כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות
במאמר זה
סיכום
תקציר
יותר מ -700 גרסאות בגן RYR1 זוהו בחולים עם הפרעות עצביות-שריריות שונות כולל רגישות היפרתרמיה ממאירה, מיופתיות ליבה ומיופתיה centronuclear. בגלל פנוטיפים מגוונים הקשורים מוטציות RYR1 זה בסיסי לאפיין את ההשפעות התפקודיות שלהם כדי לסווג וריאנטים נישאים על ידי חולים להתערבויות טיפוליות עתידיות ולזהות וריאנטים שאינם פתוגניים. מעבדות רבות התעניינו בפיתוח שיטות לאפיון תפקודי של מוטציות RYR1 המתבטאות בתאי המטופלים. לגישה זו יתרונות רבים, כולל: מוטציות מתבטאות באנדוגניות, RyR1 אינו מתבטא יתר על המידה, השימוש בתאי RyR1 הטרולוגיים המבטאים נמנע. עם זאת, מאז חולים עשויים להציג מוטציות בגנים שונים מלבד RYR1, חשוב להשוות תוצאות מחומר ביולוגי מאנשים מחסה אותה מוטציה, עם רקע גנטי שונה. כתב היד הנוכחי מתאר שיטות שפותחו כדי לחקור את ההשפעות התפקודיות של גרסאות RYR1 המובעות באנדוגניות ב: (א) וירוס אפשטיין בר הנציח לימפוציטים B אנושיים ו -(ב) תאי לווין הנגזרים ביופסיות שרירים ומובחנים לתוך מיוטיוב. שינויים בריכוז הסידן התאי המופעלים על ידי תוספת מפעילי RyR1 פרמקולוגיים מנוטרים לאחר מכן. סוג התא שנבחר נטען עם מחוון סידן פלואורסצנטי יחסטרי ושינויים תאיים [Ca2+] מנוטרים או ברמת התא הבודד על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או באוכלוסיות תאים באמצעות ספקטרופלואורומטר. המנוחה [Ca2+], עקומות תגובת מינון אגוניסטיות משווות לאחר מכן בין תאים משליטה בריאה וחולים מחסה וריאנטים RYR1 המוביל תובנה לתוך ההשפעה התפקודית של גרסה נתונה.
מבוא
עד כה זוהו יותר מ-700 גרסאות RYR1 באוכלוסייה האנושית וקשורות להפרעות נוירו-שריריות שונות, כולל רגישות היפרתרמיה ממאירה (MHS), פעילות גופנית המושרה rhabdomyolysis, מחלת ליבה מרכזית (CCD), מחלת רב-מיני-קור (MmD), מיופתיה סנטרונוקלארית (CNM)1,2,3 ; עם זאת, מחקרים לאפיון ההשפעות התפקודיות שלהם מפגרים ורק כ -10% מהמוטציות נבדקו באופן פונקציונלי. ניתן להשתמש בגישות ניסיוניות שונות כדי להעריך את ההשפעה של גרסה RyR1 נתון, כולל transfection של תאים הטרולוגיים כגון HEK293 ו COS-7 תאים עם קידוד plasmid עבור WT מוטציה RYR1 cDNA4,5
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקולים המתוארים להלן תואמים את הנחיות האתיקה של Ethikkommission Nordwest- und Zentralschweiz EKNZ.
1. הכנת אפשטיין בר מונצח B-לימפוציט קווים11
- לאחר הסכמה מדעת, לאסוף 30 מ"ל של דם שלם בצינורות סטריליים שטופלו EDTA מן proband נושא מוטציה RYR1 ומבני משפחה בריאים ללא מוטציה.
הערה: שמור על כל הפתרונות סטריליים ועבוד במכסה המנוע של תרבית הרקמות. - לבודד תאים מונונוקלאריים מדם שלם על ידי צפיפות של מדיית צנטריפוגה הדרגתית (למשל, פיקול-היפק, .077 גרם/ ליטר).
- מניחים 30 מ"ל של דם סטרילי בצינור סטרילי חרוט 50 מ"ל.
- מניחים את הקצה של פיפטת פסטר המכילה את מדיית צנטריפוגת שיפוע הצפיפות בת....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
[Ca2+]i מדידות באוכלוסיות של לימפוציטים B מונצחים EBV
לימפוציטים B-לימפוציטים ראשוניים מבטאים את איזופורם RyR1 המתפקד כערוץ שחרור Ca2 + במהלך קולטן אנטיגן של תאי B מגורה תהליכי איתות17. הנצחה של תאי B עם EBV, הליך המשמש באופן שגרתי על ידי גנטיקאים כדי להשיג קווי תאים המכילים מידע גנומי של חולים, מספק את היתרון של יצירת קווי תאים המבטאים מוטציה RyR1 Ca2 + ערוצים בחולי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה נוצלו בהצלחה על ידי מספר מעבדות כדי לחקור את ההשפעה של מוטציות RYR1 על הומאוסטזיס סידן. הצעדים הקריטיים של הגישות המתוארות במאמר זה עוסקים בעקרות, מיומנויות וטכניקות פולחן תאים וזמינות של חומר ביולוגי. באופן עקרוני, השימוש בלימפוציטים B מונצחים EBV הוא פשוט יותר ומאפשר אחד ליצור קווי תאים המכילים ערוצי RyR1 מוטנטי. התאים יכולים להיות קפואים ומאוחסנים בחנקן נוזלי במשך שנים רבות ותרבויות ניתן להתחיל מחדש בכל עת. בנוסף, ניתן לבחור אם לפקח על הומאוסטזיס סידן באוכלוסיות תאים או ברמת התא הבודד. הש.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
העבודה המתוארת בכתב יד זה נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית השוויצרית למדע (SNF) ומקרן השרירים השוויצרית.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| צינורות איסוף דם | Sarstedt | 172202 | |
| אלבומין סרום בקר (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| קפאין | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ מצלמת CCD | פוטומטריה | ||
| מפל 128+ CCD | פוטומטריה | ||
| קריאטין | סיגמא-אולדריץ' | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| גורם גדילה אפידרמיס (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| סרום עגל עוברי | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| סרום סוסים | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| אינסולין | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| למינין | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| מערכת מיקרופרפוזיה | ALA-Scientific | DAD VM 12 סעפת שסתומים | |
| תוכנת מקור | OriginLab Corp | תוכנה | |
| פניצילין/סטרפטומיצין | Gibco מדעי החיים | 15140-122 | |
| תא זלוף POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| פולי-L-ליזין | סיגמא-אולדריץ' | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher | ||
| פרקין אלמר | LS50 | ||
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| כלי תרבית רקמות | Falcon | 353046 | |
| בקבוק תרבית רקמות | Falcon | 353107 | |
| תרבית רקמות מוסיף | תמיסת Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 מיקרוסקופ טלוויזיה | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss כיסויי זכוכית | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
מקורות
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings i....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
