הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר

6.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62213

⸱

24 בפברואר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1University Bordeaux, INSERM, LAMC, U1029, 33600, Pessac, France, 2Univ. Bordeaux, CNRS, Interdisciplinary Institute for Neuroscience, IINS, UMR 5297, Bordeaux, France, 3Alvéole, Bordeaux, France, 4University Bordeaux, CNRS, IBGC, UMR5095, 33000, Bordeaux, France

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים מבחני תרבות משותפת קלים לשימוש כדי לנתח נדידת גליובלסטומה (GBM) על נוירונים בדוגמת. פיתחנו מאקרו בתוכנת FiJi לכימות קל של נדידת תאי GBM על נוירונים, והבחנו כי נוירונים לשנות קיבולת פולשנית של תא GBM.

תקציר

Glioblastomas (GBMs), כיתה IV גליומות ממאירות, הם אחד הסוגים הקטלניים ביותר של סרטן אנושי בגלל המאפיינים האגרסיביים שלהם. למרות ההתקדמות המשמעותית בגנטיקה של גידולים אלה, איך תאי GBM לפלוש parenchyma המוח בריא אינו מובן היטב. יש לציין כי הוכח כי תאי GBM פולשים לחלל הצמיגים בדרכים שונות; העניין העיקרי של נייר זה הוא המסלול לאורך דרכי חומר לבן (WMTs). האינטראקציות של תאים סרטניים עם רכיבי תאי העצבים הציצוניים אינן מאופיינים היטב. להלן, שיטה תוארה המעריכה את ההשפעה של נוירונים על פלישת תאים GBM. מאמר זה מציג תרבות משותפת מתקדמת במבחנה המחקה פלישת WMT על ידי ניתוח הנדידה של תאים דמויי גזע GBM על נוירונים. ההתנהגות של תאי GBM בנוכחות נוירונים מנוטרת באמצעות הליך מעקב אוטומטי עם תוכנת קוד פתוח וגישה חופשית. שיטה זו שימושית עבור יישומים רבים, בפרט, עבור מחקרים פונקציונליים ומכניסטיים, כמו גם לניתוח ההשפעות של סוכנים תרופתיים שיכולים לחסום נדידת תאים GBM על נוירונים.

מבוא

גליומות ממאירות ראשוניות, כולל GBMs, הן גידולים הרסניים, עם שיעור הישרדות בינוני של 12 עד 15 חודשים שדווחו לחולי GBM. הטיפול הנוכחי מסתמך על כריתה גדולה של מסת הגידול וכימותרפיה בשילוב עם הקרנות, אשר רק מאריך את שיעור ההישרדות בכמה חודשים. כשלים טיפוליים קשורים קשר הדוק לאספקת סמים לקויה על פני מחסום הדם - מוח (BBB) ולצמיחה פולשנית בחללים perivascular, קרום המוח, ולאורך WMTs1. פלישה Perivascular, המכונה גם שיתוף כלי דם אפשרות, הוא תהליך נחקר היטב, ואת המנגנונים המולקולריים מתחילים להיות ברורים; עם זאת, תהליך הפלישה לתא GBM לאורך WMTs אינו מובן היטב. תאים סרטניים נודדים למוח הבריא לאורך המבנים המשניים של שרר2. ואכן, לפני כמעט מאה שנה, הנס-יואכים שרר תיאר את הנתיבים הפולשניים של GBM, שכעת מכונים satellitosis פרינורונלי, satellitosis perivascular, התפשטות תת-צינורית, פלישה לאורך WMT (איור 1A).

כמה כימוקינים הקולטנים שלהם, כגון פקטור-1α (SDF1α) ו C-X-C מוטיב קולטן כימוקין 4 (CXCR4), אבל לא גורם גדילה אנדותל כלי הדם (VEGF), נראה מעורב פלישת WMT3. לאחרונה, ציר NOTCH1-SOX2 transcellular הוכח להיות מסלול חשוב בפלישה WMT של תאים GBM4. המחברים תיארו כיצד תאים דמויי גזע GBM לפלוש parenchyma המוח על נוירונים unmyelinated חלקית, מה שמרמז על הרס של נדן מיאלין על ידי תאים GBM. אבן דרך הושגה בשנת 2019 כאשר שלושה מאמרים פורסמו בכתב העת Nature, והדגישו את תפקידה של הפעילות החשמלית בפיתוח גליומה5,6. עבודה מכוננת של מונג'ה ומשתפי פעולה שופכת אור על התפקיד המרכזי של פעילות חשמלית בהפרשת נוירוליגין-3, המקדמת פיתוח גליומה.

וינקלר ומשתפי פעולה תיארו קשרים בין תאי GBM (microtubes) להיות חיוני בשלבים פולשניים, ולאחרונה, אינטראקציות בין תאים GBM ותאי עצב באמצעות סינפסות נוירוגליומה שתוארו לאחרונה. מבנים אלה מעדיפים גירוי גלוטמטרגי של קולטני α אמינו-3-הידרוקסי-5-מתיל-4-isoxazolepropionic (אמפא) הממוקמים בקרום התא GBM, המקדם התפתחות גידולים ופלישה. פלישת תאים סרטניים היא תהליך מרכזי בהפצת גרורות או מוקדים משניים מרוחקים, כפי שנצפה בחולי GBM. מספר גורמים זוהו להיות חשובים פלישת GBM כגון תרומבוספונדין-1, בטא גורם גדילה טרנספורמציה (חלבון מטריקוולרי מוסדר TGFβ, או קולטן כימוקין CXCR3)7,8.

כאן, מודל ביומימטי פשוט תואר לחקר פלישת GBM, שבו נוירונים מעוצבים על עקבות של למין, ותאי GBM נזרעים עליו, כתאים בודדים או כספרוידים(איור 1B). שתי ההגדרות הניסיוניות נועדו לשחזר את הפלישה לנוירונים, אשר נצפתה ב GBM9,10,11. מודלים כאלה פותחו בעבר כמו ביו-חומרים nanofiber מיושר (electrospinning קליפת ליבה) המאפשרים ללמוד נדידת תאים על ידי אפנון תכונות מכניות או כימיות12. מודל התרבות המשותפת המתואר במאמר זה מאפשר הבנה טובה יותר של האופן שבו תאי GBM בורחים על נוירונים על ידי הגדרת מסלולים מולקולריים חדשים המעורבים בתהליך זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל החולים (מבית החולים האוקלאנד, ברגן, נורווגיה, על פי תקנות ועדת האתיקה המקומית). פרוטוקול זה פועל בהתאם להנחיות ועדות האתיקה של מחקר בני אדם ובעלי חיים באוניברסיטת בורדו. חולדות בהריון שוכנו וטופלו במתקן החיות של אוניברסיטת בורדו. המתת חסד של חולדה בהריון ב-E18 בוצעה באמצעות CO2. כל ההליכים בבעלי חיים נעשו בהתאם להנחיות המוסדיות ואושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית. כל המוצרים המסחריים מוזכרים בטבלת החומרים.

1. הכנת השקופיות בדוגמת

  1. הכנת מצע למיקרופטרנינג
    1. לטפל 18 מ"מ זכוכית מעגלית coverslips על ידי הפעלת אוויר / פלזמה במשך 5 דקות. מניחים את הכיסויים בתא סגור עם 100 μL של (3-aminopropyl) triethoxysilane ב יבוש במשך 1 שעות.
    2. דגירה עם 100 מ"ג / מ"ל של פולי (אתילן גליקול)-succinimidyl valerate (משקל מולקולרי 5,000 (פג-SVA)) ב 10 mM מאגר קרבונט, pH > 8, עבור 1 שעות. יש לשטוף באופן נרחב במים אולטרה-דקים, ולייבש מתחת למכסה המנוע הכימי.
      הערה: בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס בחושך לשימוש נוסף.
    3. הוסף את הפוטויניאטיאט, 4-בנזואילבנזיל-טרימתילמוניום כלוריד (PLPP), ב 14.7 מ"ג / מ"ל מלוחים אגירה פוספט (PBS).
      הערה: ניתן להשתמש גם בצורה מרוכזת של PLPP, ג'ל PLPP. התוצאה היא זמן תאורה אולטרה סגול (UV) קצר יותר הנדרש כדי לבזות את מברשת PEG (100 mJ / mm2).
  2. תצהיר ג'ל פוטוניאטיאטור
    1. הכן תערובת של 3 μL של ג'ל PLPP ו 50 μL של אתנול מוחלט להפקיד במרכז המגלשה. מניחים את הדגימה מתחת למכסה המנוע הכימי עד לאידוי מלא של האתנול המוחלט.
      הערה: בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן ב 4 מעלות צלזיוס בחושך לשימוש נוסף.
  3. מיקרו-patterning של שקופית זכוכית
    1. הר את הכיסוי בתא לודין, והנח אותו על הבמה הממונעת של מיקרוסקופ מצויד במערכת מיקוד אוטומטית.
    2. טען תמונות המתאימות למיקרופטרנים החזויים לתוכנה. החל פרמטרים אלה: שכפול 4 x 4 פעמים, מרווח של 200 מיקרומטר, מינון UV של 1,000 mJ / mm2. לאחר רצף תאורת UV אוטומטי, לשטוף את PLPP משם עם שטיפת PBS מרובים.
      הערה: אם נעשה שימוש בג'ל PLPP, הסר אותו על ידי שטיפות נרחבות עם מים deionized, יבש בזרם של N2, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס.
    3. דגירה עם למין (50 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS) במשך 30 דקות. לשטוף בהרחבה עם PBS.
      הערה: פתרון פלואורסצנטי של חלבון פלואורסצנטי ירוק מטוהר (GFP, 10 מיקרוגרם / מ"ל ב- PBS) ניתן לערבב עם למין כדי לדמיין את micropatterns על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

2. הכנת נוירונים ותאי GBM לתרבות משותפת

  1. תרבות של נוירונים היפוקמפוס עכברוש עוברי
    1. לנתח את ההיפוקמפוס של חולדות עובריות (E18), ולהעביר את הרקמה לתוך תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)/1 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES)/פניצילין-סטרפטומיצין פתרון בצינור 15 מ"ל. הסר פתרון עודף מבלי לייבש את ההיפוקמפוס.
    2. הוסף 5 מ"ל של חומצה טטראאצטית טריפסין-אתילנדיאמין (EDTA) בתוספת פניצילין (10,000 יחידות / מ"ל)/ סטרפטומיצין (10,000 מיקרוגרם / מ"ל) ו 1 mM HEPES, ודגרת במשך 15 דקות ב 37 °C (37 °F). לשטוף 2x עם HBSS / HEPES / פניצילין-סטרפטומיצין פתרון, ולתת את הרקמה להישאר בתמיסה זו במשך 2-3 דקות.
    3. לנתק את הרקמה באמצעות שתי פיפטות פסטר מלוטש להבה, על ידי pipetting למעלה ולמטה 10x עם כל רקמה, דואג למזער קצף. לספור את התאים, ולהעריך את הכדאיות של השעיית התא. צלחת הנוירונים על כיסויים micropatterned כפי שצוין להלן.
      הערה: שיעור הכדאיות של התא הוא 85-90% לאחר החילוץ.
  2. תרבית תאים לנוירונים על עטיפות מיקרו-patterned
    1. Rehydrate שקופיות זכוכית micropatterned עם PBS, ולהדגיר מדיום תרבית תאים עצביים מלאה.
    2. זרעו את תאי העצב ההיפוקמפוסיים המתקבלים מעכברושים E18 Sprague-Dawley ישירות מעל כיסויי הזכוכית המיקרו-פטרונית בצפיפות של 50,000 תאים לס"מ2 במדיום נוירובאסלי (NBM) מועשר ב-3% סרום סוסים. מניחים את הנוירונים micropatterned באינקובטור (37 °C (37 °F, 5% CO2) עבור 48 שעות.
      הערה: לאחר ~ 6 שעות, נוירונים היפוקמפוס ראשוני ניתן לראות דבק micropatterns למינין.
  3. תרבות משותפת של תאים דמויי גזע GBM אנושיים על נוירונים
    הערה: עבור מחקר זה, ממברנה GFP חיובי ועגבניות גרעיניות נגזר תאים GBM נגזר החולה גדלו על פי פרוטוקולים קודמים שפורסמו10.
    1. כמו תאים בצורת ספרואיד לגדול בהשעיה, צנטריפוגה ההשעיה במשך 5 דקות ב 200 × גרם. לשטוף את spheroids עם 5 מ"ל של PBS, ולהדגיר את התאים עם 0.5 מ"ל של מגיב ניתוק התא (ראה את הטבלה של חומרים)במשך 5 דקות ב 37 °C (69 °F).
    2. הוסף 4.5 מ"ל של NBM מלא (משלים עם תוספת B27, הפרין, גורם גדילה fibroblast 2, פניצילין, ו סטרפטומיצין, כמתואר קודםלכן 8), ולספור את התאים באמצעות טכניקת ספירה אוטומטית.
    3. זרעים 1,000 GBM תאים על התרבות העצבית micropatterned ב NBM מועשר 3% סרום סוס. דגירה את הצלחת ב 37 °C (67 °F), 5% CO2, ו 95% לחות.

3. הדמיית תאים חיה

  1. מיד לאחר זריעת תא GBM, מניחים את המדגם על הבמה של מיקרוסקופ הפוך מצויד בתא תרמוסטט. בצע הדמיה של תאים חיים במיקרוסקופ המצויד בשלב ממונע לרישום עמדות מרובות באמצעות ארגז כלים רב-ממדי לרכישות בתוכנה. לרכוש בהירות ו epifluorescence GFP / עגבניות תמונות כל 5 דקות מעל 12 שעות עם מטרה 20x בטמפרטורה (37 °C (37 °C) וגז מבוקר (5% CO2) הסביבה.

4. ניתוח תמונה

הערה: באמצעות פיג'י, מחסנית תמונות דו-ממדית (2D) עובדה או עובדה באופן חצי אוטומטי באמצעות כלי תוצרת בית וידידותי למשתמש (זמין בכתובת זו: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md), הכתוב בשפת המאקרו IJ1 (איור 2A). זרימת העבודה וההליכים האוטומטיים מסוכמים באיור 2B.

  1. ניתוח רשת עצבית (איור 2Bi)
    1. בחר תמונה אחת של הערימה. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכלי רשת כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח 'אפשרויות' המתאימה ולהתאים את ההגדרות (למשל, סף = משולש, לי, הואנג..., טשטוש גאוסיאניומסננים חציוניים = 1, 2, 3...) כדי ליצור פילוח מדויק של תמונות. לאחר מכן, לחץ על אישור.
    2. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכלי רשת כדי להפעיל באופן אוטומטי את ההליך הבא.
      1. שכפלו את התמונה שנבחרה ופיצלו אותה לשלושה ערוצי צבע (אדום-אפור-ירוק).
      2. בחרו בערוץ האפור (brightfield) ובצעו שיפור מתיחת ניגודיות (CSE) כדי לשפר את ההפרדה בין אזורים שונים. השתמש בגלאי קצה Sobel (SED) כדי לבצע את פעולת התבבולות של עיבוד אותות דו-מימדית שכבר מקובצה תחת הפקודה 'חפש קצה'.
      3. לסינון כפול (F), החל טשטוש גאוסיאני ומסנן חציוני כדי להפחית רעש ולהחליק את אות האובייקט. המר למסיכה (CM) על-ידי ביצוע אלגוריתמי סף מותאמים כדי להשיג תמונה בינארית (BIN-grey) עם פיקסלים שחורים (אזור תא) ופיקסלים לבנים (רקע). שלד (Sk) אזור התא לרשת פשוטה (NET), וחלקיקי סינון (EP) בתמונת NET על-ידי הסרת חלקיקים קטנים שאינם מרושתים.
      4. עבור ערוצים אדומים וירוקים (גרעין וממברנה), בצע סינון כפול, המר למסיכה בשיטת הסף המותאמת ואפשר ל- BIN-green לקבוע מורפולוגיה של תאים באמצעות הפקודה נתח חלקיקים.
      5. מזג את כל הערוצים באמצעות אזור העניין (ROI) שלהם עם האופרטור OR (לשלב), והתאם מחדש את הצבע הראשוני שלהם לתמונת RGB פשוטה.
  2. ניתוח תנועתיות חד-תאית (איור 2Bii)
    1. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכלי מעקב אחר תא יחיד כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח אפשרויות המתאימות, ולהתאים את ההגדרות (למשל, סוג שביל = גרעין או קרום, סף = משולש, לי, הואנג..., הקרנת Z = עוצמת מרבית, פרוסות סכום..., טשטוש גאוסיאני ומסננים חציוניים = 1, 2, 3...) כדי לייצר פילוח מדויק של תמונות. לאחר מכן, לחץ על אישור.
    2. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכלי מעקב אחר תא בודד כדי להפעיל באופן אוטומטי את ההליך הבא.
      1. הסר את הערוץ האפור. החל הקרנת Z על המחסנית, שתיצור תמונה המתאימה לערימת תמונות בהתאם לשעה (מחסנית T). מסננים פעמיים וממירים למסווה את השבילים שהותירו התאים. הסר חלקיקים קטנים לתמונה BIN-אדום/ירוק.
      2. באמצעות החזר על ההשקעה, בחר כל מיתאר של מעקב התא וסמן את התיבה דלג על זיהוי קצה בתיבת הדו-שיח אפשרויות כדי לדלג על שלב עיבוד מקדים זה עבור השלבים הבאים.
      3. בודדו את הערוץ האדום(סוג שביל = גרעין) בערימה המקורית. בחר החזר החזר על ההשקעה אחד והסר את האזור החיצוני. סנן פעמיים את כל התמונות והמר למסיכה (BIN-red). קבעו את מיקום ה-X/Y של כל גרעין בינארי.
    3. באמצעות מאקרו שכבר פורסם עבור תוכנת גיליון אלקטרוני13, חשב את התזוזה הריבועית הממוצעת, את יחס הכיווניות ואת המהירות הממוצעת עבור תא זה.
  3. ניתוח מעקב אחר תאים מרובים (איור 2Biii)
    1. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכלי מעקב כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח אפשרויות המתאימות ולהתאים את ההגדרות (למשל, סף = משולש, לי, הואנג..., טשטוש גאוסיאני ומסננים חציוני = 1, 2, 3...) כדי לייצר פילוח מדויק של תמונות. לאחר מכן, לחץ על אישור.
    2. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכלי מעקב כדי להפעיל באופן אוטומטי את ההליך הבא.
      1. הסר את הערוץ האפור.
      2. פצל את הערוצים האדומים והירוקים, סנן פעמיים והמר למסיכה.
      3. מזג את הערוצים באמצעות מחשבון תמונה... עם האופרטור AND, משאיר רק את אות הגרעין שנמצא בקרומים.
        הערה: ניתן להשתמש במספר תוספים בפיג'י כדי לקבוע את מיקום ה- X/Y של מספר תאים בתמונה בינארית מעובדת מראש זו בו-זמנית (ראה טבלת החומרים).
    3. באמצעות מאקרו13שתואר קודם לכן , חשב את התוויית המסלול, ממוצע ההעתקה הריבועית, יחס הכיווניות והמהירות הממוצעת עבור תאים אלה.
  4. נדידת ספרואידים על המחצלת העצבית (איור 2Biv)
    1. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכלי העברה כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח אפשרויות המתאימות ולהתאים את ההגדרות (למשל, סף = משולש, לי, הואנג..., טשטוש גאוסיאני ומסננים חציוניים = 1, 2, 3...) כדי לייצר פילוח מדויק של תמונות. לאחר מכן, לחץ על אישור.
    2. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הכלי העברה כדי להפעיל באופן אוטומטי את ההליך הבא.
      1. הסר את הערוץ האדום.
      2. לפצל את הערוצים הירוקים והאפורים.
      3. עבור הערוץ האפור, צייר ידנית את קווי המתאר של המחצלת העצבית, ומדוד את האזור שלה.
      4. לערוץ הירוק, מסננים פעמיים את המחסנית וממירים למסיכה. הסר את האזור שמחוץ לדוגמת המילוי (BIN) וקבע את אזור התא הבינארי עבור כל תמונה.
        הערה: הפרמטרים המתוארים לעיל מכוילים על-ידי שינוי הערכים שלהם על-ידי לחיצה שמאלית על סמל העניין. עיבוד זה יכול להיעשות באופן ידני. עם זאת, עבור מספר רב של תמונות (כמאה לכל רכישות), ערוצים (בדרך כלל 3 ערוצים) ושלבי עיבוד, כלי אוטומטי או אוטומטי למחצה יהיה עדיף.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

נוירונים בעלי תבנית משותפת עם תאי GBM פלואורסצנטיים הוכנו כמתואר בסעיף הפרוטוקול, ובוצעו ניסויי מעקב. תאי GBM שינו במהירות את צורתם תוך כדי הגירה לנוירונים (איור 1B: לוח 6 ווידאו 1). תאים היגרו לאורך ההרחבות העצביות, בתנועה אקראית (וידאו 1). ניתן להבחין בקלות בין תאי GBM פלואורסצנטיים לבין תאי עצב שאינם פלואורסצנטיים, והדבר איפשר מעקב אחר תנועות תאים באמצעות המאקרו של פיג'י, כמתואר בסעיף הפרוטוקול (איור 2). פיג...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

Glioblastomas לפלוש בהרחבה parenchyma באמצעות מצבים שונים: אפשרות משותפת של כלי הדם שמסביב, פלישה ביניים, או פלישה על WMTs18. מצב זה אינו מאופיין היטב בספרות בגלל הקושי למצוא מתאים במבחנה או במודלים vivo הקשורים פלישת WMT. כאן, מודל פשוט הוצע שבו נוירונים מכרסמים מתורבתים היו בדוגמת על משטחים מצופים למין, ותאים דמויי גזע GBM פלואורסצנטיים נזרעו על גבי הנוירונים. דפוס צורת רשת שימש במחקר זה כדי לשפר את הניתוח של חיבור תאים סרטניים, פלישה, והתפשטות. תאי GBM היגרו ביעילות רבה יותר ע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פונדציה ARC 2020, ליגה קונטרה לה סרטן (Comite de la Gironde), ARTC, תוכנית סרטן 2021, INCA PLBIO. Alveole נתמך על ידי סוכנות לאומית דה לה Recherche (גרנט Labex מוח ANR-10-LABX-43). ז'וריס גיאון הוא מקבל מלגת בית החולים האוניברסיטאי טולוז (CHU טולוז).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
(3-אמינופרופיל) triethoxysilaneSigma440140-100MLקבוצת האמינו שימושית לצימוד ביולוגי של mPEG-SVA
96 בארות צלחת תחתונה עגולהSarstedt2582624משמש להכנת ספרואידים
AccutaseGibcoA11105-01מאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C (לטווח ארוך) או 4 ° C (לטווח קצר), אנזים דיסוציאציה כדורית
B27Gibco12587מאוחסן ב-20 מעלות; C, הפשרה לפני השימוש
Basic Fibroblast Growth FactorPeprotech100-18Bמאוחסן בטמפרטורה של -20 מעלות; C, הפשרה לפני השימוש
תא ספירת תאים רוזנת SlidesInvitrogenC10283משמש לספירת תאים
CoverslipsMarienfeld111580מצע תרבית תאים
מחסניות DessicatorSigmaZ363456-6EAמשמש להפחתת הרוב במהלך טיפול (3-אמינופרופיל) triethoxysilane
DPBS 10xPan BiotechP04-53-500מאוחסן ב -4 °
C תוכנת פיג'י, MTrack2 מאקרוImageJמשמש לניתוח תמונות
בקבוק 75 ס"מ²Falcon10497302
HBSSSigmaH8264-500ML
Heparin נתרןSigmaH3149-100KUמאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
Laminin114956-81-9מקדם הידבקות עצבית
לאונרדושל מיקרו-דפוסים חזויים
תוכנת MetaMorph Molecular Devices LLCNAתוכנת אוטומציה למיקרוסקופיה
MethylcelluloseSigmaM0512מדולל ב-NBM לריכוז סופי של 2% מדיום
נוירו-בזאליGibco21103-049מאוחסן ב-4 מעלות; C
Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)מיקרוסקופ הפוך המצויד בבמה ממונעת 
פניצילין - סטרפטומיציןגיבקו15140-122מאוחסן בטמפרטורה של 4 מעלות; C
PLPPAlveolePLPPclassic_1mlPhotoinitiator המשמש לפירוק מברשת PEG
Poly (אתילן גליקול)-Succinimidyl Valerate (mPEG-SVA)Laysan BioVA-PEG-VA-5000-5gמשמש כציפוי נגד עכירות
PRIMOAlveolePRIMO1מכשיר הקרנת UV מבוסס מכשיר מיקרו-מראה דיגיטלי (DMD)
טריפאן 0.4%ThermoFisherT10282משמש לספירת תאים
Trypsin-EDTASigmaT4049-100MLמשמש לניתוק תאים דבקים
טעינת תוכנת כחול

מקורות

  1. Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. Current challenges and opportunities in treating glioblastoma. Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).
  2. Scherer, H. J. The forms of growth in gliomas and their practical significance. Brain. 63, 1-35 (1940).
  3. Zagzag, D., et al. Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas. American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).
  4. Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).
  5. Venkataramani, V., et al. Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression. Nature. 573, 532-538 (2019).
  6. Venkatesh, H. S., et al. Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits. Nature. 573, 539-545 (2019).
  7. Boyé, K., et al. The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors. Nature Communications. 8, 1571(2017).
  8. Daubon, T., et al. Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development. Nature Communications. 10, 1146(2019).
  9. Gritsenko, P. G., et al. p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks. Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).
  10. Guyon, J., et al. A 3D spheroid model for glioblastoma. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).
  11. Strale, P. O., et al. Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption. Advanced Materials. , (2015).
  12. Rao, S. S., et al. Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors. Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).
  13. Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells. MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).
  14. Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems. Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).
  15. Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates. Advance Healthcare Materials. 9, 2000519(2020).
  16. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145, 831-834 (2011).
  17. Clark, A. J., et al. Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination. Brain. 140, 898-913 (2017).
  18. Linkous, A., et al. Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids. Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).
  19. Han, M., et al. Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling. Brain. 143, 512-530 (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

גלה מאמרים נוספים

תאי גבעול של גליובלסטומהתרבית משותפת של נוירוניםנדידת תאיםמסלולי חומר לבןדימיון תאים חייםמעקב אחר תא בודדמיקרוסקופיה קונפוקליתניתוח רשתות נוירונליותניידות תאים
תרבות משותפת של תאים דמויי גזע גליובלסטומה על נוירונים בדוגמת ללמוד הגירה ואינטראקציות הסלולר
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.