מאמר שיטה

יצירת כימרות במוח הקדמי של העופות להערכת התפתחות הפנים

DOI:

10.3791/62183

⸱

18 בפברואר 2021

 , 
1Department of Orthopaedic Surgery, Orthopaedic Trauma Institute, University of California

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מאמר זה מתאר טכניקת השתלת רקמות שנועדה לבחון את תכונות האיתות והדפוס של המוח הקדמי הבסיסי במהלך התפתחות הגולגולת.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עובר העופות שימש כמערכת מודל במשך יותר ממאה שנה והוביל להבנה בסיסית של התפתחות בעלי חוליות. אחת מנקודות החוזק של מערכת מודל זו היא שניתן להעריך ישירות את ההשפעה של רקמות ואינטראקציה ביניהן בעוברים כימריים. הראינו בעבר כי אותות מהמוח הקדמי תורמים למורפוגנזה של הפנים על ידי ויסות צורת תחום הביטוי של קיפוד סוניק (SHH) באזור האקטודרמלי הקדמי (FEZ). במאמר זה מתוארת השיטה ליצירת כימרות במוח הקדמי ולספק המחשות לתוצאות ניסויים אלה.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רוב המחקר העכשווי בביולוגיה התפתחותית מתמקד בתפקידם של גנים בעיצוב עוברים. יש כלים טובים לבחון מנגנונים התפתחותיים מנקודת מבט גנטית. עם זאת, עוברים מורכבים ועוברים מורפוגנזה בתגובה לאינטראקציות בין רקמות. מערכת העופות היא כלי קלאסי המשמש להערכת מגוון אינטראקציות הרקמות המווסתות את ההתפתחות מהסיבות הבאות: האמבריולוגיה מובנת היטב, העוברים נגישים בקלות, הכלים לניתוח מערכות העופות מפותחים והעוברים זולים.

מערכת השתלות העופות נמצאת בשימוש נרחב למעקב אחר שושלות ולהערכת אינטראקציות רקמות במהלך ההתפתחות במשך כמעט מאה שנה 1,2,3,4. מערכת זו שימשה לחקר מרכז איתות, Frontonasal Ectodermal Zone (FEZ), המווסת מורפוגנזה של הלסת העליונה5, ופורסם סרטון המתאר טכניקה זו בעבר6. בנוסף לגוזל שליו, מינים אחרים שימשו גם לייצור כימרות לניתוח אינטראקציות בין רקמות. לדוגמה, העכבר FEZ הושתל מעכברים פראיים מסוג7 ועכברים מוטנטיים8, ואחרים השתמשו במערכות ברווז, שליו ואפרוחים כדי להעריך את התפקיד של סמל עצבי בעיצוב שלד הפנים 9,10,11,12.

בעבודה זו הוערך תפקידו של המוח הקדמי בוויסות דפוס ביטוי הגנים ב-FEZ על ידי השתלת המוח הקדמי הגחוני באופן הדדי בין עוברי שליו, ברווז ואפרוחים, מאחר שנדרש אות מהמוח הקדמי כדי לגרום לביטוי קיפוד סוניק ב-FEZ. השתלות מוח קדמי אינן ייחודיות בתחום. השתלות אלה שימשו להערכת התפתחות תנועתיות בעוברי שליו וברווז13, אם כי בניסויים אלה הושתלו גם רקמות שתרמו לנגזרות לא עצביות. בעבודות אחרות, מעגלי שמיעה בציפורים הוערכו על ידי השתלת מוח קדמי14, אך השתלות אלה הכילו תאי פסגה עצביים משוערים, התורמים לצורת הפנים 9,10 ומשתתפים בוויסות הבעת SHH ב- FEZ 15. לפיכך, פותחה מערכת להשתלת המוח הקדמי הגחוני בלבד ממין אחד של ציפור למשנהו לפני סגירת הצינור העצבי כדי להעריך את תפקיד המוח בצורת פנים 16 (איור 1A,B). שיטה זו הייתה נטולת זיהום עצבי של השתל. במאמר זה מודגמת השיטה ומתוארות התוצאות הצפויות, ונדונים האתגרים הניצבים בפנינו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ברווז פקין לבן (Anas platyrhynchos), עוף לגהורן לבן (Gallus gallus) ושליו יפני (Cortunix coturnix japonica) מודגרים ב 37 ° C בתא לח עד שלב תואם ב HH7/817.

1. הכנת הרקמה התורמת

הערה: הכנת ריאגנטים וכלים וכיצד לפתוח ביצים למניפולציה ניסיוניתתוארה 6.

  1. הכן מדיה DMEM עם אדום ניטרלי, פיפטה העברת זכוכית, ומחטי טונגסטן מושחזות.
  2. חשיפת עוברים (כפי שמוצגב-6).
  3. קצירת שתלי רקמה מהצד השמאלי של המוח הקדמי הבסיסי של עוברים בשלב 7/8. השתמש במחטי טונגסטן מחודדותמעוקלות 6 כדי לחתוך בעדינות חתיכה מהמוח הקדמי בגודל ~ 0.3 מ"מ אורך על 0.2 מ"מ רוחב, וודא שלא לכלול את האנדודרם הבסיסי על ידי החלקת המחט מתחת למוח הקדמי כך שהמחט מקבילה לציר הצינור העצבי.
  4. באמצעות פיפטת העברת הזכוכית, הרימו את השתל מהעובר התורם.
  5. העבר את השתל ל- DMEM המכיל אדום נייטרלי (0.01% ב- PBS, 23 ° C) למשך 2 דקות כדי להכתים אותו, ולאחר מכן הכנס את השתל המוכתם ל- DMEM שאינו מכיל אדום נייטרלי עד שיהיה מוכן לקליטה.

2. הכנת המארח

  1. לדגור על ביצים מופרות מעוף לגהורן לבן (Gallus gallus) ב 37 ° C בתא לח עד HH7/8 17.
  2. חשיפת עוברים (כפי שמוצגב-6).
  3. באמצעות מחטי טונגסטן מושחזות, הכן את אתר השתל על ידי חיתוך עדין, ולאחר מכן הסרת חתיכה של 0.3 מ"מ על 0.2 מ"מ של המוח הקדמי הבסיסי מצד שמאל כדי להתאים את השתל כפי שנעשה כדי לבודד את הרקמה התורמת.
  4. היזהר למנוע הפרעה מוגזמת של האנדודרם הבסיסי, אשר יהיה ניכר כמו גרגרי חלמון יתחילו לדלוף דרך כל קרע שנוצר. זה דורש תרגול ולא כל הניסיונות יצליחו.
  5. לאחר המעבר למארח6, מקם את השתל כדי להחליף את המוח הקדמי הבסיסי של המארח.
  6. מניחים סרט בחוזקה מעל החור ומחזירים את העובר לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הזמן המתאים לניתוח.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת כימריזם וזיהום השתלות
על מנת להעריך את הכימרות, יש להתייחס למידת הכימריזם והזיהום של השתל עם סוגי תאים אחרים. יצירת כימרות על ידי השתלת רקמות שליו בעוברי אפרוחים מאפשרת ניתוח מסוג זה. באמצעות נוגדן QCPN ניתן להמחיש תאי שליו ולהבדיל בינם לבין הרקמות המארחות (איור 1, C,D). במקרה זה, רק רקמות שמקורן במוח הקדמי הגחוני הוכתמו בנוגדן המציין שהשתל לא היה מזוהם בסוגי תאים אחרים כולל סמל עצבי. ניתן להעריך את מידת הכימריזם מסעיפים אל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השיטה המתוארת מאפשרת לבחון את יחסי הגומלין בין המוח הקדמי הבסיסי לבין האקטודרם הסמוך. גישה זו שונה משיטות השתלת מוח קדמי קודמות, מכיוון שרקמת התורם הייתה מוגבלת למוח הקדמי הגחוני. זה מבטל השתלה של תאי הפסגה העצבית, אשר הוכחו להשתתף בדפוס מורפולוגיית הפנים 9,10. לפיכך, הגבלת השתל למוח הקדמי הבסיסי הייתה חיונית להערכת תוצאות הניסוי המתוכננות.

במחקר הקודם שהשתמש בהשתלות מוח קדמי13,14 נוכחותה של רקמה חוץ-עצבית לא הפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

לכל המחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי למחקר שיניים וקרניופציאליות של המכונים הלאומיים לבריאות תחת מספרי הפרסים R01DE019648, R01DE018234 ו- R01DE019638.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1x PBSTEKTEKZR114
35x10 מ"מ צלחת פטריFalcon1008
DMEMThermofisherמחזיק
Fine Science Tools26016-12
סיגמאאדום ניטרלי553-24-2
מס' 5 מלקחיים דומונטכלים מדעיים עדינים11252-20
פסטר PipetsThermofisher13-678-6B
QCPN נוגדניםלימודי התפתחות בנק היברידומה, אוניברסיטת איווה, איווה, ארה"ב
מספרייםכלי מדע עדינים14058-11
מחט טונגסטןכלי מדע עדינים26000
מחט 11965084

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Waddington, C. Developmental Mechanics of Chicken and Duck Embryos. Nature. 125, 924-925 (1930).
  2. Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
  3. Borue, X., Noden, D. M. Normal and aberrant craniofacial myogenesis by grafted trunk somitic and segmental plate mesoderm. Development. 131 (16), 3967-3980 (2004).
  4. Teillet, M. A., Ziller, C., Le Douarin, N. M. Quail-chick chimeras. Methods in Molecular Biology. 461, 337-350 (2008).
  5. Hu, D., Marcucio, R. S., Helms, J. A. A zone of frontonasal ectoderm regulates patterning and growth in the face. Development. 130 (9), 1749-1758 (2003).
  6. Hu, D., Marcucio, R. S. Assessing signaling properties of ectodermal epithelia during craniofacial development. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  7. Hu, D., Marcucio, R. S. Unique organization of the frontonasal ectodermal zone in birds and mammals. Developmental Biology. 325 (1), 200-210 (2009).
  8. Griffin, J. N., et al. Fgf8 dosage determines midfacial integration and polarity within the nasal and optic capsules. Developmental Biology. 374 (1), 185-197 (2013).
  9. Schneider, R. A., Helms, J. A. The cellular and molecular origins of beak morphology. Science. 299 (5606), 565-568 (2003).
  10. Tucker, A. S., Lumsden, A. Neural crest cells provide species-specific patterning information in the developing branchial skeleton. Evolution & Development. 6 (1), 32-40 (2004).
  11. Fish, J. L., Schneider, R. A. Assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras. Journal of Visualized Experiments. (87), (2014).
  12. Schneider, R. A. Neural crest and the origin of species-specific pattern. Genesis. 56 (6-7), 23219(2018).
  13. Sohal, G. S. Effects of reciprocal forebrain transplantation on motility and hatching in chick and duck embryos. Brain Research. 113 (1), 35-43 (1976).
  14. Chen, C. C., Balaban, E., Jarvis, E. D. Interspecies avian brain chimeras reveal that large brain size differences are influenced by cell-interdependent processes. PLoS One. 7 (7), 42477(2012).
  15. Hu, D., Marcucio, R. S. Neural crest cells pattern the surface cephalic ectoderm during FEZ formation. Developmental Dynamics. 241 (4), 732-740 (2012).
  16. Hu, D., et al. Signals from the brain induce variation in avian facial shape. Developmental Dynamics. 244 (9), 1133-1143 (2015).
  17. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).
  18. Xu, Q., et al. Correlations Between the Morphology of Sonic Hedgehog Expression Domains and Embryonic Craniofacial Shape. Evolutionary Biology. 42 (3), 379-386 (2015).
  19. Eames, B. F., Schneider, R. A. The genesis of cartilage size and shape during development and evolution. Development. 135 (23), 3947-3958 (2008).
  20. Merrill, A. E., Eames, B. F., Weston, S. J., Heath, T., Schneider, R. A. Mesenchyme-dependent BMP signaling directs the timing of mandibular osteogenesis. Development. 135 (7), 1223-1234 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Sonic Hedgehog

מאמרים קשורים