כאן, אנו מציגים מבחני תרבות משותפת קלים לשימוש כדי לנתח נדידת גליובלסטומה (GBM) על נוירונים בדוגמת. פיתחנו מאקרו בתוכנת FiJi לכימות קל של נדידת תאי GBM על נוירונים, והבחנו כי נוירונים לשנות קיבולת פולשנית של תא GBM.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
Glioblastomas (GBMs), כיתה IV גליומות ממאירות, הם אחד הסוגים הקטלניים ביותר של סרטן אנושי בגלל המאפיינים האגרסיביים שלהם. למרות ההתקדמות המשמעותית בגנטיקה של גידולים אלה, איך תאי GBM לפלוש parenchyma המוח בריא אינו מובן היטב. יש לציין כי הוכח כי תאי GBM פולשים לחלל הצמיגים בדרכים שונות; העניין העיקרי של נייר זה הוא המסלול לאורך דרכי חומר לבן (WMTs). האינטראקציות של תאים סרטניים עם רכיבי תאי העצבים הציצוניים אינן מאופיינים היטב. להלן, שיטה תוארה המעריכה את ההשפעה של נוירונים על פלישת תאים GBM. מאמר זה מציג תרבות משותפת מתקדמת במבחנה המחקה פלישת WMT על ידי ניתוח הנדידה של תאים דמויי גזע GBM על נוירונים. ההתנהגות של תאי GBM בנוכחות נוירונים מנוטרת באמצעות הליך מעקב אוטומטי עם תוכנת קוד פתוח וגישה חופשית. שיטה זו שימושית עבור יישומים רבים, בפרט, עבור מחקרים פונקציונליים ומכניסטיים, כמו גם לניתוח ההשפעות של סוכנים תרופתיים שיכולים לחסום נדידת תאים GBM על נוירונים.
מבוא
גליומות ממאירות ראשוניות, כולל GBMs, הן גידולים הרסניים, עם שיעור הישרדות בינוני של 12 עד 15 חודשים שדווחו לחולי GBM. הטיפול הנוכחי מסתמך על כריתה גדולה של מסת הגידול וכימותרפיה בשילוב עם הקרנות, אשר רק מאריך את שיעור ההישרדות בכמה חודשים. כשלים טיפוליים קשורים קשר הדוק לאספקת סמים לקויה על פני מחסום הדם - מוח (BBB) ולצמיחה פולשנית בחללים perivascular, קרום המוח, ולאורך WMTs1. פלישה Perivascular, המכונה גם שיתוף כלי דם אפשרות, הוא תהליך נחקר היטב, ואת המנגנונים המולקולריים מתחילים להיות ברורים; עם זאת, תהליך הפלישה לתא GBM לאורך WMTs אינו מובן היטב. תאים סרטניים נודדים למוח הבריא לאורך המבנים המשניים של שרר2. ואכן, לפני ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל החולים (מבית החולים האוקלאנד, ברגן, נורווגיה, על פי תקנות ועדת האתיקה המקומית). פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות ועדות האתיקה של מחקר בני אדם ובעלי חיים באוניברסיטת בורדו. חולדות בהריון שוכנו וטופלו במתקן החיות של אוניברסיטת בורדו. המתת חסד של חולדה בהריון ב-E18 בוצעה באמצעות CO2. כל ההליכים בבעלי חיים נעשו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. כל המוצרים המסחריים מוזכרים בטבלת החומרים.
1. הכנת השקופיות בדוגמת
- הכנת מצע למיקרופטרנינג
- לטפל 18 מ"מ זכוכית מעגלית coverslips על ידי הפעלת אוויר / פלזמה במשך 5 דקות. מניחים את הכיסויים בתא סגור עם 100 μL של (3....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
נוירונים בעלי תבנית משותפת עם תאי GBM פלואורסצנטיים הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקול, ובוצעו ניסויי מעקב. תאי GBM שינו במהירות את צורתם תוך כדי הגירה לנוירונים (איור 1B: לוח 6 ווידאו 1). תאים היגרו לאורך ההרחבות העצביות, בתנועה אקראית (וידאו 1). ניתן להבחין בקלות בין תאי GBM פלואורסצנטיים לבין תאי עצב שאינם פלואורסצנטיים, והדבר איפשר מעקב אחר תנועות תאים באמצעות המאקרו של פיג'י, כמתואר בסעיף הפרוטוקול (איור 2). פיג.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
Glioblastomas לפלוש בהרחבה parenchyma באמצעות מצבים שונים: אפשרות משותפת של כלי הדם שמסביב, פלישה ביניים, או פלישה על WMTs18. מצב זה אינו מאופיין היטב בספרות בגלל הקושי למצוא מתאים במבחנה או במודלים vivo הקשורים פלישת WMT. כאן, מודל פשוט הוצע שבו נוירונים מכרסמים מתורבתים היו בדוגמת על משטחים מצופים למין, ותאים דמויי גזע GBM פלואורסצנטיים נזרעו על גבי הנוירונים. דפוס צורת רשת שימש במחקר זה כדי לשפר את הניתוח של חיבור תאים סרטניים, פלישה, והתפשטות. תאי GBM היגרו ביעילות רבה יותר ע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי פונדציה ARC 2020, ליגה קונטרה לה סרטן (Comite de la Gironde), ARTC, תוכנית סרטן 2021, INCA PLBIO. Alveole נתמך על ידי סוכנות לאומית דה לה Recherche (גרנט Labex מוח ANR-10-LABX-43). ז'וריס גיאון הוא מקבל מלגת בית החולים האוניברסיטאי טולוז (CHU טולוז).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| (3-אמינופרופיל) triethoxysilane | Sigma | 440140-100ML | קבוצת האמינו שימושית לצימוד ביולוגי של mPEG-SVA |
| 96 בארות צלחת תחתונה עגולה | Sarstedt | 2582624 | משמש להכנת ספרואידים |
| Accutase | Gibco | A11105-01 | מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C (לטווח ארוך) או 4 ° C (לטווח קצר), אנזים דיסוציאציה כדורית |
| B27 | Gibco | 12587 | מאוחסן ב-20 מעלות; C, הפשרה לפני השימוש |
| Basic Fibroblast Growth Factor | Peprotech | 100-18B | מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, הפשרה לפני השימוש |
| תא ספירת תאים רוזנת Slides | Invitrogen | C10283 | משמש לספירת תאים |
| Coverslips | Marienfeld | 111580 | מצע תרבית תאים |
| מחסניות Dessicator | Sigma | Z363456-6EA | משמש להפחתת הרוב במהלך טיפול (3-אמינופרופיל) triethoxysilane |
| DPBS 10x | Pan Biotech | P04-53-500 | מאוחסן ב -4 ° |
| C תוכנת פיג'י, MTrack2 מאקרו | ImageJ | משמש לניתוח תמונות | |
| בקבוק 75 ס"מ² | Falcon | 10497302 | |
| HBSS | Sigma | H8264-500ML | |
| Heparin נתרן | Sigma | H3149-100KU | מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| Laminin | 114956-81-9 | מקדם הידבקות עצבית | |
| לאונרדו | של מיקרו-דפוסים חזויים | ||
| תוכנת MetaMorph | Molecular Devices LLC | NA | תוכנת אוטומציה למיקרוסקופיה |
| Methylcellulose | Sigma | M0512 | מדולל ב-NBM לריכוז סופי של 2% מדיום |
| נוירו-בזאלי | Gibco | 21103-049 | מאוחסן ב-4 מעלות; C |
| Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA) | מיקרוסקופ הפוך המצויד בבמה ממונעת | ||
| פניצילין - סטרפטומיצין | גיבקו | 15140-122 | מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| PLPP | Alveole | PLPPclassic_1ml | Photoinitiator המשמש לפירוק מברשת PEG |
| Poly (אתילן גליקול)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA) | Laysan Bio | VA-PEG-VA-5000-5g | משמש כציפוי נגד עכירות |
| PRIMO | Alveole | PRIMO1 | מכשיר הקרנת UV מבוסס מכשיר מיקרו-מראה דיגיטלי (DMD) |
| טריפאן 0.4% | ThermoFisher | T10282 | משמש לספירת תאים |
| Trypsin-EDTA | Sigma | T4049-100ML | משמש לניתוק תאים דבקים |
מקורות
- Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
- Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
