מאמר שיטה

זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-זנטרום ברלין

DOI:

10.3791/62208

⸱

3 במרץ 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Macromolecular Crystallography, Helmholtz-Zentrum Berlin, 2Structural Biochemistry Group, Institute for Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, 3BioMAX, MAX IV Laboratory, 4Drug Design Group, Institute of Pharmaceutical Chemistry, Philipps-Universität Marburg, 5Department Sample Environment, Helmholtz-Zentrum Berlin

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנת שברים קריסטלוגרפיים במלון הלמהולץ-זנטרום ברלין מתבצעת באמצעות זרימת עבודה עם ספריות מורכבות ייעודיות, כלי טיפול בגבישים, מתקני איסוף נתונים מהירים וניתוח נתונים אוטומטי ברובו. הפרוטוקול שהוצג מתכוון למקסם את התפוקה של ניסויים כאלה כדי לספק נקודות התחלה מבטיחות לתכנון ליגנד מבוסס מבנה במורד הזרם.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הקרנת קטעים היא טכניקה המסייעת לזהות נקודות התחלה מבטיחות לעיצוב ליגנד. בהתחשב בכך גבישים של חלבון היעד זמינים ולהציג תכונות עקיפת רנטגן ברזולוציה גבוהה, crystallography היא בין השיטות המועדפות ביותר עבור הקרנת שבר בגלל הרגישות שלה. בנוסף, זוהי השיטה היחידה המספקת מידע תלת-ממדי מפורט על מצב הכריכה של הקטע, החיוני להתפתחות המורכבת הרציונלית הבאה. השימוש השגרתי בשיטה תלוי בזמינותן של ספריות שברים מתאימות, באמצעים ייעודיים לטיפול במספר רב של דגימות, בקווי סינכרוטרון חדישים למדידות עקיפה מהירות ופתרונות אוטומטיים בעיקר לניתוח התוצאות.

כאן, זרימת העבודה המעשית המלאה והכלים הכלולים כיצד לנהל הקרנת שברים קריסטלוגרפיים (CFS) בהלמהולץ-זנטרום ברלין (HZB) מוצגים. לפני זרימת עבודה זו, תנאי השריית קריסטל, כמו גם אסטרטגיות איסוף נתונים ממוטבים לניסויים קריסטלוגרפיים הניתנים לשחזור. לאחר מכן, בדרך כלל בהליך של יום עד יומיים, ספריה ממוקדת CFS בת 96 חברים המסופקת כמו צלחות מוכנות לשימוש מיובשות משמשת להשריית 192 גבישים, אשר לאחר מכן מקוררים בנפרד. ניסויי עקיפה הסופי יכול להתבצע בתוך יום אחד על הרובוט הרכבה קו הקורות נתמך BL14.1 ו BL14.2 בטבעת אחסון אלקטרונים BESSY II המופעל על ידי HZB בברלין אדלרסהוף (גרמניה). עיבוד הנתונים הקריסטלוגרפיים, עידון מבני החלבון וזיהוי הלהיטים הוא מהיר ואוטומטי ברובו באמצעות צינורות תוכנה מיוחדים בשרתים ייעודיים, הדורשים קלט משתמש מועט.

שימוש בזרימת העבודה של CFS ב- HZB מאפשר ניסויי סינון שגרתיים. זה מגדיל את הסיכויים לזיהוי מוצלח של להיטים שבר כנקודות התחלה לפתח קלסרים חזקים יותר, שימושי עבור יישומים תרופתיים או ביוכימיים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הצעד הראשון בפיתוח תרופות הוא סינון של תרכובות נגד יעד של עניין. באופן מסורתי, ספריות מורכבות גדולות בסדר גודל של 100,000-1,000,000 ערכים משמשות מבחנים ביוכימיים בתפוקה גבוהה בתעשיית התרופות. אסטרטגיה זו הושלמה על ידי עיצוב תרופות מבוססות שברים (FBDD), שיטה חדשה יותר אשר לקח עלייה תלולה במהלך 20 השנים האחרונות והפך אסטרטגיה המיינסטרים לייצר מועמדים מובילים באיכות גבוהה בשל מספר יתרונות אינהרנטיים של השיטה1. המונח "שבר" מתייחס למולקולה אורגנית קטנה המכילה בדרך כלל פחות מ -20 אטומים שאינם מימן או כבדים (HAs). לכן, שבר הוא קטן משמעותית מאשר מולקולות כמו תרופה או עופרת (בדרך כלל פחות מ 30 HAs) נחקר בהקרנה תפוקה גבוהה קונבנציונלית. שברים הם קלסרים בעלי זיקה חלשה. עם זאת, בהשוואה למולקולות גדולות יותר, שברים הם מגוונים יותר, שכן אפילו אוסף קטן שלהם יכול לייצג טוב יותר את המרחב הכימי בהתאמה של מולקולות באותו גודל2. כמו כן, סינון שברים מתפתחים למולקולות עופרת הוא הרבה יותר יעיל מאשר אופטימיזציה כבר מולקולות גדולותיותר 2,3,4,5. כלומר, בהמתנה לרגישות מספקת של הגילוי, ניתן להפעיל סינון של שברים ביעילות ומניב נקודות התחלה באיכות גבוהה לאבולוציה מורכבת נוספת. ניתן ליישם מספר שיטות ביופיזיות להקרנת שברים, הפופולרי ביותר הוא תהודה מגנטית גרעינית, קריסטלוגרפיה רנטגן, תהודה פלסמון פני השטח ובדיקות תרמיות. שיטות אלה משמשות במקביל או ברצף, במטרה להגביר את האמון בלהיטים ולהפחית את מספר התוצאות החיוביות הכוזבות או השליליות הכוזבות, בהתאמה. עם זאת, מחקר השוואתי שנערך לאחרונה6 הציע כי יש להימנע מפלים סינון רציף בשל חפיפה נמוכה בין השיטות השונות.

קריסטלוגרפיה רנטגן היא שיטה מבוססת היטב לקביעת מבנה בפירוט אטומי, אך לאחרונה פותחה גם ככלי לסינון למטרות7,8. כמו גבישי חלבון לסבול ריכוזי שבר גבוהים (למשל, 100 מ"מ), הקרנת שבר קריסטלוגרפי (CFS) יכול להתחרות עם שיטות ביופיזיות אחרות עבור שברי הקרנה או אפילו ביצועים טובים יותר מהם כשיטת סינון צעד ראשון6,9. עם זאת, חיוני מראש הנדרש עבור CFS היא מערכת התגבשות מאומתת של חלבון היעד לשחזור אספקת גבישים עם תכונות עקיפה ברזולוציה גבוהה במידה ניכרת, בדרך כלל טוב יותר מאשר 2 Å.

יתרון בלעדי של CFS בהשוואה לכל מתודולוגיות סינון שברים אחרות הוא מתן מידע תלת-ממדי מפורט על מצב האיגוד של הקטעים שזוהו. מידע מבני זה הוא חיוני לחלוטין עבור אופטימיזציה רציונלית של להיטים שבר לקלסרים זיקה גבוהה יותר. אסטרטגיות פירוט מבוססות גדלות, מתמזגות ומקשרות להיטים5. ובכך יעילות ליגנד גבוהה יחסית מסופקת מההתחלה, ואת המבוא של קבוצות מיותרות או מרחבי לא מתאים ניתן להימנע, ובכך להפחית את עלויות הסינתזה הכימית. בסך הכל, ל-CFS יש יתרונות ללא תחרות כאסטרטגיה התחלתית לעיצוב תרופות.

בהתחשב בכך יעד ביולוגי מסוים עונה על הדרישות הגבוהות של CFS לגבי איכות הגביש, ישנם כמה גורמים עיקריים למקסם את הסיכויים לתוצאה מוצלחת של מסעות סינון כאלה. זה תלוי באיכות ספריית הקטעים המשמשת, בזרימת עבודה יעילה לביצוע הניסויים לפני ניסוי עקיפה, על קורות סינכרוטרון עם אוטומציה מספקת ומהירות איסוף נתונים, כמו גם על דרכים ואמצעים לעיבוד וניתוח נתונים אוטומטיים ברובם. כאן מוצגת זרימת העבודה המלאה מניסויי השריית הגבישים ועד לזיהוי הלהיט, באופן שבו היא הוקמה בהצלחה בקרני הקריסטלוגרפיה המקרומולקולרית ב-BESSY II(איור 1). המתקן פתוח למשתמשים אקדמיים ותעשייתיים לשיתוף פעולה. בנוסף, משתמשים אקדמיים של מדינות האיחוד האירופי מחוץ לגרמניה יכולים להגיש בקשה ישירה למימון באמצעות פרויקט גילוי iNEXT.

ישנם תנאים מוקדמים הכרחיים כדי להיות מסוגל להתחיל קמפיין CFS ולנהל את הפרוטוקול המתואר בעבודה זו: גבישים מפוזרים היטב של חלבון היעד זמינים כי ניתן לגדל באופן לשחזור במספרים גדולים, כי הם יציבים בטמפרטורת הסביבה, וכי גדלו באמצעות קוקטייל התגבשות ללא מרכיבים נדיפים מאוד. תנאי מוקדם נוסף הוא התאמת סריג הגביש לניסוי. בסריג מתאים, האתרים המעניינים של חלבון היעד חייבים להיחשף לכיוון ערוצי הממס ובכך נגישים. צעד קודם נוסף שהוא אופציונלי אך בכל זאת מומלץ מאוד להבטיח הצלחה בזרימת העבודה של קמפיין CFS הוא אופטימיזציה של תנאי ההשריה לניסוי. סטטיסטיקות אמת מידה חיוניות כאן הן כוח עקיפה של הגביש ומחווני איכות הנתונים הרלוונטיים, אשר נקבעים במהלך הליך שינוי קנה המידה של הנתונים. גורמים אופייניים למיטוב הם עמידות DMSO, ריכוז מאגר ומגן קריו. אמנם לא תנאי מוקדם קפדנית כמפורט להלן, DMSO כממס שותף יכול לעזור להגדיל את solubilization שבר. בדיקות אופייניות צריכות לכלול השרייה של 0, 3, 6, או 10% (v / v) DMSO לילה. עלייה של ריכוז החיץ ל 200 או 300 מ"ר מסייעת במניעת אובדן באיכות עקיפה עקב השפעות מזדמנות של הסטת pH הנובעות מריכוזי שברים גבוהים לשימוש. לבסוף, זה מכריע כדי לגלות אם ואיזה cryoprotectant נוסף נדרש ואם זה כבר יכול להיכלל במצב השרייה. במקרים רבים, עם זאת, אין צורך במגן קריו נוסף, מכיוון ש- DMSO עצמו יכול לשמש כמגן קריו. אם כן, זה יחסוך שלב טיפול אחד בניסוי הסופי. רוב הגבישים זקוקים לפחות מגן קריו אם מקוררים בפלאש על לולאות בגודל מתאים, ממזערים או נמנעים ככל האפשר ממשקאות חריפים של האם שמסביב. עם זאת, במקרים נדירים, שכבה של משקאות חריפים האם אכן יש צורך למנוע נזק לקריסטל על קירור פלאש.

מספר הלהיטים שהושגו בקמפיין CFS אינו תלוי רק בסמים של חלבון היעד והתאמת סריג הגביש (ראה לעיל), אלא הוא תלוי גם באיכות הספרייה. איכות הספרייה מורכבת משני היבטים: בחירת התרכובות לספרייה וממתקים של התרכובות, (כלומר, באיזו צורה פיזית הן מוצגות לניסוי). לבחירה מורכבת ניתן צורך באסטרטגיות שונות. רוב עיצובי הספרייה כוללים את המקסימום של המגוון הכימי של השברים. מוקד אסטרטגי יכול להיות לכלול את המתיחה הכימית של שברי עבור עיצוב מעקב, אשר יושם למשל בספרייה יציבה יהלום-SGC-iNEXT10. מוקד אסטרטגי נוסף לעיצוב הספרייה יכול להיות למקסם את הייצוג של שטח כימי זמין מסחרית של שברים לפי קיבוץ באשכולות מבוססי צורה ופרמקופור, כפי שהודגם על ידי ספריות F2X שפותחו ב- HZB11. ליתר דיוק, הספרייה האוניברסלית F2X-Universal בת 1103 החברים וקבוצה משנה מייצגת של 96 תרכובות עבור קמפיינים ראשוניים של CFS, הנקראת מסך F2X-Entry, פותחו ומסך הכניסה F2X אומת בהצלחה11. מסך F2X-Entry הוא הבחירה העיקרית עבור קמפיינים של CFS ב- HZB. לאחר מכן, קמפיינים גדולים יותר יכולים להתבצע באמצעות ספריית F2X-Universal או ספריית הקטעים 1056-OPENSCREEN12 של האיחוד האירופי המוצעת גם היא ב- HZB. נכון לעכשיו, ספריות אלה זמינות עבור משתמשים של הקורות קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית של SYNCHROTron BESSY II בברלין ללא תשלום על בסיס חוזה שיתוף פעולה. זה חל גם על משתמשים באמצעות הצעות גילוי iNEXT. יתר על כן, מסך הכניסה F2X זמין לכל המדענים המעוניינים על בסיס הסכם העברת חומר.

ביחס להצגה הפיזית של ספריה, שתי גישות מאומצות בדרך כלל: הקטעים משמשים כפתרונות מלאי DMSO או שהשברים מיובשים ומשותקים על לוחות מוכנים לשימוש. ב- HZB, הן מסך F2X-Entry והן התרכובות הלא נדיפות של ספריית F2X-Universal מוצגים כתרכובות מיובשות בלוח התגבשות פרופיל נמוך MRC בעל 3 עדשות. להצגת השברים משותקים בלוחות התגבשות יש שני יתרונות חיוניים: ראשית, היא מאפשרת הובלת לוחות ההקרנה למעבדה הביתית של המשתמש. לכן, שלבי ההשריה והטיפול בגביש של זרימת העבודה המוצגים כאן (שלבים 1-3) יכולים להתבצע בכל מקום. שנית, ניתן עסקים ללא DMSO. כך ניתן לסנן בקלות מטרות רגישות ל-DMSO, תוך שמירה על שיעורי פגיעה צפויים11. עם זאת, DMSO להגדיל את מסיסות שבר, ולכן כדאי לבדוק את הסובלנות DMSO של מערכת גביש של בחירה מראש כמתואר לעיל.

הפרוטוקול המתואר להלן יתאר ניסוי טיפוסי עם מסך מורכב 96 כגון מסך F2X-Entry. בשביל זה, כ 250 גבישים צריך להיות מוכן בזמן כדי לשמש טרי. מומלץ מאוד להכין את השריות עבור כל 96 תרכובות כפולות. מומלץ, אך אופציונלי, להכין ספוגים מדומה נוספים שיסייעו מאוחר יותר בניתוח נתונים באמצעות גישת ניתוח צפיפות הפאן-דאטה (PanDDA) לזיהוי להיט13. טבילות מדומה מוגדרות כניסויי השריה על גבישי חלבון באמצעות אותו תמיסת השריה כמו השבר ספוג לאותה זמן דגירה, אך לא קיימים שברים. אם תמיסת ההשריה שווה למצב ההתגבשות, ניתן לקצור את הגבישים ישירות מלוח ההתגבשות.

בהתאם ליכולות של מחליף הדגימה הרובוטי, ייתכן שיהיה צריכה להשתמש בפורמטי דיסקוס שונים. כרגע, דגימות עבור BL14.1 קרן המופעלת על ידי HZB צריך להיות מוכן בפורמט Unipuck, דגימות עבור BL14.2 קרן המופעלת על ידי HZB צריך להיות מוכן בפורמט דיסקית SPINE. בפרוטוקול זה, ההנחה היא הכנה בתבנית Unipuck.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. גבישים ספוגים

  1. קח את צלחת ההקרנה (כאן, צלחת מסך כניסה F2X, איור 2) מן המקפיא -20 מעלות צלזיוס ומניחים אותו על הספסל / שולחן במשך כ 30 דקות כדי לחמם אותו מראש לטמפרטורת החדר, ובכך למנוע לחות עיבוי.
  2. סדרו את מקום העבודה עם שני מיקרוסקופים מסודרים וכל הכלים הדרושים (איור 3A). החומרים מפורטים בטבלת החומרים.
  3. בחר 3-4 לולאות בגודל המתאים להעברת הגבישים כדי להיות ספוג ומניחים אותם קרוב מיקרוסקופים.
  4. ממלאים את חללי צלחת הזכוכית במים מיונים או מזוקקים.
  5. הכן 5 מ"ל של פתרון השרייה.
  6. חותכים לפתוח את התיק של צלחת ההקרנה מראש מחומם לטמפרטורת החדר.
  7. מוציאים את המכסה ואת נייר הכסף מלוח ההקרנה, תוך שמירה על הצלחת מונחת על הספסל / השולחן.
  8. Decant 5 מ"ל של פתרון השרייה במאגר ריאגנט.
  9. מלאו כל אחד מ-96 המאגרים בתמיסת השרייה של 40 μL באמצעות פיפטה בת 12 ערוצים.
  10. מניחים את מסגרת EasyAccess על גבי צלחת ההקרנה ולאבטח אותו עם מהדקים כלולים על ידי החלקת אותם על הצד השמאלי והימני של המכשיר.
    הערה: מסגרת EasyAccess היא מכשיר מיוחד לטיפול בגבישים מרובים, אשר פותחה ב HZB14. זה מאפשר גישה קלה לכל באר על ידי הסטת אריחים מטלטלין תוך הגנה על בארות אחרות מפני אידוי.
  11. מניחים את צלחת ההקרנה (כולל מסגרת EasyAccess) תחת המיקרוסקופ הראשון ואת צלחת התגבשות כולל גבישים להיות ספוג תחת המיקרוסקופ השני.
  12. החלק פתח היטב A1 של לוח ההקרנה על-ידי הזזת אריח הזכוכית האקרילית המתאימה של מסגרת EasyAccess עם אצבע או עם כלי העט שסופק.
  13. הוסף 0.4 μL של פתרון השרייה מהמאגר לרסיס המכיל היטב (העדשה השמאלית העליונה) באמצעות קצה פיפטה טרי. בדוק דרך המיקרוסקופ כי טיפה מכסה את שבר מיובש על, כך שהוא יכול להתמוסס.
    הערה: לחלופין, שלב זה יכול להתבצע באמצעות רובוט pipetting לפני ההרכבה של מסגרת EasyAccess. בדרך זו טיפות השרייה של כל הבארות יכול להיות ממוקם בהליך אוטומטי אחד. עם זאת, המחברים ממליצים להוסיף את פתרון ההשריה ישירות לפני שלב ההשריה כמתואר כדי להבטיח כי השבר solubilizes לאט בנוכחות הגביש. זה מונע כי הקריסטל חווה הלם פתאומי עם המעבר לירידה עם ריכוז שבר גבוה.
  14. תחת המיקרוסקופ השני, חותכים לפתוח את רדיד האיטום של צלחת התגבשות באחת הבארות המכילות את גבישי היעד.
  15. העבר שני גבישים באמצעות לולאה בגודל מתאים רכוב על שרביט הגביש לבאר A1 של צלחת ההקרנה תחת המיקרוסקופ הראשון.
  16. לשטוף את הלולאה בצלחת ספוט זכוכית מוכן לייבש אותו על ידי נגיעה בעדינות ברקמה. עשה זאת לאחר כל העברה כדי למנוע זיהום צולב עם שבר המכיל פתרונות השריה.
  17. השתמש במיקרוסקופ כדי לבדוק שהקריסטלים הונחו כראוי.
  18. עבור לבאר הבאה (למשל, B1).
  19. חזור על שלבים 1.13-1.18 עם כל 96 בארות של צלחת ההקרנה עד שכל טיפת השרייה מכילה שני גבישים.
  20. הסר את לוחית ההקרנה (כולל מסגרת EasyAccess) מתחת למיקרוסקופ והנח אותה על הספסל /השולחן.
  21. הסר את מסגרת EasyAccess מלוח ההקרנה.
  22. אטמו את צלחת ההקרנה בנייר איטום והניחו אותה באינקובטור או בארון ההתגבשות, בהתאמה, שם גדלו הגבישים.
  23. דגירה לזמן ההשריה הממוטב. לילה הוא בדרך כלל נוח.
  24. (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' הכנת כ-40 גבישי אפו (כלומר, השריה מדומה)
    1. קח צלחת התגבשות בעלת פרופיל נמוך MRC 3-עדשות 96-well ומלא שתי עמודות עם 40 μL של פתרון השרייה לכל טוב באמצעות פיפטה 12 ערוצים.
    2. מניחים את מסגרת EasyAccess על גבי צלחת התגבשות ולאבטח אותו עם מלחציים כלולים על ידי החלקת אותם על הצד השמאלי והימני של המכשיר.
    3. החלק פתח את אריח הזכוכית האקרילי של באר A1.
    4. מניחים 0.4 μL של פתרון השרייה בכל אחת משתי העדשות השמאליות של הבאר.
    5. מעבירים 2-3 גבישים לכל טיפה. לאחר כל העברה, לשטוף את הלולאה בצלחת ספוט זכוכית מוכן יבש על ידי נגיעה בעדינות ברקמה.
    6. מעבר לבאר הבאה (למשל, B1).
    7. חזור על שלבים 1.24.4-1.24.6 עד כ 40 גבישים מוכנים דגירה.
    8. הסר את צלחת ההתגבשות (כולל. EasyAccess Frame) מתחת למיקרוסקופ אל הספסל /השולחן והסר את מסגרת EasyAccess.
    9. לאטום את צלחת התגבשות עם רדיד איטום ומניחים אותו באינקובטור התגבשות הנ"ל או בארון.
    10. דגירה באותו זמן כמו צלחת ההקרנה.

2.קצירת גבישים

  1. מוציאים את צלחות הדגירה מהחממה או מהארון, בהתאמה.
  2. סדרו את מקום העבודה במיקרוסקופ אחד ובכל הכלים הדרושים (איור 3B). החומרים מפורטים בטבלת החומרים.
  3. הכינו קצף Unipuck dewar עם 3 מכסים Unipuck (כלומר, מארזי מדגם) ולמלא אותו עם חנקן נוזלי (LN2).
    הערה: יש להקפיד על אמצעי הבטיחות המתאימים לעבודה עם LN2 (כלומר, ללבוש משקפי בטיחות ולהשתמש בציוד מגן מתאים). עדיף לקבל LN טרי2 מספר פעמים במהלך הפגישה על מנת למנוע עיבוי מים בפחית אחסון LN2. לאורך כל ההליך הבא, ודא את רמת LN2 ב dewar קצף תמיד מגיע לקצה העליון של dewar. כמו כן, ודא כי LN2 הוא ללא קרח; לעתים קרובות להחליף את LN2 (למשל, פעם אחת כל 45 דקות), או האחרונה אם קרח מתחיל להצטבר. לאחר מכן, למלא את הקצף השני dewar ולהעביר Unipucks אליו. רוקן את קצף הקרח dewar ולהסיר שאריות קרח ולחות עם מייבש מכה.
  4. מוציאים את נייר הכסף מלוח ההקרנה ומניחים את מסגרת EasyAccess למעלה.
  5. השקופית נפתחת היטב A1.
  6. לקצור שני גבישים מן הירידה פלאש לקרר אותם LN2 (אחד אחד) על ידי צלילה עם תנועה אנכית מהירה לתוך LN2 ולאחר מכן החדרת המדגם בתנוחת דיסקוס נכונה. רשם הערות רלוונטיות בגיליון המעקב לדוגמה.
  7. שלב Cryoprotection (במידת הצורך עבור גבישי היעד). במקרה כזה, בצע שלב זה במקום 2.6.
    1. מניחים 0.4 μL של פתרון השרייה כולל cryo-מגן על העדשה השמאלית התחתונה של הבאר.
    2. משוך את הלולאה עם גביש רכוב מן הירידה בעדשה השמאלית העליונה לאט דרך הפתרון בעדשה השמאלית התחתונה תוך שמירה על הגביש בלולאה, ולאחר מכן פלאש מגניב ב LN2. לקצור שני גבישים בדרך זו.
      הערה: בשלבים 2.6 ו 2.7, ודא כי הזמן הגביש הוא בלולאה וחשוף לאוויר נשמר קצר מאוד. הצלילה (כלומר, הירידה האנכית של המדגם ב- LN2-מלא dewar) צריך להתבצע מהר ככל האפשר. זה מבטיח איכות מדגם גבוהה ומניעה של טבעות קרח בנתונים. עקוב אחר הדגימות (כלומר, שים לב אם לקריסטלים יש נזקים וכו') כדי לתעדף את השכפול עבור מדידות הרנטגן הבאות, השתמש בתבנית בשביל זה. גם אם גבישים יש סדקים, "שערות" או פגמים אחרים עקב השרייה, הם עדיין יכולים לשמש תמיד צריך להיות שנקטפו. במקרה גבישים פרץ כמה חתיכות, שניים של החלקים הגדולים / הטובים ביותר למראה צריך להיות שנקטפו. איור 5 מראה כמה דוגמאות לאופן שבו גבישים כאלה יכולים להיראות. כל הגבישים המוצגים נתנו עדיין ערכות נתונים שימושיות בקמפיין11בהתאמה , והדגישו כי כדאי לקצור גבישים לאחר טיפול השריית, גם אם התרחשו שינויים מורפוגולוגיים משמעותיים.
  8. עבור לבאר הבאה וחזור על שלבים 2.5 - 2.6./2.7 עד שכל שלוש הדיסקיות יתמלאו.
  9. הוסיפו את בסיסי Unipuck על גבי העפעפיים לאחר קירורם מראש ב-LN2.
  10. אחסן את Unipucks בארונות אחסון ב dewar הובלה או אחסון dewar.
  11. חזור על השלבים הקודמים עד שכל בארות לוחית ההקרנה יעובדו.
  12. (אופציונלי) לחצו על הלחצן 'קביעות' אם הוכנו קריסטלים ספוגים בדמה, קצרו אותם באופן דומה כמתואר מראש.
    הערה: אם שני גבישים עבור כל אחד 96 התנאים של צלחת ההקרנה יכול להיות מקורר פלאש, יהיה מקום 32 גבישי אפו ספוגים מדומה, כדי למלא את 14 Unipucks.
  13. אחסן את Unipucks ב LN2 עד המדידה.

3.איסוף נתונים

  1. העבר את Unipucks לקו הקורה BL14.1. אם נעשה שימוש בדיסקיות SPINE בשלב 2, העבר אותן לקו הקורה BL14.2.
  2. בצע מדידות סטנדרטיות על קו הקרן באמצעות ההמלצות הספציפיות המפורטות להלן. פרטים על המתקן ועל תוכנית בקרת הניסוי MXCuBE2 הוצגו בעבר15,16. איור 4 מציג את פנים הצריפים הניסיוניים של הקורות BL14.1 ו- BL14.2 וכן צילום מסך לדוגמה של תוכנת הבקרה MXCuBE2 ב- Beamline BL14.1.
    1. כדי למקסם את היעילות והתפוקה של הזמן, דלג על אוסף תמונות הבדיקה. מרחק הדגימה לגלאי יתוקן לערך המתאים למגבלת הרזולוציה העליונה של מערכת הגבישים שנקבעה בניסויים קודמים. אם אסטרטגיית איסוף הנתונים לא מוטבה מראש, אסוף 1800 תמונות של 0.2 מעלות כל אחת עם זמן חשיפה של 0.1 שניות לתמונה.
    2. באופן אידיאלי, בדוק את אסטרטגיית איסוף הנתונים בניסויים קודמים באמצעות גבישי אפו ספוגים מדומה. עבור קבוצות שטח סימטריה גבוהות יותר, 1200 תמונות או אפילו 900 תמונות (כלומר, 240° או 180°, בהתאמה) כבר יתנו ערכות נתונים מלאות עם סטטיסטיקה טובה, ללא תלות בזווית ההתחלה של איסוף הנתונים.
      הערה: יתירות גבוהה יותר וחתך עדין יותר יכולים להניב איכות נתונים מעולה17. עם זאת, שימוש באסטרטגיה זו "מספיק אבל לא יותר" המוצעת כאן הוא פשרה מצוינת בין איכות, זמן איסוף נתונים, כמו גם דרישות חישוביות לניתוח בהמשך. בדרך המתוארת, 200 אוספי נתונים ב 24 שעות אפשריים היטב ב- beamlines BL14.1 ו- BL14.2. עם זאת, יש לתעדף דגימות.
    3. תחילה לאסוף ערכות נתונים עקיפה עבור מדגם אחד לכל תנאי קטע, בהתבסס על סדר העדיפויות בשלב 2.6./2.7 (כלומר, לאסוף את הנתונים עבור כפולת עדיפות גבוהה יותר).
    4. עבור ניסויים אלה ב 3.2.3 שבו איסוף הנתונים נכשל, עקיפה אבדה או טבעות קרח חמורות התרחשו, לאסוף נתונים עבור המדגם הכפול השני של מצב שבר בהתאמה.
    5. לאסוף ערכות נתונים עקיפה של גבישי אפו (אם מוכן על פי שלבים 1.24 ו 2.12).
    6. אסוף ערכות נתונים עקיפה של הכפילויות הנותרות של כל תנאי קטע.
    7. בתוכנית MXCuBE2, התאם את מזהי ערכת הנתונים של קמפיין CFS לתבנית הבאה: <פרוטיין>--[ABCDEFGH][01][0123456789][ab] (למשל, MyProtein-F2XEntry-B05a, שבו "B05" מייצג את הבאר (כלומר, את תנאי הקטע במסך) ואת הבא "a" עבור הכפילות הראשונה.)

4.טיפול בנתונים

  1. לניתוח נתונים של קמפיין CFS, השתמש ב- FragMAXapp, פתרון מבוסס אינטרנט כדי לשלוט בניתוח מולטיפלקס לעיבוד עידון אוטומטי והערכת כניסות PanDDA של נתוני CFS18 (לימה ואח 'FragMAXapp, נתונים שלא פורסמו). בגרסת FragMAXapp הנפרסת ב- HZB התוכניות/צינורות הבאים זמינים: XDSAPP19, Xia2-DIALS ו- Xia2-XDS20, fspipeline7, DIMPLE21, פניקס ליגפיט22, PanDDA13,23. השתמש במודל קלט מעודן היטב של חלבון היעד כקלט לעידון אוטומטי; אחרת לבצע עידון קפדני של גביש אחד ספוג מדומה ברזולוציה גבוהה שנאסף במהלך הקמפיין.
    הערה: רכיב מפתח לזיהוי כניסות הוא PanDDA. הפרטים מוסברים בפרסומים המתאימים13,23. בקצרה, PanDDA מחשב באופן אוטומטי מפות צפיפות אלקטרונים של קבוצה של ערכות נתונים בקמפיין CFS. לאחר מכן מניחים כי אלה הם תנאי שבר שאינם מחייבים וממוצע כדי ליצור את מה שמכונה מודל מצב הקרקע. מודל מצב הקרקע משמש לאחר מכן כדי להפיק פערים מקומיים בין כל מפת צפיפות אלקטרונים לבין מפת מצב הקרקע, באמצעות ציוני Z הקשורים voxel. לאחר מכן, עבור אזורים בעלי ציוני Z גבוהים, מפת PanDDA נקראת נוצרת על-ידי חיסור מכוון של צפיפות מצב הקרקע מהמפה המתאימה. פעולה זו משפרת במידה רבה את הניראות של אירועי כריכת קטעים.
  2. כדי למקסם את התוצאה של PanDDA, השתמש בגישה דו-שלבית. ראשית, ביצוע הפעלת PanDDA (pandda.analyse) עם הגדרות סטנדרטיות. גם אם נאספו גבישים ספוגים מדומה, זהותם לא תיכלל כפרמטרים (דבר אפשרי בכל זאת) על מנת לאפשר דור לא משוחד של מודל מצב הקרקע על ידי PanDDA מכל הנתונים הזמינים. לאחר מכן, נתוני הפלט מוערכים על ידי המשתמש באמצעות מה שמכונה בדיקת PanDDA ב Coot24. כאן, להיטים עם ביטחון גבוה יחסית יש לציין, מסכם את הצעד הראשון.
  3. שנית, הפעל מחדש את שלב pandda.analyse למעט הלהיטים הראשוניים (שנקבעו בשלב הראשון) ממודל מצב הקרקע באמצעות אפשרות שורת הפקודה --exclude_from_characterisation="<רשימה של מזהי ערכת נתונים מאוגדים>". פרטים נוספים מתוארים בדפי העזרה של PanDDA (https://pandda.bitbucket.io/). בדרך זו, ערכות נתונים שהן פגיעות ברורות ובכך יטשטשו את מודל מצב הקרקע אם ייכללו יתעלמו מהן. זה מוביל מודל מצב הקרקע משופרת ובכך תוצאות משופרות הכוללת. לבסוף, מתבצעת בדיקה יסודית של PanDDA כדי להשלים את זיהוי הלהיט.
    הערה: FragMAXapp כולל גם אפשרות פלט לשמירת המצבים המאוגדים המעוצבים או להכנת נתונים לשליחת PDB, לפרטים נוספים ראו דפי אינטרנט של FragMAX (https://fragmax.github.io/).

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כחלק ממסעות האימות שדווחו בעבר של מסך F2X-Entry11, נערכו שלושה קמפיינים בקו הקורה של BioMAX ב- MAX IV וקמפיין אחד נערך ב- Beamline BL14.1 ב- HZB. בקמפיין האחרון, קבוצה מסוימת של תנאי מסך כניסה F2X באמצעות מצב השרייה שלא הכיל DMSO הוקרן נגד קומפלקס חלבון חלבון של שמרים Aar2 ואת התחום דמוי RNaseH של שמרים Prp8 (AR). קבוצת התנאים שנבחרה כוללת את הלהיטים שנמצאו בקמפיין מוקדם יותר של מסך F2X-Entry נגד AR במצב השרייה המכיל DMSO11, (כלומר, בקמפיין שבוצע ב- HZB להיטים אלה הוקרנו מחדש בהיעדר DMSO). איור 7 מציג סקירה כללית של הלהיטים שהושגו לאחר ניתוח הנתונים עם שילוב FragMAXapp של XDSAPP לעיבוד, fspipeline לעידון אוטומטי וממצא להיט לאחר מכן באמצעות PanDDA.

figure-results-1
איור 1: ייצוג סכמטי של זרימת העבודה של ניסוי הקרנת שברים קריסטלוגרפי (CFS) עם דגש על הסביבה המיוחדת בהלמהולץ-זנטרום ברלין.

figure-results-2
איור 2: ניסוח ואריזה של מסך הכניסה F2X. המסך המורכב 96 זמין על צלחת 3 עדשות 96-well MRC פרופיל נמוך, אטום בנייר כסף ואקום ארוז. 96 תרכובות המסך מיובשות מפתרונות DMSO בשתיים משלוש העדשות של כל באר. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: צילום שולחן העבודה של CFS במעבדת ההכנה של HZB. מכלולים של כלים הדרושים עבור A) השרייה עבור B) קצירת קריסטל מוצגים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4
איור 4: תחנות קצה לאיסוף נתונים ותוכנות בקרה. A) תצלום של הצריף הניסיוני של קרני HZB-MX BL14.1 (משמאל) ו- BL14.2 (מימין)15. ב)צילום מסך של ממשק בקרת הניסויים MXCuBE216 המשמש ב- BL14.1 לאיסוף נתונים עקיפה. ב- BL14.2 נעשה שימוש בממשק דומה מאוד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.  

figure-results-5
איור 5: תמונות מצולמות של כמה דגימות גבישיות בסביבה קריוגנית לפני איסוף הנתונים. זה ממחיש את השונות של מורפולוגיות של הגבישים לאחר ביצוע שבר השריית וקצירת גביש. התמונות צולמו על קרן BioMAX (MAX IV synchrotron, לונד, שוודיה) עבור דגימות AR שנאספו שם כחלק אימות מסך F2X-Entry11. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6
איור 6: צילום מסך של FragMaxApp18 המותקן ב- HZB לניתוח נתונים נוח. פרטים נוספים בלימה ואח ', FragMAXapp, נתונים שלא פורסמו. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7
איור 7: מבט כולל על תוצאות קמפיין CFS F2X-Entry לעומת AR (ללא DMSO). קומפלקס חלבון AR מוצג בתצוגה מצוירת, עם Aar2 צבוע באפור ואת התחום דמוי RNaseH של Prp8 צבוע בכחול. הלהיטים שבר של הקמפיין צבועים בצבעי אלמנט (C - צהוב, O - אדום, N - כחול, S - כתום, Cl - ציאן בהיר). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

מידע משלים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה. 

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבור קמפיין CFS מוצלח, חיוני לדבוק בדרישות המוקדמות המתוארות (ראה מבוא). מערכת התגבשות אמינה נדרשת לצמיחה הניתנת לשחזור של גבישים רבים המפוצלים היטב, ויש צורך במבנה מעודן היטב כמודל אפו הקלט לעידון אוטומטי. חשוב גם לבדוק כי אתר היעד בחלבון (אתר פעיל, או אזור ממשק) נגיש לרסיסים בסריג הגביש. זה חיוני כדי לייעל את תנאי השרייה מראש כדי להבטיח כי השרייה לא לדרדר באופן משמעותי את איכות הגביש. הזנחת היבטים אלה תוביל ככל הנראה לניסוי תת-אופטימלי, שיהיה בשימוש מוגבל, ובמקרה הגרוע ביותר ידרוש חזרה על הניסוי כולו.

הפרוטוקול המתואר לעיל מתאר את ההליכים הבאים במהלך קמפיין CFS סטנדרטי. אם כל התנאים המוקדמים מתקיימים, לפחות 90% מכל הגבישים הספוגים צריכים להציג עקיפה לרזולוציה גבוהה בניסוי עקיפה. אם זה לא המקרה, זמני ההשריה עשויים להתקצר לכמה שעות או אפילו דקות. בשל המסיסות הטובה של רוב השברים, זה אמור להספיק כדי להשיג ערכי תפוסה הגונים. כמו כן, קמפיין CFS טיפוסי יגרום לשיעור פגיעה של בערך 10% ומעלה. עבור קמפיינים של אימות מסך F2X-Entry11 וקמפיינים מתמשכים של משתמשים עם אותה ספריה נצפו שיעורי כניסות גבוהים עוד יותר (20% ומעלה, נתונים לא מוצגים).

אזהרה כללית של הקרנת שברים קריסטלוגרפיים היא נוכחותם של אתרי מגע קריסטלוגרפיים. אלה יכולים גם לחסן אתרים פעילים ידועים מראש (להיבדק לפני ההקרנה, ראה לעיל), או אתרי קשר אלה גם לעתים קרובות לספק כיסים ונקודות חמות שבו שברים יכולים לאגד. להיטים שבר כזה יהיה חפצים של סריג התגבשות וסביר להניח לא להיקשר החלבון בתמיסה. אירועים אלה נוטים להתרחש לעתים קרובות יותר בניסויי השרייה מאשר בניסויים של התגבשות משותפת (ככל הנראה בשל ריכוזי שברים גבוהים יותר המשמשים בניסויי השרייה). עם זאת, על פי ניסיון קודם, הם מהווים בדרך כלל רק חלק קטן מהלהיטים שהושגו. לדוגמה, בקמפיין האימות של מסך F2X-Entry באמצעות אנדותיפפסין (EP) וקומפלקס החלבון-חלבון השיפוזיסומלי של Prp8RNaseH ו- Aar2 (AR), רוב הלהיטים התרחשו באתרים מבטיחים11. עבור EP, 27 מתוך 37 אירועי הכריכה שנצפו היו ממוקמים באתר הפעיל (כלומר, שסדק הפפטיד של פרוטאז זה). 10 אירועי הכריכה מרחוק כוללים שני אירועי קשירה חשופים ממס ושמונה אירועי כריכת מגע קריסטליים (המתאימים לחמישה להיטים ייחודיים). לא כולל להיטים אלה מגע קריסטל עדיין ישקף שיעור כולל של 24% כניסות ייחודיות עבור קמפיין EP. חשוב גם לשים לב כי אירועים מחייבים מרחוק של אתר פעיל ידוע (למעט קלסרים מגע קריסטל) יכול גם להיות מעניין (למשל, חשיפת נקודות חמות חדשות או אתרים allosteric של החלבון). עבור קמפיין AR (באותו פרסום), מתוך 23 האירועים המחייבים שנצפו, שבעה אותרו במגעי גביש, אחד אותר בממשק הישיר של שני החלבונים, שבעה היו ממוקמים באתרי אינטראקציות ידועות של חלבונים עם שותפים מחייבים אחרים של ההקשר הביולוגי הגדול יותר (ומכאן שלבי הרכבה שונים של השחבור), שמונה אירועים מחייבים חשפו שתי נקודות חמות ב- AR של פונקציה עדיין לא ידועה ואחד נמצא במשטח חשוף ממס של Prp8RnaseH. לכן, למעט האירועים במגעי קריסטל וסינגלטון Prp8RnaseH, מספר אירועי הכריכה שעשויים להיות שימושיים הוא 15 (המקביל ל -14 להיטים ייחודיים) ובכך שיעור פגיעה של 15.6%. להיטים אלה יכולים להיות נקודות התחלה עבור עיצוב של מאפננים אינטראקציה חלבון חלבון או עבור תרכובות כלי שמטרתם לחקור את שני כתמים חמים Aar2 שהתגלו. יחד, גם בקנה אחד עם מסעות משתמשים שנערכו, לעתים קרובות רק חלק קטן של להיטים בהקרנת שבר קריסטלוגרפי יש להתעלם כמו חפצים. עם זאת, זה יהיה גם במידה רבה יעד תלוי.

אם שיעור הפגיעה נמוך משמעותית, הדבר עשוי להצביע על אחת מהבעיות הבאות הקשורות לחלבון היעד. לדוגמה, בקמפיין CFS נגד פרוטאז ציסטאין ויראלי נצפתה שיעור פגיעה של 3% בלבד (נתונים לא מוצגים). התברר כי החלבון בשימוש היה ככל הנראה שונה כימית באתר הפעיל שלה. במקרה כזה, הכנת חלבון שונה עשויה לפתור את הבעיה. אם גבישים הם מאוד DMSO סובלני, מסך F2X-Entry עשוי לשמש גם ללא DMSO, אם כי התוצאות עשויות להיות שונות במידה מסוימת. רוב הלהיטים שהושגו בנוכחות DMSO יופיעו גם בהיעדרו. יהיו גם כמה להיטים שלא ניתן לצפות בהם בהיעדר DMSO, למרות שניתן לצפות בהם בנוכחותו. ולבסוף, יהיו כאלה ש יופיעו רק בהיעדר DMSO.

הקושי החמור ביותר מתרחש אם החלבון עובר תנועה בכושר המושרה על כריכת חומר. סביר להניח, סריג הגביש לא יסבול את תנועת החלבון והקריסטלים יתפוררו. במקרה כזה, הבחירה היחידה היא לפנות להתגבשות משותפת של החלבון והשברים. זה עשוי, עם זאת, להוביל לצורות גביש חדשות. לכן, חלק גדול מהאוטומציה של התהליך כולו לא יעבוד ביעילות יותר. למרבה המזל, ברוב הקמפיינים CFS שנערך ב HZB עד כה, סוג זה של בעיה לא נתקל. ייתכן, כי הכריכה החלשה של שבר, אינה מספקת מספיק אנרגיה כדי לגרום לתנועת חלבון, במיוחד אם הקונפורמציה המגובשת מיוצבות על ידי כוחות אריזת קריסטל.

מגבלה חמורה נוספת של השיטה שבה נתקלו המחברים עד כה היא כאשר קוקטייל התגבשות (ובכך פתרון השרייה) מכיל תרכובות נדיפות. ואז זה הופך להיות קרוב לבלתי אפשרי לבצע את כל הטיפול בגביש בצורה משמעותית.

חלבונים שונים עשויים להכיל אתרים הניתנים לתרופות במידה רבה יותר או פחות. לדוגמה, אינטראקציות חלבון-חלבון מתווכות בדרך כלל על ידי משטחים שטוחים מורחבים שקשה יותר למקד. לפיכך, קצב הפגיעה בקשירת שברים יהיה תלוי ככל הנראה במבנה פני השטח המולקולריים של החלבון. במקרה קיצוני, חלבון עשוי שלא להכיל נקודות חמות מתאימות לפני השטח המשמשות כאתרי יעד לכריכת שברים. לכן, למרות ניסוי שבוצע בקפידה, שום להיטים לא יגרמו להקרנה. עם זאת, המחברים לא נתקלו עד כה במצב כזה.

באופן עקרוני, באמצעות הפרוטוקול המתואר לעיל, החלק השריית קריסטל וקציר של קמפיין CFS יכול להתבצע בכל מעבדה המצוידת לטיפול בגביש. זה מבדיל את המתודולוגיה ב- HZB ממתקני CFS אחרים ויכול להיות יתרון במקרים מסוימים. לדוגמה, אם לא ניתן לייצר מחדש את הגבישים בקלות באתר אחר או אם הנסיעה של הניסויים מוגבלת (למשל, במצב מגיפה כלל עולמי), משתמשים ב- HZB מסופקים אפוא עם הציוד כולו (דיסקיות, כלים, EasyAccess Frame, מחזיקי מדגם וכו ') כקבוצה ניידת.

עם זאת, הדרישות עבור מספר גדול של מחזיקי מדגם קיבולות אחסון קריוגני עדיין נפגשו בנוחות רבה יותר במתקני CFS ייעודיים. יתר על כן, הצורך באיסוף של ערכות נתונים עקיפה רבות תומך מאוד לוקליזציה מתקנים אלה קרוב לקורות אשר מכוונים לכיוון תפוקת מדגם גבוהה. דוגמאות לכך הן הקורות I04-1 במקור אור היהלומים ומתקן XChem המשויך בבריטניה8,25, קורות MASSIF ב ESRF בצרפת26 או מתקן FragMAX ב קרן BioMAX ב MAX IV בשוודיה18.

בעתיד, ניתן היה לדמיין לתכנן ניסויי CFS ללא צורך בטיפול בגבישים לחלוטין. דווח על התקדמות ראשונה בכיוון זה. למשל, על ידי העברה נוזלית אקוסטית המאפשרת ערבוב של פתרונות המכילים קריסטל ופתרונות שבר ישירות על מחזיקי מדגם מסוג רשת27. גישה נוספת שימשה להקרנת ליגנד מבוססת XFEL. בניסוי הוכחת העיקרון, תרחיף קריסטל הוכן באצווה, ואיסוף נתונים השרייה ועקיפה בוצעו על שבב יעד קבוע סיליקון28. עם זאת, גישות אלה עדיין נמצאות בפיתוח ורחוק מלהיות ישים למגוון רחב של מטרות חלבון או ריאלי עבור מתקני CFS כשגרה.

עם הפרוטוקול בעבודה זו הוראות מפורטות לבצע בהצלחה קמפיינים CFS ישר קדימה ב HZB (ובמקומות אחרים) כבר התווה הדרכה כללית וטיפים שימושיים מעשית בהכנה וביצוע ניסויים כאלה עם סיכויים גבוהים יותר להצלחה ניתנו. בסופו של דבר, סיכויים טובים יותר ושיעורי הצלחה בהקרנת CFS תורמים במידה רבה לספק ביעילות נקודות התחלה לפיתוח במורד הזרם של תרכובות כלים או מועמדים לסמים.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בקשה לפטנט בנוגע למסגרת EasyAccess הוגשה על ידי הלמהולץ-זנטרום ברלין למשרד הפטנטים וסימני המסחר הגרמני עם מספר הרישום DE 10 2018 111 478.8. בנוסף, הוגשה בקשה בינלאומית לפטנט באמצעות מסלול PCT, בעדיפות הפטנט הגרמני.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לקבוצות המשתמשים הרבות שביצעו קמפיינים של CFS ב- HZB. המשוב שלהם הוביל לשיפור המצטבר של זרימת העבודה שלנו. אנו רוצים להודות לקבוצת עיצוב התרופות באוניברסיטת מרבורג ולקבוצת FragMAX ב- MAX IV, שכן שיתופי הפעולה הקרובים היו הבסיס למספר קפיצות התפתחותיות לשיפור CFS. אנו מודים על התמיכה של משרד החינוך והמדע הפדרלי הגרמני (BMBF), באמצעות הפרויקטים Frag2Xtal ו Frag4Lead (מספרים 05K13M1 ו 05K16M1). בנוסף, אנו אסירי תודה על התמיכה באמצעות iNEXT-Discovery, מספר פרויקט 871037, במימון תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1 ומיקרו; L פיפטאפנדורףEP3123000012
פיפט 12 ערוצים, 100 ומיקרו; מייבש שיער LEppendorfEP4861000791
TH-Geyer9.106 788
לוחות התגבשותהמכילים קריסטל מכיל גבישים להשרייה
חממתהמספקת טמפרטורה קבועה לניסוי התגבשות, ב-HZB: 20°
C MicroLoops בעובי כפול (LD) בגדלי צמצם שוניםMiTeGenשונים, למשל לולאות M5-L18SP-75LD250 בעובי כפול של
בגודל המתאים הדרוש לפרוטוקול, ניתנות לסיפוק על ידי HZB 
מסגרת EasyAccessHZBמסגרת EasyAccess היא מכשיר מיוחד לטיפול במספר גבישים, שפותח ב-HZB (Barthel et al., 2021).
F2X-Entry Screenplate HZBDeveloped F2X-Entry Screen (Wollenhaupt et al., 2020)
Glas Spotplate VWRMARI1406506
חנקןלפחות פחית מלאה של 5 ליטר
אחסון חנקן נוזלי יכולה
קריסטל מג'נטיקMiTeGenM-R-1013198
מיקרוסקופיםLeican.a.MRC
3 עדשות 96 בארות פרופיל נמוך צלחת התגבשותSwissCI3W96TLP-UVPלגבישים ספוגים מדומים (אופציונלי)
מאגר ריאגנטיםקארל רוטEKT6.1נפח 25 מ"ל
תבניתhttps://www.jove.com/files/ftp_upload/62208/TemplateCFSHZBSampleTracking.
xlsx
אזמלB. רדיד איטום בראוןBA825SU
ללוחות מיקרוטיטרGreinerBioOne676070
קני משלוח פאק מדפים (עבור Unipucks)MiTeGenM-CP-111-0652 קנים עשויים אלומיניום; ניתן לספק על ידי פתרון השריית HZB
 יש צורך לפחות 5 מ"ל
תמיסת השרייה כולל מגן קריו, 150 ומיקרו; Lנחוץ רק אם תמיסת ההשריה אינה כבר מגן קריו-טישו
 Roth (Kimberly Clark Professional)AA64.1
Transport dewar (Whartington dry shipper)MiTeGenTW-CX1002 dewars נסיעות לאחסון 2 קני unipuck, לחלופין ניתן להשתמש ב-dewar אחסון מסוג VHC35 או דומה.
קצף Unipuck עם מכסהMiTeGenM-CP-111-022שני מחוזות קצף המתאימים במיוחד לטיפול ב-unipuck המתואר בפרוטוקול
אם משתמשים בדיסקיות SPINE, ייתכן שיהיה צורך ליישם משטחי קצף שונים.
סט המתנע של UnipuckMiTeGenM-CP-UPSK001יכול להיות מסופק על ידי HZB
UnipucksMiTeGenM-CP-111-02114 unipucks; יכול להיות מסופק על ידי HZB
התגבשות נוזלי n.a.n.a.a.שרביט מעקב לדוגמא

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: the impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
  2. Hall, R. J., Mortenson, P. N., Murray, C. W. Efficient exploration of chemical space by fragment-based screening. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 82-91 (2014).
  3. Erlanson, D. A. Introduction to fragment-based drug discovery. Topics in Current Chemistry. 317, 1-32 (2012).
  4. Scott, D. E., Coyne, A. G., Hudson, S. A., Abell, C. Fragment-based approaches in drug discovery and chemical biology. Biochemistry. 51 (25), 4990-5003 (2012).
  5. Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
  6. Schiebel, J., et al. Six Biophysical Screening Methods Miss a Large Proportion of Crystallographically Discovered Fragment Hits: A Case Study. ACS Chemical Biology. 11 (6), 1693-1701 (2016).
  7. Schiebel, J., et al. High-Throughput Crystallography: Reliable and Efficient Identification of Fragment Hits. Structure. 24 (8), 1398-1409 (2016).
  8. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 73 (3), 267-278 (2017).
  9. Radeva, N., et al. Active Site Mapping of an Aspartic Protease by Multiple Fragment Crystal Structures: Versatile Warheads to Address a Catalytic Dyad. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (21), 9743-9759 (2016).
  10. Cox, O. B. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
  11. Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally Diverse Compound Libraries for Crystallographic Fragment Screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
  12. EU OPENSCREEN fragment library. , Available from: https://www.eu-openscreen.eu/services/compound-collection/fragment-library.html (2020).
  13. Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123(2017).
  14. Barthel, T., Huschmann, F. U., Wallacher, D., Klebe, G., Weiss, M. S., Wollenhaupt, J. Facilitated crystal handling using a simple device for evaporation reduction in microtiter plates. Journal of Applied Crystallography. 54, (2021).
  15. Mueller, U., et al. The macromolecular crystallography beamlines at BESSY II of the Helmholtz-Zentrum Berlin: Current status and perspectives. The European Physical Journal Plus. 130 (7), 141(2015).
  16. Oscarsson, M., et al. MXCuBE2: The dawn of MXCuBE collaboration. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (2), 393-405 (2019).
  17. Mueller, M., Wang, M., Schulze-Briese, C. Optimal fine φ-slicing for single-photon-counting pixel detectors. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 42-56 (2012).
  18. Lima, G. M. A., et al. FragMAX: The fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (8), 771-777 (2020).
  19. Sparta, K. M., Krug, M., Heinemann, U., Mueller, U., Weiss, M. S. XDSAPP2.0. Journal of Applied Crystallography. 49 (3), 1085-1092 (2016).
  20. Winter, G. xia2: an expert system for macromolecular crystallography data reduction. Journal of Applied Crystallography. 43 (1), 186-190 (2010).
  21. Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 67 (4), 235-242 (2011).
  22. Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 62 (8), 915-922 (2006).
  23. Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (3), 256-266 (2017).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
  25. Collins, P. M., et al. Chapter Eleven - Achieving a Good Crystal System for Crystallographic X-Ray Fragment Screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
  26. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  27. Cuttitta, C. M., et al. Acoustic transfer of protein crystals from agarose pedestals to micromeshes for high-throughput screening. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (1), 94-103 (2015).
  28. Moreno-Chicano, T., et al. High-throughput structures of protein-ligand complexes at room temperature using serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 6 (6), 1074-1085 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

XHits

מאמרים קשורים