מאמר שיטה

גיבוש ואפיון חלקיקי שומנים בדם לאספקת גנים באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית

DOI:

10.3791/62226

⸱

25 בפברואר 2021

 ,  ,  ,  , 
1Biologics Drug Product Development & Manufacturing, Sanofi, Framingham, Massachusetts

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלקיקי שומנים מפותחים באמצעות גישה פלטפורמת ערבוב microfluidic עבור mRNA ו- DNA אנקפסולציה.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נשאי תרופות מבוססי שומנים שימשו למערכות אספקה זמינות קלינית ומסחרית בשל גודלן הקטן, תאימות ביולוגית ויעילות אנקפסולציה גבוהה. השימוש בננו-חלקיקי שומנים בדם (LNPs) כדי לתמצת חומצות גרעין הוא יתרון כדי להגן על ה- RNA או ה- DNA מפני השפלה, תוך קידום ספיגת התאים. LNPs מכילים לעתים קרובות רכיבי שומנים מרובים כולל שומנים מיומנים, שומנים עוזרים, כולסטרול, פוליאתילן גליקול (PEG) שומנים מצומדים. LNPs יכול בקלות לתמצת חומצות גרעין בשל נוכחות שומנים מיונן, אשר ב- pH נמוך הוא קטי ומאפשר קומפלקס עם RNA טעון שלילית או DNA. כאן LNPs נוצרים על ידי אנקפסולציה RNA messenger (mRNA) או DNA plasmid (pDNA) באמצעות ערבוב מהיר של רכיבי השומנים בשלב אורגני ואת רכיב חומצת הגרעין בשלב מימי. ערבוב זה מתבצע באמצעות פלטפורמת ערבוב מיקרופלואידית מדויקת, המאפשרת הרכבה עצמית ננו-חלקיקית תוך שמירה על זרימת למינאר. הגודל ההידרודינמי והפולידיספרסיות נמדדים באמצעות פיזור אור דינמי (DLS). מטען פני השטח היעיל על LNP נקבע על ידי מדידת פוטנציאל הזטה. יעילות אנקפסולציה מאופיינת באמצעות צבע פלואורסצנטי כדי לכמת חומצת גרעין לכודה. תוצאות מייצגות מדגימות את יכולת הרבייה של שיטה זו ואת ההשפעה שיש לפרמטרים שונים של ניסוח ותהליכים על ה- LNPs המפותחים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נשאי סמים משמשים כדי להגן ולספק טיפול עם תכונות חיוביות טיפוסיות כולל ציטוטוקסיות נמוכה, זמינות ביולוגית מוגברת, ויציבות משופרת1,2,3. חלקיקים פולימריים, מיצלים וחלקיקים מבוססי שומנים נחקרו בעבר עבור אנקפסולציה של חומצת גרעין ואספקה4,5,6,7. שומנים שימשו סוגים שונים של מערכות nanocarrier, כולל ליפוזומים, חלקיקי שומנים בדם, כפי שהם תואמים ביולוגית עם יציבות גבוהה8. LNPs יכול בקלות לתמצת חומצות גרעין עבור אספקתג....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תרשים של התהליך הכולל מסופק באיור 1.

1. הכנת מאגרים

הערה: סינון סטרילי של המאגרים מומלץ מאוד כאן כדי להסיר כל חלקיקים אשר עשוי להשפיע על חומצת הגרעין ואיכות LNP.

  1. תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)
    1. הכן 1x PBS באמצעות 8 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, 137 מ"מ NaCl, ו 2.7 mM KCl במים ללא גרעין ולהתאים את ה- pH ל 7.4.
    2. לחטא על ידי סינון ואקום באמצעות מסנן בגודל נקבובית 0.22 מיקרומטר.
  2. מאגר ציטוטים
    1. הכן חוצץ ציטראט באמצעות 5 mM נתרן ציטראט, 5 mM חומצת לימון, ו 150 mM נתרן כלורי במים ללא נוקלאז ולהתאים pH....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אצוות מרובות של LNPs עם אותו ניסוח שומנים ויחס N/ P של 6 פותחו בימים נפרדים כדי להפגין רבייה של הטכניקה. אצווה 1 ו-2 הביאה לחלוקת גודל חופפת עם פולידיספרסיות דומה (איור 2A)לא נצפה הבדל משמעותי בגודל או ביעילות אנקפסולציה בין שתי האצוות השונות (איור 2B). יעילות אנקפסולציה הייתה גבוהה עבור כל אצווה (>98.5%) והגדלים היו דומים עם קוטר LNP של 77 ננומטר. החלקיקים היו אחידים עם מדד פולידיספרסיטי ממוצע (PDI) של 0.15 עבור אצווה 1 ו- 0........

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רבייה, מהירות, הקרנה בנפח נמוך הם יתרונות משמעותיים של שימוש בערבוב microfluidic כדי ליצור LNPs לעומת שיטות קיימות אחרות (למשל, הידרציה סרט השומנים הזרקת אתנול). הדגמנו את יכולת הרבייה של שיטה זו ללא השפעה על יעילות אנקפסולציה או גודל חלקיקים שנצפו עם אצוות LNP שונות. זהו קריטריון חיוני עבור כל טיפולי, כולל LNPs, להיות זמין קלינית.

הטכניקה המתוארת כאן משתמשת ערבוב מיקרופלואידי הרינגבון מדהים, אשר גורם היווצרות LNP בסולם הזמן של רק כמה דקות. ערבוב זה משתמש advection כאוטי אשר יתרון עבור ערבוב ש.......

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל המחברים הם עובדים של סאנופי. המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים או אינטרסים פיננסיים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תודה לאטול סלוג'ה, יאטין גוקארן, מריה-תרזה פראצ'יה, וולטר שוונגר ופיליפ זאקאס על הדרכתם ותרומתם לפיתוח LNP.

....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
1,2-דימיריסטויל-rac-גליצרו-3-מתוקסיפוליאתילן גליקול-2000 (C-14 PEG)אוונטי ליפידים קוטביים880151P
10 ומיקרו; l טיפים לסינון מדורג  (RNase-, DNase-, ללא DNA)ארה"ב סיינטיפיק1121-3810
1000 ומיקרו; l טיפים לסינון בוגר (RNase-, DNase-, ללא DNA)USA Scientific1111-2831
20 ומיקרו; l טיפים מסננים משופעים (RNase-, DNase-, ללא DNA)ארה"ב סיינטיפיק1120-1810
200 ומיקרו; l טיפים מסננים מדורגים (RNase-,DNase-, ללא DNA)ארה"ב סיינטיפיק1120-8810
3&בטא;-הידרוקסי-5-כולסטן, 5-כולסטן-3&בטא;-אול (כולסטרול)סיגמא-אולדריץ'C8667
BD מזרקים סטריליים עם קצה החלקה (מזרק 1 מ"ל)Thermo Fisher Scientific14-823-434
BD מזרקים סטריליים עם קצה החלקה (מזרק 3 מ"ל)Thermo Fisher Scientific14-823-436
מחטי מזרק לשימוש כללי BD (מחט מילוי קהה BD 18G)Thermo Fisher Scientific23-021-020
צנטריפוגה ספסליתבקמן קולטר
צלחות באר שחורות 96Thermo Fisher Scientific14-245-177
BrandTech BRAND BIO-CERT RNase-, DNase-, צינורות מיקרוצנטריפוגה ללא DNA (1.5 מ"ל)Thermo Fisher Scientific14-380-813
חומצת לימוןפישר סיינטיפיק02-002-611
קורנינג 500 מ"ל מסנן ואקום/מערכת בקבוקי אחסון, 0.22 אוםנקבוביות קורנינג430769
תאים נימיים מקופלים חד פעמייםMalvernDTS1070
אתיל אלכוהול, טהור 200 הוכחהסיגמא-אולדריץ'459844
פישר מותג חצי מיקרו קובטתרמו פישר Scientific14955127
צינורות חרוטיים Invitrogen (15 מ"ל) (ללא DNase-RNase)Thermo Fisher ScientificAM12500
MilliporeSigma Amicon יחידות סינון אולטרה צנטריפוגליותThermo Fisher ScientificUFC901024
NanoAssemblr BenchtopPrecision Nanyosystems
מים ללא נוקלאזThermo Fisher ScientificAM9930
מי מלח חוצץ פוספט (PBS)Thermo Fisher ScientificAM9624
Quant-iT PicoGreen dsDNA ערכת בדיקתThermo Fisher Scientific  P7589
Quant-iT RiboGreen ערכת בדיקת RNAתרמו פישר סיינטיפיקR11490
נתרן כלוריפישר סיינטיפיק02-004-036
נתרן ציטראט, דיהידרט, גרגיריפישר סיינטיפיק02-004-056
SpectraMax i3xמולקולריים
Zetasizer ננומלברן
מכשירים

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mitchell, M. J., Billingsley, M. M., Haley, R. M., Wechsler, M. E., Peppas, N. A., Langer, R., et al. Engineering precision nanoparticles for drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. , 1-24 (2020).
  2. Davis, M. E., Chen, Z., Shin, D. M.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

RNADNA

מאמרים קשורים