הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
* These authors contributed equally
בנוירופתולוגיה של מחלת אלצהיימר, אחד המאפיינים המכריעים ביותר הוא שקיעת עמילואיד-β. בפרוטוקול זה, אנו מתארים את השיטה של צביעה אימונופלואורסצנטית בעכבר טרנסגני 5×FAD כדי לזהות הצטברות β עמילואיד בפלאק. תהליך הזילוף, ההקפאה, הצביעה והכימות יתואר בפירוט.
מחלת אלצהיימר (AD) היא מחלה ניוונית של מערכת העצבים התורמת ל-60-70% שיטיון ברחבי העולם. אחד מסימני ההיכר של אלצהיימר טמון ללא ספק בהצטברות של β עמילואיד (Aβ) במוח. Aβ מיוצר מהמחשוף הפרוטאוליטי של חלבון מבשר בטא-עמילואיד (APP) על ידי β-secretase ו-γ-secretase. בנסיבות פתולוגיות, מחשוף β מוגבר של APP מוביל לייצור יתר של Aβ, המצטבר לפלאק Aβ. מאחר שפלאק Aβ הוא מאפיין של פתולוגיה של אלצהיימר, זיהוי כמות ה-Aβ חשוב מאוד בחקר אלצהיימר. בפרוטוקול זה, אנו מציגים את שיטת הצביעה האימונופלואורסצנטית כדי להמחיש שקיעת Aβ. מודל העכבר ששימש בניסויים שלנו הוא 5×FAD, הנושא חמש מוטציות שנמצאו במחלת אלצהיימר משפחתית אנושית. הליקויים הנוירופתולוגיים וההתנהגותיים של עכברי 5xFAD מתועדים היטב, מה שהופך אותו למודל חי טוב לחקר פתולוגיה של Aβ. נציג את ההליך הכולל זלוף דרך הלב, קריוסקציה, צביעה אימונופלואורסצנטית וכימות לאיתור הצטברות Aβ בעכברי 5×FAD. בעזרת הפרוטוקול הזה, חוקרים יכולים לחקור פתולוגיה של Aβ במודל של עכבר AD.
מחלת אלצהיימר (AD) היא מחלה ניוונית הגורמת ל-60%-70% דמנציה ברחבי העולם ועולה משאבים חברתיים רבים1. ידוע כי הצטברות β עמילואיד (Aβ) היא סימן היכר פתולוגי במחלת אלצהיימר. חלבון מבשר עמילואיד (APP) הוא חלבון ממברנה אינטגרלי הקיים ברקמות רבות. פפטיד Aβ, המורכב מ-36-42 חומצות אמינו2, מיוצר על ידי הפיצול הבא של β ו-γ-secretase ב-APP 3,4. שינויים במחשוף APP ומוטציות בגן APP מובילים לייצור יתר של Aβ. מולקולות Aβ יכולות להצטבר ליצירת אוליגומרים או סיבים, אשר מאמינים שהם נוירוטוקסיים 5,6
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
כל הליכי הניסוי בוצעו באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית שוז'ו ובהתאם להנחיות התקנות הממשלתיות הסיניות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. זלוף של עכברים
הערה: פרטים נוספים על הליך הזלוף יכולים לעיין בסרטון מהמעבדה 11 של וויליאם שיין.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
השתמשנו בהליכי הצביעה האימונופלואורסצנטיים שתוארו לעיל כדי לחקור את שקיעת הצטברות Aβ בעכברי 5×FAD בגילאים שונים. איור 3 מייצג תוצאות טיפוסיות ותוצאות לא אופטימליות באמצעות הפרוטוקול שלנו. פרוסות מוח של עכברים טרנסגניים הטרוזיגוטיים 5×FAD בני 5 חודשים ו-8 חודשים וביקורת מסוג פרא של 4 עד 6 חודשים נצבעו בנוגדנים 6E10 וזוהו במיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 3A מראה הצטברות Aβ בפלאק בחלק הסגיטלי של מוח העכבר. הם מופקדים בעיקר בקליפת המוח ובהיפוקמפוס, עם הצפיפות הגבוהה ביו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
צביעה אימונו-פלואורסצנטית באמצעות נוגדן 6E10 יכולה לזהות באופן ספציפי הצטברות Aβ במוח, שקל לכמת על ידי תמונה J. מה שכדאי לשים לב אליו הוא שכמה שלבים מכריעים בפרוטוקול זה עשויים להשפיע על התוצאות.
כדי למנוע פרוסות להתקלף או לשבור המוצגות באיור 3C, יש לשים לב לכמה נקודות מפתח. הזלוף צריך להתקדם במהירות לאחר ביצוע החתך בסרעפת בגלל ההשפעות הפתופיזיולוגיות הבלתי הפיכות הנגרמות על ידי היפוקסיה. השפעות אלה עשויות להשפיע עמוקות על התוצאות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין מה לחשוף.
מחקר זה נתמך על ידי פרויקט כללי של הקרן למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 81974157) מהקרן למדעי הטבע של סין, פרופסור ממונה מיוחד של ג'יאנגסו (ל-C.L) ממחלקת החינוך של ג'יאנגסו, תוכנית צוות חדשנות ויזמות של מחוז ג'יאנגסו (ל-H.Z., A.L., W.W., C.L. ו-Y.S.), מענק התחלתי של כישרונות מצוינים (D2019025) ותוכנית הכשרה לחדשנות ויזמות (201910313038Z ל-Z.S., י.ק., מ.ז. וג'.ד.) מהאוניברסיטה הרפואית של שוז'ואו. מחקר זה נתמך גם על ידי מרכז ההדגמה הלאומי לחינוך ניסיוני בסיסי למדעי הרפואה (האוניברסיטה הרפואית שוז'ו).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>הרדמה | |||
| מזרק הזרקה | KLMEDICAL | 1 מ"ל | |
| נתרן פנטוברביטואל | סיגמא-אולדריץ' | P3761 | 1% במי מלח להזרקת i.p |
| <חזק>בית החזה: | |||
| איריס-מספריים ישרים עדינים (~11.5 ס"מ) | RWD | S12010-11 | |
| מספריים כירורגיים מעוקלים חדים (11.5 ס"מ) | RWD | S14016-11 | |
| מלקחיים ישרים לניתוח (~10.5 ס"מ) | RWD | F12010-10 | |
| <חזק>זלוף | |||
| 5 מ"ל) | הזרקת Biosharp | ||
| KLMEDICAL | 20 מ"ל | ||
| Paraformaldehyde | Vicmed | VIH100 | |
| PBS 0.01M (PH7.2-7.4) אבקת | Vicmed | VC2001P | הוסף מים נטולי יונים ליצירת תמיסה |
| <חזקה>קיבוע, התייבשות וחתך בהקפאה | |||
| שקופיות מיקרוסקופ | CITOTEST | 188105 | 76.2 מ"מ ופעמים; 25.4 מ"מ |
| מיקרוטום קריוסטט | LEICA | CM1950 | |
| תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) | Sakura Finetek | 4583 | |
| סוכרוז | VETEC | V900116 | |
| <חזק>צביעה אימונופלואורסצנטית | |||
| מיקרוסקופ פלואורסצנטי | OLYMPUS | IX-81 | |
| נוגדן משני נגד עכבר IgG (H+L) נספג צולב, Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | 200X |
| Image-Pro Plus 7.0C | Media Cybernetics | תוכנה מדעית לגרפיקה וניתוח נתונים | |
| אימונוהיסטוכימית קופסה רטובה (שחורה) | Sinylab | מותאם אישית | 300 מ"מ ופעמים; 100 מ"מ ופעמים; 38 מ"מ, עומק חריץ 27 מ"מ, יכול להכיל 10 שקופיות סטנדרטיות |
| Pipet | Thermo Scientific | ||
| Pipette טיפים | קופסת | ||
| מותאמת אישית | 30 מ"ל, יכולה להכיל 5 שקופיות סטנדרטיות | ||
| מאגר דילול נוגדנים ראשוני | תוצרת המעבדה | 1% BSA 1g, 0.3% Triton X-100 300ul, 0.01% נתרן אזיד 10 מ"ג ב-100 מ"ל PBS | |
| מטוהר אנטי בטא עמילואיד, נוגדן 1-16 (6E10) | Biolegend | SIG-39320 | 500X |
| פתרון אחזור אנטיגן מהיר לקפוא סעיפים | KeyGEN BioTECH | KGIHC005 | 5X |
| Quantification | |||
| Graphpad Prism 8.0.1 | תוכנת מיפוי רפואי | Graphpad | |
| תמונה J פיג'י 2.0.0 | המכון הלאומי לבריאות | תוכנה לגרפים מדעיים וניתוח נתונים |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב