הפוך את השקופית והשתמש במזרק כדי לעקוב אחר הגבול עם קו דק של גריז סיליקון בחזית השקופית, משאיר רווח קטן בפינה אחת עבור פתרון הרכבה עודף לברוח.
- מעבירים את הרשתית למרכז האזור התחום ומסדרים עם מברשת קצה דק כך שהיא שוכנת שטוחה עם הצד photoreceptor נגד שקופית הזכוכית.
- פיפטה כ 60 μL של sRIMS כך שהוא מכסה את הרשתית שטוח משתרע על פינה אחת של המתחם, דואג כי הרשתית נשארת שטוחה במקום.
- החל את הכיסוי החל מהפינה עם sRIMS ולהוריד אותו לאט עד שהוא נוגע בשמן מכל הצדדים, הימנעות היווצרות של בועות אוויר.
- מניחים ערימה של 3 כיסויים בכל צד של הרשתית המותקנת כמרווח. השתמש בקצה הארוך של שקופית אחרת כדי ללחוץ על החלקה כדי שההרכבה יהיה שטוח ושווה.
- יש לאחסן שקופיות שטוחות ב-4°C עד להדמיה.
4. הדמיה
- דגימות תמונה על מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי או מיקרוסקופ קונפוקלי (שולחן החומרים). התחל על ידי הצבת השקופית על שלב המיקרוסקופ ואיתור המדגם.
הערה: אם נעשה שימוש במיקרוסקופ אובייקטיבי הפוך, הנח את השקופית במהופך על הבמה, תחילה כדי להבטיח שהאזורים החשופים של השקופית נקיים מכל גריז הסיליקון ותמיסת ההרכבה. - כדי להשיג תמונות מוערמות z של דגימות בעלות תווית משותפת, התמקדו תחילה באות בכל ערוץ בנפרד וקבעו את זמן החשיפה או מהירות הסריקה, למיקרוסקופים פלואורסצנטיים או קונפוקליים, בהתאמה.
- הגדר את הטווח עבור מחסנית z על-ידי הגדרה ידנית של מישור המוקד בחלק העליון והתחתון של הטווח הרצוי, או על-ידי הגדרת נקודת האמצע ולאחר מכן ציון טווח סביב נקודת האמצע.
- התאימו את גודל הצעד או את מספר הפרוסות לפי הצורך.
- ללכוד את התמונה ולשמור את הקובץ המקורי, כמו גם לייצא אותו כקובץ TIFF או בפורמט רצוי אחר.
5. ניתוח תמונה
- השתמש בתוכנת ניתוח התמונה המועדפת (טבלה של חומרים) כדי להתאים את הבהירות והניגודיות בכל ערוץ עד שיושג בהירות אופטימלית הן בתמונות הבודדות והן בעיבוד התלת מימדי של מחסנית z.
הערה: אם גודל הצעד שנבחר קטן מספיק, ניתן לבצע גם ניתור תלת-ממדי כדי לשפר את האות.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
רשתית מעובדת בהירות שונה הם רקמה שקופה אופטית.
כדי לגבש שיטת ניקוי רקמות התואמת ליישומים אימונוהיסטוכימיים ברשתית תוך מתן לשון נאותה ושימור השלמות המבנית של החלבונים התאיים, התאמנו את שיטת ניקוי רקמת CLARITY לרשתיות עכברים שלמות. הצלחנו לפשט את הפרוטוקול ולשנות אותו עבור רשתית הר שלם (ראה פרוטוקול). לאחר השלמת הכלאה, סליקה והתאמה לאינדקס שבירה, רשתית המעובדת בפרוטוקול CLARITY שונה זה הראתה שקיפות אופטית כמעט מוחלטת לאורך עובי הרשתית (איור 1A) בהשוואה לרשתיות בקרה לא מעובד...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
שינוי פרוטוקול CLARITY עבור רשתית הרכבה שלמה.
פישטנו את פרוטוקול CLARITY כדי להשיג פולמור הולם ללא צורך בפינוי ואקום או תא ייבוש, כפי שנעשה ברוב המחקריםהקודמים 7,9,11. תהליך הפולמליזציה מעוכב על ידי חמצן, הדורש כי המדגם להיות מבודד מהאוויר במהלך שלב פולמור של הפרוטוקול. עם זאת, במקום degassing עם חנקן, מצאנו כי כיסוי המדגם עם שמן מבודד מספיק את המדגם כדי לאפשר פולמור מבלי להשפיע לרעה על שאר הפרוטוקול לאחר שטי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
ברצוננו להודות לבינג יה, ניית'ן ספיקס והאו ליו על התמיכה הטכנית. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי למענקי בריאות EY022640 (D.-Q.Z.) ופרס מחקר הסטודנטים של אוניברסיטת אוקלנד (E.J.A.).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| אקרילאמיד | Fisher Biotech | BP170 | מונומר הידרוג'ל |
| Axio Imager.Z2 | Zeiss | מיקרוסקופ פלואורסקנס | |
| BSA | Fisher Scientific | BP1600 | סוכן חוסם |
| Eclipse Ti | Nikon Instruments | סריקה קונפוקלית מיקרוסקופ | |
| KCl | VWR | BDH0258 | רכיב מאגר |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | רכיב חיץ |
| Na2HPO4 | Sigma Aldrich | S9763 | רכיב מאגר |
| NaCl | Sigma Aldrich | S7653 | רכיב חיץ |
| NaH2PO4 | Sigma Aldrich | S0751 | רכיב חיץ |
| NaN3 | Sigma Aldrich | S2002 | חומר משמר בקטריוסטטי |
| NDS | Aurion | 900.122 | סוכן חוסם |
| NIS אלמנטים AR | Nikon | תוכנת ניתוח תמונה | |
| SDS | BioRad | 1610301 | חומר דהליפידציה |
| סורביטול | סיגמא אולדריץ' | 51876 | רכיב חיץ |
| טריטון-X-100 | סיגמא | T8787 | חומר פעילי שטח |
| Tween-20 | פישר סיינטיפיק | BP337 | פעילי שטח |
| VA-044 | Wako Chemicals | 011-19365 | יוזם תרמי |
מקורות
- Witkovsky, P. Dopamine and retinal function. Documenta Ophthalmologica. 108 (1), 17-40 (2004).
- McMahon, D. G., Iuvone, P. M. Circadian organization of the mammalian retina: from gene regulation to physiology and diseases. Progress in Retinal and Eye Research. 39, 58-76 (2014).
- Prigge, C. L., et al. M1 ipRGCs Influence Visual Function through Retrograde Signaling in the Retina. Journal of Neuroscience. 36 (27), 7184-7197 (2016).
- Zhang, D. Q., Belenky, M. A., Sollars, P. J., Pickard, G. E., McMahon, D. G. Melanopsin mediates retrograde visual signaling in the retina. PLoS One. 7 (8), 42647(2012).
- Liu, L. L., Alessio, E. J., Spix, N. J., Zhang, D. Q. Expression of GluA2-containing calcium-impermeable AMPA receptors on dopaminergic amacrine cells in the mouse retina. Molecular Vision. 25, 780-790 (2019).
- Liu, L. L., Spix, N. J., Zhang, D. Q. NMDA Receptors Contribute to Retrograde Synaptic Transmission from Ganglion Cell Photoreceptors to Dopaminergic Amacrine Cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 279(2017).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332(2013).
- Poguzhelskaya, E., Artamonov, D., Bolshakova, A., Vlasova, O., Bezprozvanny, I. Simplified method to perform CLARITY imaging. Molecular Neurodegeneration. 9, 19(2014).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Magliaro, C., et al. Clarifying CLARITY: Quantitative Optimization of the Diffusion Based Delipidation Protocol for Genetically Labeled Tissue. Frontiers in Neuroscience. 10, 179(2016).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Zheng, H., Rinaman, L. Simplified CLARITY for visualizing immunofluorescence labeling in the developing rat brain. Brain Structure and Function. 221 (4), 2375-2383 (2016).
- Witkovsky, P., Arango-Gonzalez, B., Haycock, J. W., Kohler, K. Rat retinal dopaminergic neurons: differential maturation of somatodendritic and axonal compartments. Journal of Comparative Neurology. 481 (4), 352-362 (2005).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
