מחקרים ברזולוציה גבוהה של חלבונים בממברנות טבעיות על ידי תמ"ג במצב מוצק

סיכום

עבודה זו מפרטת שגרות בסיסיות חזקות כיצד להכין דגימות חלבון ממברנה עם תווית איזוטופ ולנתח אותן ברזולוציה גבוהה בשיטות ספקטרוסקופיה מודרניות של NMR במצב מוצק.

תקציר

חלבוני ממברנה חיוניים לתפקוד התא ולכן מייצגים מטרות תרופתיות חשובות. ספקטרוסקופיה של תהודה מגנטית גרעינית במצב מוצק (ssNMR) מציעה גישה ייחודית לחקור את המבנה והדינמיקה של חלבונים כאלה בממברנות ביולוגיות במורכבות הולכת וגוברת. כאן, אנו מציגים ספקטרוסקופיה מודרנית של תמ"ג במצב מוצק ככלי לחקר מבנה ודינמיקה של חלבונים בממברנות שומנים טבעיות ובקנה מידה אטומי. מחקרים ספקטרוסקופיים כאלה מפיקים תועלת משימוש בשיטות ssNMR בעלות רגישות גבוהה, כלומר, ssNMR שזוהה על ידי פרוטון (¹H) ו-DNP (קיטוב גרעיני דינמי) נתמכים ב-ssNMR. באמצעות חלבון בטא-חבית ממברנה חיצונית חיידקית BamA ותעלת היונים KcsA, אנו מציגים שיטות להכנת חלבוני ממברנה מסומנים באיזוטופים ולהפקת מידע מבני ותנועתי על ידי ssNMR.

מבוא

מחקרים מבניים ותנועתיים של חלבוני ממברנה בסביבות רלוונטיות מבחינה פיזיולוגית מהווים אתגר לטכניקות ביולוגיה מבנית מסורתיות¹. שיטות מודרניות של ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית במצב מוצק (ssNMR) מציעות גישה ייחודית לאפיון חלבוני ממברנה ^2,3,4,5,6,7 ושימשו זה מכבר לחקר חלבוני ממברנה, כולל משאבות חלבון משובצות ממברנה⁸, תעלות ^9,10,11 או קולטנים ^12,13,14,15. התקדמות טכנית כגון שדות מגנטיים גבוהים במיוחד >1,000 מגה-הרץ, תדרי סיבוב בזווית קסם מהירה >100 קילו-הרץ וטכניקות היפרפולריזציה¹⁶ ביססו את ssNMR כשיטה רבת עוצמה לחקר חלבוני ממברנה בסביבות של מורכבות הולכת וגוברת מליפוזומים ועד קרומי תאים ואפילו תאים שלמים. לדוגמה, DNP הפך לכלי רב עוצמה לניסויים כאלה (ראה התייחסות 17,18,19,20,21,22,23,24,25). לאחרונה, ssNMR שזוהה ^ב-Hמציע אפשרויות הולכות וגדלות לחקר חלבוני ממברנה ברזולוציה ספקטרלית גבוהה ורגישות 25,26,27,28,29. עבודה זו מדגישה שני חלבוני ממברנה חיידקיים המעורבים בתפקודים חיוניים, כלומר, החדרת חלבון והובלת יונים. החלבונים המקבילים, BamA 25,30,31,32,33 ו-KcsA 23,27,28,34,35,36,37,38,39 (או גרסאות כימריות) שלהם ^נבדקו על ידי ssNMR שיטות במשך יותר מעשור.

פרוטוקול מייצג להכנה ואפיון ssNMR של חלבוני ממברנה שמקורם בחיידקים מוצג כאן. השלבים השונים של הפרוטוקול מוצגים באיור 1. ראשית, מוסבר הביטוי, תיוג האיזוטופים, הטיהור והבנייה מחדש של הממברנה של BamA. לאחר מכן, מוצג זרימת עבודה כללית לאפיון חלבון הממברנה על ידי ssNMR; באופן ספציפי, הקצאת עמודי השדרה של חלבון הממברנה באמצעות ssNMR שזוהה ^ב-Hבסיבוב מהיר בזווית קסם. לבסוף, מפורטים הגדרה בסיסית ורכישה של ניסויים הנתמכים בקיטוב גרעיני דינמי (DNP), המגבירים משמעותית את רגישות אות ssNMR.

פרוטוקול

1. ייצור של ²H, ¹³C, ¹⁵BamA-P4P5 עם תווית N

הערה: בעוד שפרוטוקול זה דורש עבודה עם חיידקים גראם-שליליים שאינם פתוגניים, הקפדה על נהלי בטיחות ביולוגיים בסיסיים היא חובה, כלומר, הרכבת משקפי בטיחות, מעילי מעבדה, כפפות ושמירה על נהלי הפעלה סטנדרטיים מוסדיים לעבודה עם מיקרואורגניזמים.

1. השתמש במושבה אחת של E. coli BL 21 Star (DE3) המכילה את קידוד הפלסמיד pET11aΔssYaeT עבור E. coli BamA-P4P5 כדי לחסן 50 מ"ל של מרק ליזוגני בתוספת 50 מיקרוגרם/ליטר אמפיצילין.
2. גדל את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס ב-200 סל"ד עד שמגיעים ל-OD₆₀₀ של 0.6. סובב ב -2,000 x גרם למשך 10 דקות. השעו מחדש את הגלולה ב-50 מ"ל של M9 (ראה טבלה 1) ל-OD₆₀₀ מקסימלי של 0.1.
   הערה: כל שלבי הגידול העתידיים מתבצעים בתנאים שצוינו לעיל אלא אם כן צוין אחרת.
3. גדל את התרבות עד OD₆₀₀ של 0.5. סובב ב-2,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את הגלולה ב-50 מ"ל של M9 המכיל 90% D₂O (ראה טבלה 1 למתכון) למקסימום_{OD 600} של 0.1. גדל את התרבית למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס ב-200 סל"ד.
4. סובב את התרבית ב -2,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השעו מחדש את הגלולה ב-50 מ"ל 90% D₂O M9 המחומם מראש ל-OD_{מקסימלי של 600} של 0.1. גדל עד שמגיעים ל-OD₆₀₀ של 1.0.
5. סובב את התרבית ב -2,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הכן 100 מ"ל של מדיום 100% D₂O M9 עם כמויות מועשרות באיזוטופים של גלוקוז לא מועשר ואמוניום כלוריד. השעו מחדש ב-100% D₂O M9 בינוני עד למקסימום_{OD 600} של 0.1. גדל עד שמגיעים ל-OD₆₀₀ של 0.7.
6. סובב את התרבית ב -2,000 x גרם למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה ב-500 מ"ל של מדיום 100% D₂O M9 עם איזוטופים (ראה טבלה 1) ל-OD_{מקסימלי של 600} של 0.1.
7. אפשר לתרבית לצמוח עד שמגיעים ל-OD₆₀₀ של 0.6-0.9. השרה עם 1 מ"מ של איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). יש לשאוב למשך 4 שעות ולקצור תאים ב-4,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.

2. טיהור, קיפול מחדש והיווצרות פרוטאו-ליפוזום BamA-P4P5

הערה: כל השלבים של סעיף זה צריכים להתבצע במכסה אדים. יש לנקוט בזהירות מיוחדת בעת פתיחת צינורות, לאחר צנטריפוגה מגבילה אירוסולים מזיקים.

1. להפשיר את הכדור על קרח. השעו מחדש את הגלולה ב-20 מ"ל של מאגר קר 1. ראה טבלה 2 עבור המאגרים.
2. סובב את התמיסה ב-4,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש את הגלולה ב-20 מ"ל של H₂O מזוקק קר. הניחו למתלה לדגור על קרח למשך 10 דקות.
3. סובב את המתלה ב-4,000 x g למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השעו מחדש ב-10 מ"ל מאגר קר 2 והניחו לדגור על קרח למשך 30 דקות.
4. השלימו את התערובת עם 10 מ"ל נוספים של חיץ קר 2 ודגרו למשך 30 דקות נוספות על קרח. יש להוסיף 0.5% n-דודציל-B-D-מלטוסיד (DDM) ולערבב בעדינות.
5. סוניקציה של הדגימה על קרח ב-13 קילו-הרץ עד לשימוש אכזרי של פעימות הפעלה/כיבוי באורך 10 שניות. סובב ב-25,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף שלוש פעמים עם 20 מ"ל של Buffer 3. צנטריפוגה ב-25,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
6. השעו מחדש את הגלולה ב-20 מ"ל של מאגר 4. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. סוניקציה של הדגימה על קרח ב-13 קילו-הרץ, עד לשימוש ברור בפולסים של הפעלה/כיבוי באורך 10 שניות.
7. סובב את הדגימה ב-25,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. חזור על שלבים 2.4 עד 2.6 תוך השמטת תוספת של מעכב פרוטאז ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס.
8. שטפו את הגלולה ב-20 מ"ל מים ופעמיים עם מאגר 3. סובב ב-25,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. יש לשים את המתלה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1 מ"ל ולסובב את צינורות המיקרו-צנטריפוגה במהירות מרבית על צנטריפוגה על ספסל למשך 20 דקות. טוהר גוף ההכללה מוערך על ידי 10% ג'ל SDS-Page, ראה איור 2A. התפוקה הצפויה עבור BamA-P4P5 מטוהר משולש (^{2 H,13 C,15}N) המסומן הוא 30 מ"ג/ליטר.
9. להמיס גופי הכללה ב-200 מיקרוליטר של מאגר 5 ו-300 מיקרוליטר של H₂O. הוסף 6M גואנידיום כלוריד (GdnCl). כוונן את נפח צינור המיקרו-צנטריפוגה ל-1 מ"ל עם H₂O. מערבל את התערובת ודוגר למשך 4 שעות בטמפרטורת החדר. מערבולת את צינורות המיקרו-צנטריפוגה מעת לעת (כל 30 דקות).
10. סובב ב-100,000 x גרם למשך שעה אחת ב-4 מעלות צלזיוס. השתמש בחוק באר-למברט כדי לקבוע את ריכוז החלבון ב-280 ננומטר. מקדם ההכחדה המולארי הוא 117,120 ^{M-1 cm-1}. אם הריכוז הוא >100 מיקרומטר יש לדלל עם 1x Buffer 5 עם 6 M GdnCl. לדלל במהירות את החלבון פי 10 במאגר 6. דוגרים את התערובת למשך הלילה בטמפרטורת החדר.
    הערה: עבור אולטרה-צנטריפוגה, השתמש בצינורות אולטרה-צנטריפוגה בדרגה 1.5 מ"ל.
11. קבע את יעילות הקיפול באמצעות ג'ל SDS-Page מקורי למחצה. קח שתי אליקוטות של 10 מיקרוליטר משלב 2.10 והוסף 10 מיקרוליטר של מאגר Lameili (מאגר 8) לכל מאגר. מרתיחים דגימה אחת למשך 10 דקות בחום של 95 מעלות צלזיוס; השאירו את האליקוט השני על הקרח. לאחר מכן, יש להריץ את שתי הדגימות ב-14 mA על ג'ל SDS-Page של 10%. חלקי הערימה וההפעלה של הג'לים חסרים חומר מפחית ו-SDS. צביעת חלבון מושגת באמצעות צבע Coomassie. התוצאות הצפויות מוצגות באיור 2B.
12. סובב את הדגימה ב-4,000 x גרם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. רכז את הדגימה לנפח עבודה של 8 מ"ל באמצעות פילטר צנטריפוגלי של 30 kDa. סובב את הדגימה ב-4,000 x g למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. מדוד את ספיגת החלבון ב-280 ננומטר. כמו בשלב 2.10, קבע את ריכוז החלבון.
13. חשב את כמות השומנים הנדרשת ליחס שומנים לחלבון של 10:1 (LPR-mol/mol). ממלאי כלורופורם, הוסף את הכמות הנדרשת של שומנים, כפי שחושב בשלב 2.12, לבקבוק תחתון עגול של 100 מ"ל (RBF). פנה את הכלורופורם מה-RBF תחת זרם עדין של חנקן. הנח RBF על ואקום גבוה למשך 3 שעות. לחות את שכבת השומנים עם 1 מ"ל של Buffer 7. דגירה RBF למשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
14. מוסיפים את תערובת החלבון (משלב 2.12) ל-RBF.
15. מדללים את תערובת החלבון/שומנים (משלב 2.14) לנפח הסופי של 50 מ"ל ב-RBF. יש להשתמש ב-Buffer 7 בתוספת מעכב פרוטאז 1x המומס ב-DMSO ולדגור למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.
16. דיאליזה כנגד 100 נפחים של Buffer 7 למשך שבועיים (השתמש בצינורות דיאליזה מנותקים במשקל מולקולרי של 12-14 kDa). במשך 24 השעות הראשונות, בצע את הדיאליזה בטמפרטורת החדר בתוספת Buffer 7 טרי כל 8 שעות. לאחר מכן, החלף את המאגר פעם ביום, ובצע דיאליזה ב-4 מעלות צלזיוס.

3. מילוי רוטור ssNMR

1. לאחר שלב 2.16, צנטריפוגה למשך 30-60 דקות ב-10,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס כך שנוצרת גלולה. הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה.
   הערה: הטכניקה הנדונה להלן עברה אופטימיזציה עבור רוטור 3.2 מ"מ אך היא ישימה כמעט לכל קוטר רוטור.
2. שפכו את הדגימה לתוך הרוטור וסובבו אותה בעדינות עם צנטריפוגה שולחנית.
   הערה: בהתאם לעקביות הדגימה, ניתן להשתמש בכלי צפיפות כדי לדחוס את הדגימה, או במרית במקום פיפטה כדי להכניס את הדגימה לרוטור.
3. חזור על תהליך זה 2-3x עד למילוי הרוטור לגובה הנכון ובדוק אם נותר מספיק מקום למכסה, כפי שמצוין על ידי קו הסמן בכלי הצפיפות. סגור את הרוטור עם כלי מיקום המכסה על משטח אחיד. סמן מחצית מהקצה התחתון של הרוטור.
   הערה: דורות חדשים של רוטור ssNMR מגיעים עם סימן לייזר עמיד בקצה התחתון לזיהוי אופטי של תדר סיבוב הרוטור. אחרת, מוצע להשתמש בעט חד; מכיוון שגלאי MAS עבר אופטימיזציה במיוחד עבור דיו Sharpie.
4. השתמש בזכוכית מגדלת כדי לבדוק אם המכסה ממוקם היטב.

4. אפיון מדגם על ידי ספקטרוסקופיה דו-ממדית ^{13 C-13}C ssNMR

1. הכנס את הרוטור למגנט, באמצעות שגרת הסיבוב האוטומטית של יחידת ה-MAS, סובב את הדגימה עד לתדר ה-MAS הרצוי בין 10 ל-20 קילו-הרץ MAS תוך קירור הדגימה לטמפרטורה מוגדרת של 270 K. כוונו והתאימו את ערוצי ¹H ^ו-13C.
   הערה: לבחירת תדר MAS, הימנע מהתאמה בטעות של מרחק ההסטה הכימית בין אזור Cα הספקטרלי לאזור הפחמן קרבוניל לתדר הסיבוב, כלומר, הימנע ממצב תהודה סיבובית מסדר ראשון⁴¹.
2. בצע אופטימיזציה של ניסוי ^קיטובצולב 1 ^H-13C⁴² (CP) על ידי שינוי הספק ה-rf בתעלת הפרוטונים מ-25-80 קילו-הרץ. פרמטרים אופייניים הם הספק RF של 45 קילו-הרץ ^ב-13C, 80-100 קילו-הרץ הטרו-גרעיני ¹ניתוק H⁴³ במהלך הרכישה, עיכוב מיחזור של 1.8-2.0 שניות ו-64 סריקות.
   1. בצע אופטימיזציה של זמן המגע של CP לרגישות אות מקסימלית על הפחמנים האליפטיים.
   2. קבע אורך דופק ^{של 1}H 90° בניסוי ¹³C-CP על ידי הכפלת דופק ההתחלה בארבע, כלומר על ידי אופטימיזציה של דופק 360°, ושנה את האורך עד שהאות ייעלם. כלול דופק מלבני ישירות לאחר העברת ה-CP ומטב את אורך הדופק ^{של 13}C 90° באופן אנלוגי.
3. הפעל ניסוי דו-ממדי ^{13 C-13}C מונע ספין דיפוזיה (PDSD) כגון PARIS עם זמן העברת מגנטיזציה של 30 אלפיות השנייה כדי לזהות מתאמים תוך-שיוריים ולמדוד את איכות הדגימה. העבר את רמות ההספק, זמן המגע ואורכי הפולסים של 90° מניסוי ¹³C-CP המותאם בעבר. השתמש בזמן רכישה של 4-6 אלפיות השנייה בממד העקיף. עבד את הספקטרום עם פונקציות פעמון חטא בריבוע (QSIN) או, עבור דגימות לא רגישות, הרחבת קו מעריכי בשני הממדים.
4. חלץ פרוסות של פסגות צולבות מבודדות וקבע את רוחב הקו בחצי גובה. רוחב קו בין ~0.3-1.0 ¹³C ppm מעיד על מדגם מסודר היטב, אידיאלי לאפיון ssNMR, בעוד שרוחב קו מעל 1.0 ¹³C ppm מעיד על הטרוגניות קונפורמציה שעלולה לפגוע באפיון ssNMR. ספקטרום 2D CC PARIS של BamA המוצג באיור 3A הוא דוגמה לחלבון מסודר היטב שנותן ספקטרום באיכות גבוהה.

5. הקצאת עמוד שדרה ^{על ידי}ספקטרוסקופיה תלת מימדית ssNMR 1 שזוהתה H

1. רכישת טביעות אצבע ספקטרליות דו-ממדיות של NH
   1. מלאו את הדגימה ברוטור 1.3 מ"מ, כמתואר לעיל. הכנס את הרוטור למגנט, סובב את הדגימה ל-10-20 קילו-הרץ MAS וקרר את הדגימה לטמפרטורה מוגדרת של 240-250 K ומטה, בהתאם למפרט של ראש הבדיקה ssNMR. השתמש בממשק יחידת MAS כדי להגדיל את תדר ה-MAS בהדרגה בשלבים של 5 קילו-הרץ עד 60 קילו-הרץ MAS.
   2. בצע אופטימיזציה של אמפליטודות ה-CP, זמני המגע ואורכי הדופק של 90° בניסויי CP של ¹³C ^ו-15N CP. השתמש באמפליטודות בסביבות 30-50 או 70-100 קילו-הרץ בערוצים ההטרו-גרעיניים ושנה את המשרעת בערוץ ^{H 1}מ-80-180 קילו-הרץ. השתמש בעיכוב מיחזור של 0.7-1.2 שניות, יחד עם ניתוק פרוטון הטרו-גרעיני בהספק נמוך של 15 קילו-הרץ⁴⁴. כמו כן, ראה התייחסות⁴⁵ לפרטים מעשיים נוספים על אופן הגדרת ניסויי CP ssNMR.
   3. רכוש ניסוי NH דו-ממדי כדי לאמוד את רזולוציית ¹H. העבר את ¹⁵הפרמטרים של N-CP והשתמש בזמן רכישה של כ-15 ו-25 אלפיות השנייה בממדים הישירים והעקיפים. עבור ההעברה הראשונה של ¹שעות עד ¹⁵N CP, השתמש בזמן המגע הממוטב בעבר. עבור העברה לאחור של ¹⁵N עד ¹H, השתמש בזמן מגע של 0.7-1.0 ms כדי למזער את העברת המגנטיזציה הבין-שיורית.
   4. השתמש בדיכוי מים של 50-250 אלפיות השנייה MISSISSIPPI⁴⁶, תלוי בתכולת המים לדוגמה. עבד את הספקטרום עם פונקציות פעמון חטא בריבוע (QSIN) בשני הממדים. חלץ פרוסות של פסגות צולבות מבודדות וקבע את רוחב הקו בחצי גובה. דוגמה לספקטרום NH דו-ממדי^{איכותי 25} מוצגת עבור BamA-P4P5 משובץ ממברנה באיור 3B.
2. הקצאות עמוד שדרה
   1. בצע אופטימיזציה של ניסוי CP ספציפי ^{1D 15}N עד ¹³Cα⁴⁷. מקם את מנשא ^ה-13C באמצע אזור Cα בסביבות 55 עמודים לדקה. השתמש במשרעת RF ^{של 13}C של 20 קילו-הרץ ושנה את משרעת ^ה-15N מ-35 עד 45 קילו-הרץ להעברה מקסימלית לאותות Cα והעברה מינימלית לאותות הקרבוניל. מטב את זמן המגע מ-3 עד 10 אלפיות השנייה במרווחים של 1 אלפיות השנייה.
   2. הפעל ניסוי CαNH תלת מימדי. העבר את כל אמפליטודות ה-CP, זמני המגע ואורכי הדופק מהשלבים המותאמים בעבר. השתמש בכ-10 אלפיות השנייה ו-30 אלפיות השנייה בממדי הרכישה העקיפה והישירה. עבד את הספקטרום עם פונקציות פעמון חטא בריבוע (QSIN) בכל שלושת הממדים.
   3. בצע אופטימיזציה של העברת מגנטיזציה 1D Cα ל-CO DREAM⁴⁸. התחל עם העברת CP ספציפית של ¹⁵N עד ¹³Cα. לאחר מכן, העבירו את המגנטיזציה מ-Cα ל-CO באמצעות נעילת ספין בערוץ ¹³C. שנה את משרעת ה-rf מ-20 ל-35 קילו-הרץ להעברה אופטימלית. בצע אופטימיזציה של זמן ההעברה מ-4 ל-10 אלפיות השנייה.
   4. הפעל ניסוי תלת מימד Cα(CO)NH. העבר את כל אמפליטודות ה-RF, זמני המגע ואורכי הפולסים מהשלבים המותאמים בעבר. השתמש בכ-10 אלפיות השנייה ו-30 אלפיות השנייה בממדי הרכישה העקיפה והישירה. עבד את הספקטרום עם פונקציות פעמון חטא בריבוע (QSIN) בכל שלושת הממדים.
   5. חזור והתאם את שלבים 1-4 עבור ניסויי CONH ו-CO(Cα)NH התלת-ממדיים האנלוגיים. השתמש ברביעייה זו של ניסויים תלת מימדיים עבור הליכות Cα ו-CO עוקבות כדי להקצות את עמוד השדרה של החלבון, כפי שמוצג בדוגמה של KcsA באיור 4²⁸.

6. דינמיקת חלבונים על ידי ספקטרוסקופיה ssNMR שזוהתה ^ב-H1

1. עבור ¹⁵מחקרי N T₁ , השתמש בניסוי NH הדו-ממדי המותאם בעבר ב-60 קילו-הרץ MAS וכלול עיכוב לאחר שלב הקיטוב הצולב הראשון של ¹H עד ¹⁵N. רכוש סדרה של ניסויי NH דו-ממדיים ושנה את העיכוב מ-0 ל-16 שניות באמצעות שלבים של, למשל, 0, 2, 4, 8 ו-16 שניות.
2. שרטט את העוצמות המנורמלות עבור אותות שנפתרו כפונקציה של זמן ההשהיה ההולך וגדל. התאימו את הדעיכה של T₁ לאקספוננציאלים בודדים לפי y = exp^(-x/T1), כאשר y היא עוצמת האות בזמן הדעיכה x.
3. באופן אנלוגי, עבור ^{מחקרי 15}N T_1rho, כלול פולס נעילת ספין בתוכנית הפולסים בערוץ ¹⁵N עם משרעת rf בין 15-20 קילו-הרץ לאחר שלב הקיטוב הצולב הראשון ^{של 1}H עד ¹⁵N^26,49. רכשו סדרה של ניסויי NH דו-ממדיים ושנו את העיכוב מ-0 ל-150 אלפיות השנייה והתאימו את דעיכת ה-T_1rho של אותות שנפתרו לאקספוננציאלים בודדים. נתוני המחשה ¹⁵N T_1rho מוצגים עבור תעלות K⁺ משובצות ממברנה באיור 5^27,28.

7. קיטוב גרעיני דינמי

הערה: שלבי ההכנה הבאים מתייחסים לשימוש במערכי DNP מסחריים המשתמשים ברוטורי MAS ספיר 3.2 מ"מ (איור 6)²⁰. שימוש ברוטורים של זירקוניה או בציוד DNP אחר עלול להוביל לשיפורי אות DNP נמוכים יותר.

1. השעו מחדש את גלולת חלבון הממברנה (משלב 3.1) ב-50 מיקרוליטר של מאגר DNP דוטראט (60% (v/v) d8- וגליצרול, ו-15 מ"מ AMUPol⁵⁰. לניסויים ב-800 מגה-הרץ, אנו ממליצים להשתמש ב-10 מ"מ NATriPOL-3⁵¹. ראה גם התייחסות⁵² להיבטים מעשיים נוספים לניסויי DNP ssNMR.
2. צנטריפוגה למשך 10-20 דקות ב-100,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס כך שנוצרת גלולה. הסר את הסופרנטנט בעזרת פיפטה.
3. יש לקרר מראש את המתאם הצנטריפוגלי ואת רכיבי הרוטור MAS ספיר 3.2 מ"מ ל-<4 מעלות צלזיוס. יש לבצע את השלבים הבאים (7.4-7.7) במהירות האפשרית כדי למנוע את הפחתת סוכני ה-DNP.
4. הנח את רוטור הספיר 3.2 מ"מ במתאם הצנטריפוגה ומלא אותו בהשעיה של פרוטאו-ליפוזומים משלב 7.2.
5. שלף את דגימת חלבון הממברנה הממושעה כנגד הדופן הפנימית של הרוטור בזהירות באמצעות קצה פיפטה של 200 מיקרוליטר. אפשר לתמיסה להחליק מטה לתחתית הרוטור. ודא שלא נוצרות בועות אוויר.
6. סובב את הדגימה ברוטור למשך 5-10 דקות ב-4,500 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. הסר את הסופרנטנט המכיל עודף מיץ DNP על ידי הוצאתו החוצה בזהירות מבלי לשבש את כדורית התא. חזור על שלבים 6.4-6.6 עד שהרוטור מלא.
7. מקם בזהירות את מרווח הפוליטטרפלואורואתילן (PTFE) באמצעות בורג המרווח על גבי הרוטור.
8. הנח את הרוטור, צד המכסה כלפי מטה בבוכנה של רוטור⁵³ וצלל את הרוטור לחנקן נוזלי. אפשר לפחות 30-60 שניות עד שהרוטור והדגימה יקפאו.
9. הפעל את יחידת מחליף החום וקרר את בדיקת ה-DNP ל-~90K.
10. הגדר את יחידת ה-MAS למצב ידני והגדר את הטמפרטורה המשתנה (VT) ל-135 ליטר לשעה ואת זרימת הגז הנושאת והמניעה ל-~6 ליטר לשעה.
11. הפעל את Eject בקונסולת MAS.
12. העבירו את הדגימה הקפואה משלב 7.8 מהנוזל N2 לתוך לוכד הדגימות והניחו אותה בבדיקה (ראה גם התייחסות⁵³).
13. הגדל ידנית את לחץ מיסב הבדיקה (Bp) ל-~500 mbar לפני הפעלת "הכנס". זה רצוי לסיבוב יציב ובטוח של הרוטור.
14. הגדל את קצב ה-MAS לערך הרצוי באמצעות ההליך המתואר בהתייחסות⁵³.
15. בדוק אם יש שיפורי DNP עם ובלי מיקרוגל באמצעות ניסויי CP 1D סטנדרטיים (ראה גם, למשל, התייחסות ^51,54) (איור 7) לפני שתמשיך בניסויים רב-ממדיים, למשל, ניסויי CC דו-ממדיים המתוארים בסעיף 3 של מאמר זה.

תוצאות

איור 2 מציג ג'לים מייצגים לטוהר גוף ההכללה (פאנל A) וקיפול מחדש של גופי הכללה (פאנל B3). איור 2 מאשר את הטיהור המוצלח של ^{13 C,15}BamA-P4P5 עם תווית N.

איור 3A מציג ספקטרום 2D ^{13 C-13}C טיפוסי של חלבון ממברנה מסודר היטב, ואיור 3B מציג ספקטרום 2D ¹⁵N¹H טיפוסי ואיכותי של חלבון ממברנה perdeuterated^2...

דיון

חלבוני ממברנה הם שחקני מפתח בוויסות תפקודים תאיים חיוניים הן באורגניזמים פרוקריוטיים והן באורגניזמים אוקריוטיים; לפיכך, יש חשיבות חיונית להבנת מנגנוני הפעולה שלהם ברמות הרזולוציה האטומיות. הטכניקות הקיימות של ביולוגיה מבנית דחפו את ההבנה המדעית של חלבוני הממברנה די רחוק, אך הסתמכו במידה רבה על נתונים ניסיוניים שנאספו ממערכות מבחנה נטולות ממברנות. במאמר זה מוצגת גישה ניסויית המאפשרת לקבל תובנה אטומיסטית לגבי המבנה והתפקוד של שני חלבוני ממברנה חיידקיים המשובצים בממברנה דמוית ילידים על ידי ...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
אמוניום מוליבדט	Merck	277908
אמוניום-15N כלוריד	קורטקנט	CN80P50
אמפיצילין	סיגמא אולדריץ'	A9518
AMUpol	Cortecnet	C010P005
בנזונאז	EMD Millipore Corp	70746-3
חומצה בורית	Merck	B6768
ברומופנול כחול	סיגמא	B0126
סידן דיכלוריד	Merck	499609
כולין כלוריד	Sigma	C-1879
קובלט כלוריד	Merck	449776
נחושת גופרתית	Merck	C1297
D-ביוטין	Merck	8512090025
תחמוצת דאוטריום	Cortecnet	CD5251P1000
דימתיל סולפוקסיד	Merck	D9170
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma Aldrich	L6876
חומצה פולית	Sigma	F-7876
גלוקוז 13C + 2H	Cortecnet	CCD860P50
גליצרול	Honeywell	G7757
גליצרול (12C3, 99.95% D8, 98%)	Eurisotope	CDLM-8660-PK
גליצרול (לא מועשר)	Honeywell	G7757-1L
גליצין	סיגמא אולדריץ'	50046
גואנידין הידרוכלוריד	רוט קארל	NR.0037.1
ברזל גופרתי	Merck	307718
איזופרופיל ובטא;-D-1-thiogalactopyranoside	Thermofisher	R0392
מרק ליזוגני	Merck	L3022
Lysozyme	Sigma Aldrich	L6876
מגנזיום כלוריד - הקסהידרט	Fluka	63064
מגנזיום סולפט	Merck	M5921
מונופוטסיום פוספט	Merck	1051080050
Myoinositol	Sigma	I-5125
N-Dodecyl-B-D-maltoside	Acros Organics	3293702509
N,N-Dimethyldodecylamine N-oxide	Merck	40236
Nicatinamide	Sigma	N-3376
חומצה פנטוטנית	Sigma	21210-25G-F
מעכב פרוטאז	Sigma	P8849
פירידוקסל-הידרוכלוריד	סיגמא אולדריץ'	P9130
ריבופלבין	אולדריץ	R170-6
נתרן כלורי	Merck	K51107104914
נתרן דימימן פוספט - מונוהידראט	סיגמא אולדריץ'	1,06,34,61,000
נתרן דודציל סולפט	תרמו-מדעי	28365
נתרן הידרוקסיד	Merck	1,06,49,81,000
סוכרוז	סיגמא מדעי החיים	S9378
תיאמין-HCl	Merck	5871
Tris-HCl	Sigma Aldrich	10,70,89,76,001
אבץ כלוריד	Merck	208086
E.coli BL21 DE3*	New England Biolabs	C2527
1.5 מ"ל צינורות אולטרה	בקמן קולטר	357448
30 kDa מסנן צנטריפוגלי	Amicon	UFC903024
3.2 מ"מ ספיר DNP רוטור עם כובעים	Cortecnet	H13861
3.2 מ"מ תוספת טפלון	Cortecnet	B6628
3.2 מ"מ אורז/פורק מדגם	Cortecnet	B6988
3.2 מ"מ קיר רגיל MAS רוטור	Cortecnet	HZ16913
3.2 מ"מ רוטור MAS קיר רגיל	Cortecnet	HZ09244
ערכת כלי עבור 3.2 מ"מ רוטור קיר דק	Cortecnet	B136904
רוטור MAS 1.3 מ"מ + כובעים	Cortecnet	HZ14752
1.3 מ"מ כלי מילוי	Cortecnet	HZ14714
1.3 מ"מ אורז מדגם	Cortecnet	HZ14716
מסיר כובע 1.3 מ"מ	כלי סט כובע Cortecnet	HZ14706
1.3 מ"מ		Cortecnet
12-14 kDa	Spectra/Por	132703
Sharpie - שחור	Merck	HS15094