כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי ליצור ולהרחיב בחוזקה קרדיומיוציטים אנושיים מתאי דם היקפיים של מטופלים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ייצור והרחבה של קרדיומיוציטים אנושיים מתאי דם היקפיים של מטופלים
במאמר זה
סיכום
תקציר
יצירת קרדיומיוציטים ספציפיים למטופלים מהגרלת דם אחת משכה עניין עצום ברפואה מדויקת על מחלות לב וכלי דם. הבחנה לבבית מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם (iPSCs) מווסתתת על ידי מסלולי איתות מוגדרים החיוניים להתפתחות הלב העוברי. שיטות שונות לבידול לב על פלטפורמות 2-D ו 3-D פותחו עם יעילות שונים ותפוקת cardiomyocyte. זה יש חוקרים תמוהים מחוץ לתחום כמו מגוון של שיטות אלה יכול להיות קשה לעקוב. כאן אנו מציגים פרוטוקול מקיף המפרט ייצור חזק והרחבה של קרדיומיוציטים ספציפיים למטופל מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs). ראשית אנו מתארים פרוטוקול תכנות מחדש IPSC יעילות גבוהה מדגימת הדם של המטופל באמצעות וקטורים וירוס סנדאי ללא שילוב. לאחר מכן אנו מפרטים שיטת בידול מונו-שכבתית קטנה בתיווך מולקולה שיכולה לייצר קרדיומיוציטים מכים מרוב קווי ה- iPSC האנושיים. בנוסף, פרוטוקול הרחבת קרדיומיוציטים מדרגי מוצג באמצעות מולקולה קטנה (CHIR99021) שיכולה להרחיב במהירות קרדיומיוציטים שמקורם בחולים עבור יישומים ברמה תעשייתית וקלינית. בסוף, פרוטוקולים מפורטים לזיהוי מולקולרי ואפיון אלקטרופיזיולוגי של iPSC-CMs אלה מתוארים. אנו מצפים פרוטוקול זה להיות פרגמטי למתחילים עם ידע מוגבל על התפתחות הלב וכלי הדם וביולוגיה של תאי גזע.
מבוא
גילוי תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים על ידי האדם חולל מהפכה ברפואת הלב וכלי הדם המודרנית1,2. IPSCs אנושיים מסוגלים לחדש את עצמם וליצור את כל סוגי התאים בלב, כולל cardiomyocytes, תאי אנדותל, תאי שריר חלקים פיברובלסטים לב. קרדיומיוציטים שמקורם ב- iPSC (iPSC-CMs) יכולים לשמש כמשאבים בלתי מוגבלים למידול מחלות לב וכלי דם תורשתיות גנטית (CVDs) ובדיקת בטיחות הלב לתרופות חדשות3. בפרט, iPSC-CMs המטופל צפויים היטב לחקור אטיולוגיות גנטיות ומולקולריות של קורות חיים שמקורם פגמים cardiomyocytes, כגון תסמונת QT ארוכה4 וקרדיומיופתיה המופרדת (DCM)5. בשילוב ע....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הפרוטוקולים הניסיוניים וההסכמה מדעת לנבדקים אנושיים אושרו על ידי ועדת הבדיקה המוסדית (IRB) בבית החולים הלאומי לילדים.
1. הכנת מדיה, פתרונות וריאגנטים של תרבות התאים
- הכנת מדיית PBMC
- לערבב 20 מ"ל של מדיה תרבות PBMC בזאלי (1x) ו 0.52 מ"ל של תוספת. הוסף 20 μL של SCF ו FLT3 כל אחד (ריכוז מלאי: 100 מיקרוגרם / מ"ל), 4 μL של IL3, IL6 ו- EPO כל אחד (ריכוז מלאי: 100 מיקרוגרם / מ"ל) ו 200 μL של חלופת L-גלוטמין (100x). מערבבים אותם ביסודיות. מסנן במכסה המנוע הסטרילי באמצעות יחידת סינון 0.22-μm. תן שם לזה כמדיה מלאה בדם.
- ערבבו 20 מ"ל של מדיה תרבותית PBMC בזאלית (1x) ו-0.52 מ"ל של התוספת. הוסף 200 μL של חלופה L-גלוטמין (100x)....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תכנות מחדש של IPSC אנושי ממחשבים אישיים
לאחר טרום-תרבות עם מדיית דם מלאה במשך 7 ימים, מחשבים אישיים הופכים גדולים עם גרעינים גלויים וציטופלסמה (איור 1B), המציין שהם מוכנים להדבקת וירוסים. לאחר טרנספקט עם גורמי תכנות מחדש של וירוס סנדאי, מחשבי PBMCs יעברו תהליך תכנות מחדש אפיגנטי למשך שבוע נוסף. בדרך כלל, אנו מקבלים 30-50 מושבות iPSC מההדבקה של 1 x 105 מחשבים אישיים ויעילות התכנות מחדש היא 0.03%-0.05%. תאים המתוכנתים מחדש לחלוטין.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במהלך תכנות מחדש של IPSC, זה קריטי לתרבות PBMCs במשך שבוע אחד עד שהם מוגדלים עם גרעינים ברורים ציטופלסמה. מאחר שמחשבי PBMCs אינם מתרבים, מספר תא מתאים עבור התמרה ויראלית חשוב לתכנות מחדש מוצלח של iPSC. מספר התא של מחשבים אישיים, ריבוי של זיהום (MOI) ו titer של וירוס צריך להיחשב ולהתאים כדי להגיע לתוצאות התמולה אופטימלית. עבור הבחנה לבבית, צפיפות זריעה ראשונית היא קריטית עבור IPSCs להגיע מעל 90% confluent ביום שבו CHIR99021 מנוהל. מצד אחד, אם IPSCs הם פחות מפגש בזמן בידול לב, CHIR99021 יהיה רעיל ולהוביל למוות תאים משמעותי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
מחקר זה נתמך על ידי האגודה האמריקאית ללב (AHA) קריירה פיתוח פרס 18CDA34110293 (M-T.Z.), מיזמים נוספים AVIF ו- SVRF פרסים (M-T.Z.), המכונים הלאומיים לבריאות (NIH / NHLBI) מענקים 1R01HL124245, 1R01HL132520 ו R01HL096962 (I.D.). ד"ר מינג-טאו זאו נתמך גם על ידי קרנות סטארט-אפ ממכון המחקר אביגיל וקסנר בבית החולים הלאומי לילדים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ABI 7300 מהיר בזמן אמת PCR מערכת | תרמו פישר מדעי | ||
| אקסון Axopatch 200B מגבר מיקרואלקטרודה | מכשירים | מגבר מיקרואלקטרודה | |
| תוסף B27 תרמו | פישר סיינטיפיק | 17504044 | |
| תוסף B27 מינוס אינסולין | תרמו פישר מדעי | A1895601 | |
| BD ציטופיקס / ציטופרם ערכת קיבוע/פרמביליזציה | BD Biosciences | 554714 | פתרון קיבוע/פרמביליזציה, מאגר סלסול/שטיפה |
| BD ואקוטיינר צינור CPT | BD Biosciences | 362753 | צינור הפרדת תאי דם |
| CHIR99021 | Selleck Chemicals | S2924 | |
| CytoTune-iPS 2.0 Sendai ערכת תכנות מחדש | Thermo Fisher Scientific | A16517 | ערכת תכנות מחדש של וירוס סנדאי |
| Digidata 1200B | Axon Instruments | Acquisition Board | |
| Direct-zol RNA Miniprep kit | Zymo Research | R2050 | ערכת מיצוי RNA |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | |
| Essential 8 בינוני | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | E8 מדיה לתרבית iPSC |
| תוסף GlutaMAX | תרמו פישר מדעי | 35050061 | אלטרנטיבה L-גלוטמין |
| גורם גדילה מופחת מטריג'ל | קורנינג | 356231 | מטריצת קרום הבסיס |
| iScript cDNA Snythesis Kit | Bio-Rad | 1708891 | סינתזת cDNA |
| IWR-1-endo | Selleck Chemicals | S7086 | |
| KnockOut Serum Replace (KSR) | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | |
| pCLAMP 7.0 | מולקולריים | אלקטרופיזיולוגיה תוכנה לרכישה וניתוח נתונים | |
| רקומביננטי אנושי EPO | Thermo Fisher Scientific | PHC9631 | |
| רקומביננטי אנושי FLT3 | Thermo Fisher PHC9414 | ||
| רקומביננטי אנושי IL3 | Peprotech | 200-03 | |
| רקומביננטי אנושי IL6 | Thermo Fisher Scientific | ||
| רקומביננטי אנושי SCF | Peprotech | 300-07 | |
| RPMI 1640 בינוני | תרמו פישר מדעי | 11875093 | |
| RPMI 1640 בינוני, ללא גלוקוז | תרמו פישר מדעי | 11879020 | |
| SlowFade זהב Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | S36936 | הרכבה מדיה |
| StemPro-34 SFM | Thermo פישר סיינטיפיק | 10639011 | PBMC תרבות מדיה |
| TaqMan מהיר מתקדם מאסטר מיקס | תרמו פישר מדעי | 4444964 | qPCR מאסטר |
| מיקס TrypLE Select אנזים 10x, ללא פנול אדום | תרמו פישר מדעי | A1217703 | CM תמיסת דיסוציאציה |
| UltraPure 0.5 M EDTA | תרמו פישר מדעי | 15575020 | תמיסת דיסוציאציה iPSC |
| Y-27632 2HCl | סלק כימיקלים | S1049 |
מקורות
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
