הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי חזיר (piPSCs) לתאי אב עצביים (NPCs)

881 צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62209

⸱

11 ביוני 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Faculty of Veterinary Medicine and Animal Sciences, University of São Paulo, 2Department of Veterinary Medicine, Faculty of Animal Sciences and Food Engineering, University of São Paulo, 3Department of Pharmacology, Institute of Biosciences, São Paulo State University

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר שיטה להתמיינות כימית ותרבית של תאי אב עצביים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי חזיר (piPSCs).

תקציר

נוירונים שמקורם ב-iPSC אטרקטיביים במודלים של מבחנה לחקר נוירוגנזה ושינויים פנוטיפיים מוקדמים במחלות נפש, בעיקר כאשר רוב המודלים של בעלי חיים המשמשים במחקר פרה-קליני, כגון מכרסמים, אינם מסוגלים לעמוד בקריטריונים לתרגום הממצאים לקליניקה. פרימטים, כלבים וחזירים שאינם אנושיים נחשבים למודלים הולמים יותר למטרות מחקר ביו-רפואי ופיתוח תרופות, בעיקר בשל הדמיון הפיזיולוגי, הגנטי והאנטומי שלהם לבני אדם. מודל החזירים זכה לעניין מיוחד במדעי המוח התרגומיים, המאפשרים בדיקות בטיחות והשתלות. כאן מתואר הדור של iPSCs חזיריים יחד עם התמיינות נוספת שלו לתאי אב עצביים (NPCs). התאים שנוצרו ביטאו סמני NPC Nestin ו-GFAP, שאושרו על ידי RT-qPCR, והיו חיוביים ל-Nestin, b-Tubulin III ו-Vimentin על ידי אימונופלואורסצנטי. תוצאות אלה מראות את הראיות ליצירת תאים דמויי NPC לאחר אינדוקציה במבחנה עם מעכבים כימיים ממודל של בעלי חיים גדולים, מודל מעניין והולם למחקר רפואה רגנרטיבית ותרגומית.

מבוא

למרות שחוקרים רבים שואפים להבין טוב יותר את המנגנונים התאיים וההתפתחות הפתולוגית של מחלות נוירולוגיות בבני אדם, ישנן מגבלות רבות לשימוש בטכניקות לא פולשניות בבני אדם כגון הדמיית תהודה מגנטית (MRI), וחוסר האפשרות, ברוב המקרים, ליישם טכניקות פולשניות כגון מעקב אחר דרכי ורישום תוך-תאי1. זה גם מאתגר להשיג רקמת מוח לאחר המוות באיכות טובה מכיוון שמצבי אגונל ממושכים של תורמים עלולים להשפיע על המוח ולהפריע למחקרים2. לכן, יש צורך שמודלים של בעלי חיים, ששימשו כבר כמה עשורים במחקר תרגומי, יהיו רלוונטיים ומפוקפקים עד היום. הבחירה במודל מסוים של בעלי חיים הופכת לשאלה מרכזית בתכנון ובתכנון הניסויים האחרונים, ומבהירה שכדי להשיג תוצאות עקביות, בחירת המודל המתאים ביותר דורשת ידע מעמיק לא רק על הפיזיולוגיה של המינים השונים אלא גם חשוב מכך, על המטרות הספציפיותשל המחקר.

עם זאת, מודלים של בעלי חיים מציגים לעתים קרובות מגבלות כאשר הם נכנעים למבנה המוח האנושי והתפתחותו, שכן יש לו כמה מאפיינים התפתחותיים, אנטומיים, מולקולריים וגנטיים ייחודיים. לכן, קשה מעט לפרש ולהסיק נתונים שנאספו מבעלי חיים המשמשים במחקר, כגון נתונים ממכרסמים1.

בין המגוון הרחב של מודלים של בעלי חיים הקיימים כיום, כולל מודלים טרנסגניים, חלק מבעלי החיים הגדולים נחשבים בעלי ערך רב, כגון פרימטים שאינם אנושיים, כלבים וחזיר4. הדמיון הפיזיולוגי, הגנטי והאנטומי בין בני אדם לחזירים מבחינת גודל האיברים מדגיש את חשיבותם של מודלים אלה בפיתוח גישות אבחנתיות וטיפוליות. במיוחד, מודל החזירים זכה לעניין מיוחד במדעי המוח התרגומיים, המאפשרים בדיקות בטיחות והשתלות. הוא שימש במחקרים הקשורים להשפעות לב וכלי דם, ריאות ומערכת העיכול, ובמיוחד לבדיקת טיפולים חדשים (למשל, במחקרים ברפואה רגנרטיבית עם תאי גזע5, 6).

בהקשר זה, מודלים במבחנה, וליתר דיוק נוירונים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), הם מודלים אטרקטיביים המאפשרים חקר נוירוגנזה ושינויים פנוטיפיים מוקדמים במחלות נפש, בעיקר כאשר רוב המודלים של בעלי חיים המשמשים במחקר פרה-קליני, כגון מכרסמים, אינם מסוגלים לעמוד בקריטריונים לתרגום הממצאים לקליניקה.

השימוש ב-iPSCs הועיל מאוד למדעי המוח בכך שהוא מאפשר מידול מחלות במבחנה, במיוחד על ידי שימוש בתאי אב עצביים שמקורם ב-iPSCs (NPC), מכיוון ש-NPCs הוכחו ככלי מעניין למידול מחלות במבחנה 7,8,9. iPSCs נוצרו בהצלחה מחולים עם מחלת אלצהיימר10, סכיזופרניה11 ומחלות רבות אחרות כגון מחלת פרקינסון, תסמונת רט, ניוון שרירים בעמוד השדרה, תסמונת דאון וטרשת אמיוטרופית צידית כפי שנאספו על ידי Mungenast ומשתפי פעולה2. מערכות מודלים פרה-קליניות של בעלי חיים דווחו גם באמצעות NPCs שמקורם ב-iPSC כשתלי עמוד שדרה פונקציונליים עם תגובה חיסונית מינימלית או ללא תגובה חיסונית שזוהתה 12,13,14.

כאן, מתואר היווצרות iPSCs חזיריים והתמיינות כימית נוספת לתאי אב עצביים משוערים (איור 1 ואיור 2). התאים שנוצרו ביטאו את סמני NPC Nestin ו-GFAP, שאושרו על ידי RT-qPCR, והיו חיוביים ל-Nestin, β-Tubulin III ו-Vimentin על ידי אימונופלואורסצנטי. תוצאות אלה מראות עדויות ליצירת תאים דמויי NPC לאחר אינדוקציה במבחנה עם מעכבים כימיים ממודל של בעלי חיים גדולים, מודל חשוב והולם למחקר רפואה רגנרטיבית ותרגומית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

ניסויים אלה אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של הפקולטה למדעי בעלי החיים והנדסת מזון באוניברסיטת סאו פאולו (מספרי היתרים: מס' 5130110517 ומס' 4134290716).

הערה: כל ההליכים הכוללים תרבית תאית ודגירה מבוצעים באווירה מבוקרת (38.5 מעלות צלזיוס ו-20% CO2 באוויר, לחות מקסימלית). המעבר התאי בוצע על ידי דגירה של 5 דקות עם מגיב דיסוציאציה והתאים התאוששו לאחר צנטריפוגה (300 x גרם).

1. תכנות מחדש של פיברובלסטים חזיריים ל-iPSC

  1. הכנת ניסוי
    1. הכן פיברובלסטים ו-293 מצעי תרבית המורכבים מהמדיום המותאם של Iscove Dulbecco (IMDM) בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 0.1 מ"מ חומצות אמינו לא חיוניות ו-1% אנטיביוטיקה (פניצילין/סטרפטומיצין) אלא אם צוין אחרת.
    2. הכן מדיום תרבית iPSC (מדיום תכנות מחדש) המורכב מ-DMEM/F12 באוסמולליות נמוכה (מותאם לגידול של תאי גזע עובריים אנושיים ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים) בתוספת 20% תחליף סרום, 0.1 מ"מ חומצות אמינו לא חיוניות, 1 מ"מ גלוטמין, 3.85 מיקרומטר β-מרקפטואתנול, 10 ננוגרם/מ"ל bFGF ו-1% אנטיביוטיקה.
    3. במידת הצורך, פיברובלסטים עובריים של עכברי זרעים (MEFs) לתוך בקבוק T75 (10 מ"ל) כדי להשיג מפגש של 70-80% ביום שלמחרת (כ-6 x 105 לכל T75). למחרת, יש להשבית על ידי דגירה של שעתיים ו-30 דקות עם 200 מיקרוליטר של 0.5 מ"ג/מ"ל מיטומיצין C (הוסף מיטומיצין ב-T75 המכיל MEFs ללא שינוי מדיה מוקדם).
    4. לאחר תקופת הדגירה, יש לשחזר תאים לאחר הדגירה עם תמיסת דיסוציאציה למשך 5 דקות ולזרוע לבארות שצופו בעבר בג'לטין בצלחת 6 בארות בריכוז 1x105 .
    5. מצפים בארות על ידי דגירה בתמיסת ג'לטין של 0.1% למשך 20 דקות ב-37 מעלות צלזיוס (כ-1 מ"ל תמיסת ג'לטין לבאר כדי לכסות את כל הבאר) ולשאוף מיד. לאחר מכן, הסר את התמיסה והחלף במדיום תרבות (2 מ"ל לבאר).
  2. טרנספקציה וייצור לנטי-ויראלי
    1. תרבית 293 תאים בצלוחיות תרבית T75 עד שהיא מגיעה לכ-90% מפגש.
    2. נתק תאים וזרע 5 x 106 תאים לכל בקבוק T75 חדש ללא אנטיביוטיקה.
    3. למחרת, הכינו שתי תמיסות לכל בקבוק (T75) לטרנספקציה: 1: 1.5 מ"ל של IMDM (ללא אנטיביוטיקה, ללא סרום) עם הריכוז המתאים של כל וקטור (12 מיקרוגרם OSKM; 1.2 מיקרוגרם TAT; 1.2 מיקרוגרם של REV; 1.2 מיקרוגרם של hgpm2, ו-2.4 מיקרוגרם שלVSVG 2°generation,); ו-2: 1.5 מ"ל של IMDM (ללא אנטיביוטיקה, ללא סרום) בתוספת 36 מיקרוליטר של מגיב ליפופקציה (או לפי המלצת היצרן) 15.
    4. מערבבים את התמיסות ודוגרים למשך 15 דקות.
    5. בינתיים, החלף את המדיום של 293 התאים, והוסף רק 7 מ"ל של IMDM בתוספת 10% FBS לבקבוק.
    6. לאחר תקופת הדגירה, הוסף 3 מ"ל של מגיב הליפופקציה + פלסמידים בכל בקבוק. החלף את המדיום ב-IMDM 10% FBS לאחר 6 שעות (אופציונלי).
    7. אסוף בינוני (נפח מלא - 10 מ"ל ל-T75) בנקודות הזמן 24, 48 ו-72 שעות. מסננים אותו עם מסנן PVDF 0.45 מ"מ ושוקלים אותו לאיזון לפני אולטרה-צנטריפוגה.
    8. צנטריפוגה למשך שעה ו-30 דקות בשעה ב-48,960 x גרם.
    9. יש להשליך את הסופרנטנט על ידי מזיגה ולדגור את התוכן הנותר (כ-200 מיקרוליטר) למשך שעה אחת בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    10. השעו מחדש את הכדור הנגיפי בעדינות למעלה ולמטה מספר פעמים ויש תמיסה ויראלית.
  3. התמרה
    1. זרע 2x104 פיברובלסטים לבאר של צלחת 6 בארות. כלול בארות לניתוח מולקולרי (למשל, PCR) ובקרות התמרה (למשל, ניתוחי GFP) (אופציונלי).
    2. למחרת, הסר 1 מ"ל של מדיום והוסף 1 מיקרוליטר של הקסדימטרין ברומיד (8 מיקרוגרם/מ"ל) ו-50 מיקרוליטר של התמיסה הנגיפית.
    3. דגירה למשך 3 עד 4 שעות, ולאחר מכן שינוי בינוני מלא (2 מ"ל) (יום 0).
    4. תאי תרבית למשך 5 ימים, מחליפים מדיום כל יומיים.
    5. הכינו בעבר צלחות מצופות ג'לטין 0.1% ו- MEF כמתואר בפריט 1.1.3.
    6. כדי להפריד תאים ולצבוע מחדש תאים במדיום תכנות מחדש, שטפו בארות באמצעות תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) של 1 מ"ל. הסר PBS.
    7. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה לבאר ודגר את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    8. העבירו תאים לצינור חרוטי ותאי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x גרם והשעו אותם מחדש ב-1-3 מ"ל של מדיום תרבית iPSC.
    9. ספרו את התאים באמצעות תא נויבאואר או ציוד מונה תאים וזרעו אותם בריכוז של 1-2 x 104 לבארות מצופות ג'לטין ומכוסות MEFs בעבר.
    10. החלף את מדיום תרבית iPSC כל יומיים.
    11. מושבות iPSC (במעבר 0, P0) יופיעו בערך 10 ימים מתקופת התכנות מחדש. בחר ידנית מושבות אופייניות מורפולוגית (קצוות עגולים ותאים עם יחס גרעיני-ציטופלזמה גבוה) באמצעות מחט 26 G כדי לנתק מושבה ו-MEFs שמסביב.
    12. העבר מושבה אחת לכל באר חדשה, בנפרד, באמצעות קצה פיפטה של 10 או 100 מיקרוליטר לתרבית משובטת ואפיון קווי תאי iPSC משוערים.
  4. מעבר iPSC חזיר
    1. מעבר ידני וקטיף מושבות
      1. נקה והעביר מיקרוסקופ הפוך למכסה המנוע הלמינר.
      2. עקר את המיקרוסקופ באור אולטרה סגול (UV) למשך 15 דקות.
      3. שטפו בארות מצופות ג'לטין ו-MEF בעבר עם PBS לפני העברת המושבה. הסר PBS.
      4. הוסף 2 מ"ל של מדיום iPSC.
      5. אתר את מושבת העניין בבאר שתשמש.
      6. בעזרת שיפוע של מחט מזרק אינסולין, הפרד את המושבה מהתאים שמסביב.
      7. אם המושבה קטנה, נתק אותה מהבאר על ידי פיפטינג בינוני למעלה ולמטה בגבולותיה עם פיפטה של 10 מיקרוליטר.
      8. אם מדובר במושבה גדולה יותר, חותכים אותה לכמה מקטעים קטנים יותר בעזרת המחט.
      9. שאפו את המושבה או את שברי המושבה בעזרת פיפטה של 10 מיקרוליטר.
      10. העבירו אותו לבאר החדשה.
    2. מעבר אנזימטי של קווים משובטים
      1. שטפו בארות באמצעות PBS. הסר PBS.
      2. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה לבאר ודגר את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
      3. מעבירים כ -100 מיקרוליטר תאים לבאר חדשה. כמות זו עשויה להשתנות בין קווי תאים שונים; לכן, מומלץ מאוד לבצע ניתוח חזותי יומי של מפגש.

2. אינדוקציה של iPSCs חזיר ל-NPCs

  1. הכנת ניסוי
    1. הכן מדיום אינדוקציה עצבית (NIM) המורכב מ-50% מדיום נוירו-בזאלי ו-50% DMEM/F-12 בתוספת B27-מינוס ויטמין A (20 מיקרוליטר/מ"ל), N2 (10 מיקרוליטר/מ"ל), 1 מ"מ גלוטמין (10 מיקרוליטר/מ"ל), פניצילין-סטרפטומיצין (1 מיקרוליטר/מ"ל). מסננים את התמיסה במסנן μm 0.22 ומוסיפים מעכב איתות BMP LDN193189 ומעכב ALK SB431542 בריכוז סופי של μM 0.1 ו- μM 10, בהתאמה.
    2. מצפים בארות של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל תמיסת מטריצה ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. הסר את תמיסת המטריצה והוסף מדיום E8 לתרבית iPSCs.
    3. ביום ה-13 של פרוטוקול האינדוקציה, הכינו מדיום התרחבות עצבית (NEM) המורכב מ-50% מדיום נוירו-בזאלי ו-50% DMEM/F-12 בתוספת ויטמין A B27-מינוס (20 מיקרוליטר/מ"ל), N2 (10 מיקרוליטר/מ"ל), NEAA (10 מיקרוליטר/מ"ל), 1 מ"מ גלוטמין (10 מיקרוליטר/מ"ל), פניצילין-סטרפטומיצין (1 מיקרוליטר/מ"ל). מסננים את התמיסה במסנן של 0.22 מיקרומטר ומוסיפים FGF2 ו-EGF לריכוז סופי של 10 ננוגרם/מ"ל.
  2. פרוטוקול אינדוקציה
    1. יום לפני שה-iPSCs מגיעים למפגש של 100%, העבירו תאים לבאר חדשה (פיצול 1:1). שוטפים את הבאר על ידי הוספת 1 מ"ל PBS. הסר PBS.
    2. הוסף 1 מ"ל של 0.5 מ"מ EDTA ודגר תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    3. הסר את EDTA והוסף 1 מ"ל של מדיום תרבות E8.
    4. שוטפים בעדינות תאים מהבאר ומעבירים את התכולה לבאר חדשה שצופה בעבר בתמיסת מטריצה.
    5. למחרת, שטפו בארות עם PBS. הסר PBS והוסף 2 מ"ל של NIM.
    6. החלף את אמצעי האינדוקציה כל יום למשך 14 יום.
    7. ביום ה-14 יש לשטוף בארות באמצעות PBS. הסר PBS.
    8. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים לבאר ודגר את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    9. העבירו תאים לצינור חרוטי ותאי צנטריפוגה למשך 5 דקות ב-300 x g והשעו אותם מחדש ב-6 מ"ל של מדיום NEM.
    10. הוסף 60 μL (10 μL/mL) של תמיסת התאוששות לאחר ההפשרה והעביר 2 מ"ל מהתמיסה לכל באר מצופה מטריצה.
    11. החלף את מדיום NEM למחרת, ולאחר מכן כל יומיים.
      הערה: כל באר שעברה את פרוטוקול האינדוקציה נחשבת כמולידה קו NPC חדש. לכן, אין לערבב את התאים שלהם.

3. מעבר NPC

  1. שוטפים היטב עם 1 מ"ל PBS. הסר PBS.
  2. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים ודגר תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
  3. שוטפים בעדינות את תאי הבאר ומעבירים את התכולה לצינור חרוטי.
  4. צנטריפוגה התמיסה למשך 5 דקות ב -300 x גרם. הסר את הסופרנטנט והוסף 6 מ"ל NEM.
  5. הומוגניזציה עדינה של הגלולה והעבירו 2 מ"ל מהתמיסה לבאר חדשה שצופה בעבר בתמיסת מטריצה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אפיון piPSC
האפיון נועד לקבוע את רכישת הפלוריפוטנטיות של התאים המתוכנתים מחדש. לשם כך בוצעו היווצרות עוברית, צביעה אימונופלואורסצנטית לסמני פלוריפוטנטיות, וביטוי גנים והתמיינות ספונטנית לגופים עובריים (EBs).

מושבות תאים שנוצרו הציגו מורפולוגיה שטוחה וקומפקטית באשכולות תאים עם גבולות מוגדרים היטב, כצפוי עבור piPSCs16, 17 ושונה מאוד ממורפולוגיה פיברובלסטים. הם היו חיוביים לפוספטאז אלקליין (איור 3<...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

באמצעות פרוטוקול זה, פיברובלסטים תוכנתו מחדש במבחנה באמצעות הביטוי האקסוגני של OCT4, SOX2, c-MYC ו-KLF4. התאים שתוכנתו מחדש נשמרו במבחנה במשך יותר מ-20 מעברים. כאשר שושלות אלה הוגשו להתמיינות העצבית באמצעות מעכבים כימיים, הן ביטאו את סמני תאי האב העצביים נסטין ו-GFAP, שאושרו על ידי RT-qPCR, והיו חיוביות ל-Nestin, β-Tubulin III ו-Vimentin על ידי אימונופלואורסצנטי. מעניין שאולי בשל האופי העוברי של הפיברובלסטים החזיריים המתוכנת מחדש המשמשים להתמיינות לתאי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

פרופ' קריסטין פרויד זוכה להכרה על הסיוע בפרוטוקולים ובדיונים מדעיים. עבודה זו נתמכה כספית על ידי מענקים מקרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP) (# 2015/26818-5, # 2017/13973-8 ו- # 2017/02159-8), המועצה הלאומית לפיתוח מדעי וטכנולוגי (CNPq # 433133/2018-0), והתיאום לשיפור כוח האדם להשכלה גבוהה (CAPES) (קוד מימון 001).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
293FTInvitrogen# R70007
6 צלחות בארCostar# 3516
anti-B-Tubulin IIIabcam# ab7751
anti-NANOGabcam# ab77095
anti-NESTINMillipore# ABD69
anti-OCT4Santa Cruz biotechnology# SC8628
anti-SOX2abcam# ab97959
anti-SSEA1Millipore# MAB4301
anti-TRA1-60Millipore# MAB4360
anti-VIMENTINabcam# ab8069
B27-Minus Vitamin ALife Technologies# 12587010
DMEM/F-12Life Technologies# 11960
חמור נגד עזים 488Invitrogen#  A11055
EGFSigma# E9644
סרום בקר עובריGibco# 10099
FGF2Peprotech# 100-18B
GlutaMAXGibco# 35050-061
גלוטמיןGibco# 25030-081
עז נגד עכבר 594Invitrogen#  A21044
עיזים נגד ארנב 488Invitrogen# A11008
Hexadimethrine bromideSigma Aldrich# 107689
HighCapacity  kitLife Technologies# 4368814
IMDMGibco# 12200-036
KnockOut DMEM/F-12Gibco# 12660-012
סרום נוקאאוט תחליףGibco# 10828-028
LDN-193189Sigma-Aldrich# SML0559
ערכת פוספטאז אלקליין לויקוציטיםSigma Aldrich# 86R
Lipofectamine P3000™Invitrogen# L3000-015
MatrigelCorning# 354277
Mitomycin CSigma Aldrich# M4287-2MG
N2Life Technologies# 17502048
Nanodrop ND-1000Nanodrop Technologies, Inc.
מדיום נוירו-בסיסיLife Technologies# 21103049
חומצות אמינו לא חיוניותGibco# 11140-050
פניצילין-סטרפטומיציןGibco# 15140-122
Revita CellGibco# A2644501
Rnase outLife Technologies# 10777019
SB431542Stemgent# 72232
StemPro AccutaseGibco# A11105-01
SW28 רוטורבקמן קולטר# 342207
TrizolLife Technologies# 15596026
TrypLE ExpressGibco# 12604-021
β-mercaptoethanolGibco# 21985-023

מקורות

  1. Clowry, G., Molnár, Z., Rakic, P. Renewed focus on the developing human neocortex. Journal of Anatomy. 217 (4), 276-288 (2010).
  2. Mungenast, A. E., Siegert, S., Tsai, L. -H. Modeling Alzheimer's disease with human induced pluripotent stem (iPS) cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 13-31 (2016).
  3. Ribitsch, I., et al. Large Animal Models in Regenerative Medicine and Tissue Engineering: To Do or Not to Do. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972(2020).
  4. Pessôa, L. V. deF., Bressan, F. F., Freude, K. K. Induced pluripotent stem cells throughout the animal kingdom: Availability and applications. World journal of stem cells. 11 (8), 491-505 (2019).
  5. Prather, R. S. Pig genomics for biomedicine. Nature Biotechnology. 31 (2), 122-124 (2013).
  6. Lind, N. M., et al. The use of pigs in neuroscience: Modeling brain disorders. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 31 (5), 728-751 (2007).
  7. Falk, A., et al. Capture of neuroepithelial-like stem cells from pluripotent stem cells provides a versatile system for in vitro production of human neurons. PLoS ONE. 7 (1), 1-13 (2012).
  8. Le Grand, J. N., Gonzalez-Cano, L., Pavlou, M. A., Schwamborn, J. C. Neural stem cells in Parkinson's disease: A role for neurogenesis defects in onset and progression. Cellular and Molecular Life Sciences. 72 (4), 773-797 (2015).
  9. Rasmussen, M. A., Hall, V. J., Carter, T. F., Hyttel, P. Directed differentiation of porcine epiblast-derived neural progenitor cells into neurons and glia. Stem Cell Research. 7 (2), 124-136 (2011).
  10. Poon, A., et al. Derivation of induced pluripotent stem cells from a familial Alzheimer's disease patient carrying the L282F mutation in presenilin 1. Stem Cell Research. 17 (3), 470-473 (2016).
  11. Brennand, K., et al. Modeling schizophrenia using {hiPSC} neurons. Nature. 473 (7346), 221-225 (2011).
  12. Strnadel, J., et al. Survival of syngeneic and allogeneic iPSC-derived neural precursors after spinal grafting in minipigs. Science Translational Medicine. 10 (440), (2018).
  13. Kobayashi, Y., et al. Pre-Evaluated Safe Human iPSC-Derived Neural Stem Cells Promote Functional Recovery after Spinal Cord Injury in Common Marmoset without Tumorigenicity. PLoS ONE. 7 (12), 1-13 (2012).
  14. Nori, S., et al. Grafted human-induced pluripotent stem-cell-derived neurospheres promote motor functional recovery after spinal cord injury in mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (40), 16825-16830 (2011).
  15. Bressan, F. F., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from large domestic animals. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 247(2020).
  16. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  17. Telugu, B. P. V. L., Ezashi, T., Roberts, R. M. Porcine induced pluripotent stem cells analogous to naïve and primed embryonic stem cells of the mouse. The International Journal of Developmental Biology. 54 (11-12), 1703-1711 (2010).
  18. Vicari de Figueire Pessôa, L., Pieri, C. G. N., Recchia, K., Fernandes Bressan, F. Induced Pluripotent Stem Cells from Animal Models: Applications on Translational Research. IntechOpen. , (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

תאי גזע פלוריפוטנטיים מושריים של חזיר (Porcine iPSCs)דיפרנציאציה של תאי גזענוירונים המופקים מ-iPSCמודל חזירנוירוวิทยา תרגומיתRT-qPCRסממנים אימונופלואורסצנטייםרפואה רגנרטיביתסממני NPC

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.