מאמר שיטה

הקמה וניצול של מודלים Xenograft נגזר המטופל של גרורות במערכת העצבים המרכזית

4.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62264

⸱

7 במאי 2021

 , 
1Department of Translational Genomics, Keck School of Medicine, University of Southern California

במאמר זה

סיכום

גרורות במערכת העצבים המרכזית מודלים PDX מייצגים את המאפיינים הפנוטיפיים והמולקולריים של גרורות אנושיות, מה שהופך אותם למודלים מצוינים למחקרים פרה-קליניים. מתואר כאן כיצד לבסס מודלים PDX ואת מסלולי החיסון המשמשים בצורה הטובה ביותר למחקרים פרה-קליניים.

תקציר

פיתוח טיפולים חדשניים לגרורות במערכת העצבים המרכזית (CNS) עוכב על ידי היעדר מודלים פרה-קליניים המייצגים במדויק את המחלה. מודלים של גרורות במערכת העצבים המרכזית (PDX) של גרורות במערכת העצבים המרכזית הוכחו כמייצגים טוב יותר את המאפיינים הפנוטיפיים והמולקולריים של המחלה האנושית, כמו גם משקפים טוב יותר את ההטרוגניות והדינמיקה השבטית של גידולים אנושיים בהשוואה למודלים היסטוריים של קו תאים. ישנם אתרים רבים שניתן להשתמש בהם להשתלת רקמה שמקורה במטופל בעת הקמת ניסויים פרה-קליניים, כל אחד עם היתרונות והחסרונות שלו, וכל אחד מהם מתאים לחקר היבטים שונים של המפל הגרורתי. כאן, הפרוטוקול מתאר כיצד לבסס מודלים של PDX ומציג שלוש גישות שונות לשימוש במודלים של PDX גרורות במערכת העצבים המרכזית במחקרים פרה-קליניים, תוך דיון בכל אחד מהיישומים והמגבלות שלהם. אלה כוללים השתלת אגף, הזרקה אורתוטופית במוח והזרקה תוך לבבית. השתלת אגף תת עורית היא הקלה ביותר למעקב, ולכן הנוחה ביותר למחקרים פרה-קליניים. בנוסף, נצפו גרורות למוח ולרקמות אחרות מהשתלת אגף, דבר המצביע על כך שהגידול עבר מספר שלבים של גרורות, כולל intravasation, extravasation, וקולוניזציה. הזרקה אורתוטופית במוח היא האפשרות הטובה ביותר לשחזור המיקרו-סביבה של הגידול במוח והיא שימושית לקביעת היעילות של תרופות ביולוגיות לחצות את מחסום הדם-מוח (BBB), אך עוקפת את רוב השלבים של המפל הגרורתי. הזרקה תוך לבבית מקלה על גרורות למוח והיא שימושית גם לחקר טרופיזם איברים. בעוד שיטה זו מוותרת על שלבים מוקדמים יותר של מפל גרורתי, תאים אלה עדיין יצטרכו לשרוד את זרימת הדם, אקסטרווס, ולהתיישב. התועלת של מודל PDX, אם כן, מושפעת ממסלול החיסון של הגידול והבחירה באיזה מהם להשתמש צריכה להיות מוכתבת על ידי השאלה המדעית והמטרות הכוללות של הניסוי.

מבוא

שכיחות גרורות למערכת העצבים המרכזית (CNS) עלתה בשנים האחרונות 1,2,3. טיפולים מסורתיים לגרורות במערכת העצבים המרכזית, כגון כריתת גידול, הקרנות מוח שלמות ורדיוכירורגיה סטריאוטקטית, היו פליאטיביים במידה רבה ולעתים רחוקות מרפאים, ויכולים להוביל לתופעות לוואי מתישות, כגון הידרדרות קוגניטיבית1. לאחרונה, טיפולים ממוקדים ואימונולוגיים חדשים רבים מפותחים לטיפול בגרורות במערכת העצבים המרכזית המראים הבטחה להיות טיפולים יעילים יותר, תוך פחות תופעות לוואי4.

תרגום תוצאות פרה-קליניות לנקודות קצה קליניות משמעותיות דורש לעתים קרובות אסטרטגיות מידול יעילות ומנבאות. מבחינה היסטורית, מודלים של קסנוגרפט קו תאים היו הסטנדרט למחקר פרה-קליני במחקר גרורות במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, מודלים אלה של קו תאים אינם משקפים את התנהגות הגידול האמיתית של הגידול המארח או מייצגים את ההטרוגניות ההיסטולוגית או המולקולרית של המחלה. יתר על כן, מודלים של קווי תאים מסוגלים להסתגל לתנאי גידול חוץ גופיים, ולכן לאבד את המאפיינים המקוריים של הגידול המארח. xenografts נגזר המטופל (PDXs), אשר להשתיל את הגידול של המטופל לתוך עכבר מדוכא חיסון או אנושי, משמשים יותר ויותר במחקר סרטן תרגומי. חוקרים הראו כי מודלים של PDX יכולים בדרך כלל לשחזר נאמנה את צמיחת הגידול, מאפיינים היסטולוגיים, לשמור על הטרוגניות הגידול, פוטנציאל גרורתי ותכונות גנטיות מולקולריות. בנוסף, מודלים של PDX הם פרוגנוסטיים לפיהם תקופת חביון הגידול PDX מתואמת עם ההישרדות הכוללת של המטופל והם גם הוכחו כמנבאים במדויק תגובה טיפולית בניסויי חולים 5,6.

הייתה הופעה של גרורות במערכת העצבים המרכזית PDXs. לרוב, אלה פותחו המייצגים גידולים שמקורם ממקור יחיד, כגון סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC)7, סרטן השד8,9 ומלנומה 10,11. לאחרונה פותח ואופיין אוסף גדול ומגוון של דגמי PDX, המייצגים שמונה תת-סוגים היסטולוגיים שונים12. הוכח כי מודלים של PDX עבור גרורות במערכת העצבים המרכזית דומים מאוד לגידול המקורי של המטופל, הן מבחינה היסטולוגית והן מבחינה מולקולרית, והראו גם הבדלים ודמיון היסטולוגיים ייחודיים10,12. יתר על כן, בעוד שרוב המודלים של PDX גרורות במערכת העצבים המרכזית שומרים על ההטרוגניות השבטית של גידולים אנושיים, חלקם הראו עדות לרצף שבטים12, מה שהופך אותם גם לאידיאליים לחקר עמידות לטיפולים על ידי מעקב אחר שינויים שבטיים לאחר הטיפול.

הפרוטוקולים המתוארים כאן מתארים שיטות לביסוס PDX ונתיבי חיסון שונים המשמשים במחקרים פרה-קליניים של גרורות במערכת העצבים המרכזית (איור 1). שיטות השתלה אלה נבדלות זו מזו ביכולתן לחקות גדילה וגרורות. כאן, הפרוטוקול מדגיש את היישומים עבור כל מסלול של השתלה ומדגים כיצד הם יכולים לשמש לחקר גרורות CNS.

פרוטוקול

להלן סדרה של פרוטוקולים שלב אחר שלב המשמשים הן לביסוס מודלים של PDX על ידי השתלת אגפים תת-עורית והן להקמת מחקרים פרה-קליניים המאפשרים בדיקת טיפולים, שיכולים לסייע בהערכת שינויים ביולוגיים ושלבים שונים של המפל הגרורתי. כל המחקרים והמודלים השתמשו בנקבות עכברי NOG בנות 3-8 שבועות. כל דגימות הרקמה נאספו בהסכמה מדעת בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB). כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC).

1. הקמה והפצה של דגמי PDX על ידי השתלת אגפים

  1. הקמת דגמי PDX
    1. לאחר כריתה כירורגית של הגידול מהמטופל בחדר הניתוח, אחסנו את רקמות הגידול הטריות בתמיסה מתאימה (כגון DMEM) והניחו אותה מיד על קרח. השתמש בעודף של תמיסת אחסון (>10 מ"ל) כדי להבטיח שהרקמה שקועה במלואה.
    2. מעבירים את הרקמה לצלחת תרבית רקמה ושוטפים עם DPBS של 5 מ"ל.
      הערה: שלב זה צריך להתבצע בארון בטיחות ביולוגית באמצעות טכניקות אספטיות. יש לנקוט אמצעי זהירות על ידי לבישת ציוד מגן אישי מתאים (PPE) כדי להגן מפני גורמים זיהומיים אפשריים בבני אדם.
    3. הסר אזורים נמקיים מהגידול.
      הערה: ניתן לזהות אזור זה כאזור לבן ועסיסי לכיוון מרכז הרקמה.
    4. חותכים את הרקמה הנותרת לחתיכות של כ 2 x 2 x 2 מ"מ.
    5. מעבירים את הרקמות לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל את מטריצת קרום המרתף המופחתת של גורם הצמיחה ואחסנו אותן על קרח. ודא כי מטריצת קרום מרתף מספיק (>200 μL) משמש כדי לטבול באופן מלא כל פיסת רקמה.
    6. Cryopreserve את שאר הרקמות שלא יושתלו על פי הפרוטוקול המתואר בשלב 1.3.
    7. מרדימים את בעל החיים בתא אינדוקציה עם 2-5% איזופלורן וחמצן. לאחר ההרדמה, להעביר את בעל החיים לקונוס האף כדי לשמור על הרדמה ב 1.5-2.5% isoflurane עם אספקת חמצן רציפה. ודא את עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה. יש למרוח את משחת העיניים הווטרינרית למניעת יובש בעיניים במהלך הניתוח. לספק תמיכה תרמית לבעל החיים לאורך כל ההליך עד שבעל החיים מתאושש.
    8. זהה את אתר ההשתלה בעכבר.
      הערה: זה צריך להיות בצד ימין או שמאל של העכבר, בדרך כלל ציון לרוחב בצד של אזור הבטן, caudal לכלוב הצלעות.
    9. כדי להכין את אזור הניתוח, לגלח את הפרווה ולחטא עם שלושה קרצוף לסירוגין של יוד פובידון ו 70% אתנול.
    10. באמצעות מלקחיים, להרים את העור של העכבר ולעשות חתך 0.5-1 ס"מ על העור.
    11. יש להחדיר זוג מספריים כירורגיים באיטיות מתחת לעור באזור החתך ליצירת כיס (0.5-1 ס"מ עומק) בחלל התת עורי.
    12. הניחו בזהירות חתיכת גידול אחת בכיס ודחפו אותה, דחפו אותה לתחתית הכיס כדי למנוע מהגידול להחליק החוצה.
    13. סגור את החתך באמצעות תפרים כירורגיים 4-0 ניילון.
      הערה: ניתן להשתמש גם בשיטות אחרות לסגירת פצעים כגון תפרים וקליפסים לפצעים שאינם נספגים או נספגים.
    14. העבירו את העכבר בחזרה לכלוב ועקבו אחר התאוששות בעל החיים מההרדמה, עד שהוא אמבולטורי.
      הערה: משככי כאבים אינם נדרשים אך ניתן לתת אותם אם נצפה כאב בעכברים.
    15. עקוב אחר צמיחת הגידול מדי שבוע. גידול אחד צפוי לכל עכבר.
      הערה: נראה כי נפח הגידול בעת ההשתלה יורד בתחילה, אך זו אינה סיבה לדאגה. גידול נחשב כאילו נלקח ברגע שהוא הופך מוחשי ונכנס לשלב גידול לוגריתמי. קטע ראשון זה מייצג את דור ה-F0.
    16. ברגע שהגידולים מתחילים לגדול, מדדו את הגידולים שלוש פעמים בשבוע. למדוד את אורך ורוחב הגידולים עם קליפר. כדי לחשב את נפח הגידול, השתמש בנוסחה: אורך x רוחב x רוחב / 2.
    17. יש להרדים את העכברים שהושתלו בהם גידולי PDX כאשר קוטר הגידולים גדול מ-15 מ"מ באמצעות הצד הארוך ביותר של הגידול. בצע את המתת החסד על ידי שאיפת CO 2 בתא אינדוקציה CO2, ואחריו נקע צוואר הרחם כשיטה משנית.
    18. כריתת הגידול מאגף החיה על ידי ביצוע חתך. נתחו את הגידול שהוצא בעדינות בעזרת מספריים ומלקחיים קהים. כדי לעשות זאת, תחילה לחתוך את העור על גבי הגידול, ולאחר מכן לחתוך את הגידול מן שכבת השריר מתחתיו.
    19. להעביר את רקמת הגידול ל >10 מ"ל של פתרון אחסון מתאים (כגון DMEM). מיד מניחים אותו על קרח. גידול זה יכול להישמר בהקפאה או לעבור לקבוצה אחרת של עכברים. שקול קטע זה כ- F1.
      הערה: מעבר חוזר יעבד את מעבר הגידול F2 וכן הלאה.
  2. התפשטות של מודלים PDX
    1. התחל עם הגידול המנותח שנשמר בתמיסת אחסון משלב 1.1.19.
    2. מעבירים את הרקמה לתבנית תרבית רקמה ושוטפים עם DPBS של 5 מ"ל.
    3. הסר את האזורים הנמקיים מהגידול.
    4. חותכים את הרקמה לחתיכות של כ 2 x 2 x 2 מ"מ.
    5. מעבירים את הרקמות לצינור מיקרוצנטריפוגה המכיל גורם גדילה מופחת ממברנת מרתף (>200 μL) ומאחסנים על קרח.
    6. Cryopreserve את הרקמה הנותרת שאינה משמשת להתפשטות על פי הפרוטוקול המתואר בשלב 1.3.
    7. מרדימים את בעל החיים בתא אינדוקציה עם 2-5% איזופלורן וחמצן. לאחר ההרדמה, להעביר את בעל החיים לקונוס האף כדי לשמור על הרדמה ב 1.5-2.5% isoflurane עם אספקת חמצן רציפה. ודא את עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה. יש למרוח את משחת העיניים הווטרינרית למניעת יובש בעיניים במהלך הניתוח. לספק תמיכה תרמית לבעל החיים לאורך כל ההליך עד שבעל החיים מתאושש.
    8. זהה את אתר ההשתלה בעכבר.
      הערה: זה צריך להיות בצד ימין או שמאל של העכבר, בדרך כלל באזור הבטן, קאודלי לכלוב הצלעות.
    9. כדי להכין את אזור הניתוח, לגלח את הפרווה ולחטא עם שלושה קרצוף לסירוגין של יוד פובידון ו 70% אתנול.
    10. בצע חתך של 0.5-1 ס"מ בצד אחד של העכבר.
    11. הכניסו זוג מספריים כירורגיים באיטיות מתחת לעור בחתך ליצירת כיס (0.5-1 ס"מ עומק) בחלל התת עורי.
    12. הניחו בזהירות חתיכת גידול אחת בכיס ודחפו אותה לתחתית הכיס כדי למנוע מהגידול להחליק החוצה.
    13. סגור את החתך באמצעות תפרים כירורגיים מניילון 4-0 או שיטות אחרות לסגירת פצע.
    14. העבירו את העכבר בחזרה לכלוב ועקבו אחר החלמתו מההרדמה, עד שהוא אמבולטורי.
      הערה: משככי כאבים אינם נדרשים אך ניתן לתת אותם אם נצפה כאב בעכברים.
    15. במהלך חביון (שלב אי-צמיחה), עקוב אחר צמיחת הגידול מדי שבוע. גידול אחד צפוי לכל עכבר.
      הערה: נראה כי נפח הגידול בעת ההשתלה יורד בתחילה, אך זו אינה סיבה לדאגה. גידול נחשב לקחת ברגע שהוא הופך מוחשי ומתחיל לגדול ללא הרף.
    16. ברגע שהגידולים מתחילים לגדול, מדדו את הגידולים שלוש פעמים בשבוע. למדוד את אורך ורוחב הגידולים עם קליפר. חשב את נפח הגידול באמצעות הנוסחה: אורך x רוחב x רוחב / 2.
    17. יש להרדים את העכברים שהושתלו בהם גידולי PDX כאשר קוטר הגידולים גדול מ-15 מ"מ באמצעות הצד הארוך ביותר של הגידול. בצע המתת חסד על ידי שאיפת CO2 בתא אינדוקציה CO2, ואחריו נקע צוואר הרחם כשיטה משנית.
    18. יש לכרות את הגידול מאגף החיה על ידי ביצוע חתך ולנתח את הגידול החוצה בעדינות בעזרת מספריים ומלקחיים קהים.
    19. מעבירים את רקמת הגידול ל >10 מ"ל של תמיסת אחסון מתאימה (כגון DMEM) ולאחר מכן מניחים מיד על קרח.
  3. שימור בהקפאה של גידולי PDX
    1. יש להרדים את העכברים שהושתלו בהם גידולי PDX כאשר קוטר הגידולים גדול מ-15 מ"מ באמצעות הצד הארוך ביותר של הגידול. בצע המתת חסד על ידי שאיפת CO 2 בתא אינדוקציה CO2, ואחריו נקע צוואר הרחם כשיטה משנית.
    2. יש לכרות את הגידול מאגף החיה על ידי ביצוע חתך ולנתח את הגידול החוצה בעדינות בעזרת מספריים ומלקחיים קהים.
    3. מעבירים את רקמת הגידול ל >10 מ"ל של תמיסת אחסון מתאימה (כגון DMEM) ולאחר מכן מניחים מיד על קרח.
    4. מעבירים את הרקמה לתבנית תרבית רקמה ושוטפים עם DPBS של 5 מ"ל.
    5. הסר אזורים נמקיים מהגידול.
    6. חותכים את הרקמה לחתיכות של כ 2 x 2 x 2 מ"מ.
    7. העבר את הרקמה לתוך cryotubes המכילים 20% DMEM, 70% FBS, ו 10% DMSO.
    8. העבירו את הצינורות הקריופוביים למיכל הקפאה והכניסו למקפיא בטמפרטורה של -80°C.
    9. כאשר צינורות ההקפאה מקוררים ל -80 מעלות צלזיוס, העבר אותם לאחסון חנקן נוזלי.

2. מסלולי חיסון למחקרים פרה-קליניים

  1. השתלת אגף תת עורית.
    הערה: השתלת אגף תת עורית יכולה לשמש בקלות ויכולה להיות מועילה לחקר כל השלבים של מפל גרורתי.
    1. השתמש בגידולי PDX גדלים או גידולי PDX בהקפאה להשתלת אגף ראשונית.
    2. לגידול גידולי PDX, יש להרדים את העכברים בשיטה שאושרה על ידי IACUC כאשר אורך הגידולים גדול מ-15 מ"מ; כורתים את הגידול ומעבירים את רקמת הגידול לתמיסת אחסון מתאימה (כגון DMEM) ומיד מניחים על קרח.
    3. עבור גידולי PDX בהקפאה, הפשיר את רקמת PDX בהקפאה במהירות על ידי טבילה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    4. בצע את השלבים 1.2.2-1.2.19.
  2. השתלה אורתוטופית על ידי הזרקה תוך גולגולתית למוח.
    הערה: מודל זה יכול לשמש לבדיקת יעילות של תרופות כדי לחצות את BBB ולחקור נשאות גידול. סעיף זה מתייחס בעיקר לשימוש בערכת דיסוציאציה של הגידול (ראו טבלת חומרים). סוגי רקמות שונים דורשים פרוטוקולי דיסוציאציה שונים. מומלץ למשתמש לבדוק ולייעל את הפרוטוקול כדי למקסם את יעילות הדיסוציאציה.
    1. יש להרדים את העכברים שהושתלו בהם גידולי PDX בשיטה שאושרה על ידי IACUC כאשר אורכם של הגידולים גדול מ-15 מ"מ.
    2. בתנאים סטריליים בארון בטיחות ביולוגית, יש לכרות בניתוח את גידולי PDX ולאחסן ב-DMEM על קרח.
    3. הכן את תמיסת הדיסוציאציה בצינור המתאים על ידי הוספת תערובת האנזימים ל- DMEM כפי שמצוין בפרוטוקול היצרן.
    4. לשטוף את הגידול ב 5 מ"ל DPBS בצלחת תרבית רקמות.
    5. הסר את האזורים הנמקיים מהגידול.
    6. חותכים את הגידול לחתיכות קטנות של 2-4 מ"מ אורך.
    7. מעבירים את חתיכות הגידול לתוך הצינור המכיל את תערובת האנזימים.
    8. חבר את הצינור למפיץ הרקמה והפעל את התוכנית המתאימה לסוג הרקמה. עיין בפרוטוקול היצרן לקבלת התוכנית המתאימה להפעלה ובזמן הדיסוציאציה הנדרש.
    9. לאחר השלמת התוכנית, מסננים את התאים באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר.
    10. לשטוף את מסננת התא עם 20 מ"ל של DMEM.
    11. צנטריפוגה את התאים מנותקים ב 300 x גרם במשך 7 דקות.
    12. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-DPBS.
    13. לספור את התאים ולדלל לריכוז הנדרש.
    14. הגדר את המסגרת הסטריאוטקסית בהתאם להוראות היצרן והכן כרית חימום לעכברים. יש לחטא את כל האזורים עם 70% אתנול.
    15. מרדימים את בעל החיים בתא אינדוקציה עם 2-5% איזופלורן וחמצן. לאחר ההרדמה, להעביר את בעל החיים לקונוס האף כדי לשמור על הרדמה ב 1.5-2.5% isoflurane עם אספקת חמצן רציפה. ודא את עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה. יש למרוח את משחת העיניים הווטרינרית למניעת יובש בעיניים במהלך הניתוח. לספק תמיכה תרמית לבעל החיים לאורך כל ההליך עד שבעל החיים מתאושש.
    16. הכן את אזור הניתוח על ידי גילוח הפרווה על ראש העכבר כדי לחשוף את הקרקפת.
    17. ספק לעכבר את משכך הכאבים המתאים, כגון מנה אחת של 1 מ"ג / ק"ג Buprenorphine שחרור מושהה (SR) המנוהל על ידי הזרקה תת עורית.
    18. העבר את העכבר למסגרת הסטריאוטקסית. ודא שהעכבר נושך את בלוק הנשיכה. השתמשו במוטות האוזניים כדי לאבטח היטב את ראש העכבר.
      הערה: העכבר מאובטח כראוי אם הראש אינו זז כאשר דוחפים אותו בעדינות עם מלקחיים.
    19. יש לחטא את האזור המגולח בשלושה פילינג לסירוגין של פובידון-יוד ו-70% אתנול.
    20. בצע חתך אורכי של 5-7 מ"מ בקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת ולמשוך את הקרקפת.
    21. לגרד את periosteum עם כלי כירורגי קהה כגון מלקחיים.
    22. אתר את הברגמה על הגולגולת.
    23. מקם את המחט של המסגרת הסטריאוטקטית על גבי הברגמה ואפס את הקואורדינטות ל- 0 או ציין את הקואורדינטות על הזרוע.
    24. הזיזו את הזרוע 1 מ"מ אחורית (קאודלית) ו-1 מ"מ לרוחב, ימינה מקו האמצע.
    25. סמן מיקום זה בטוש קבוע. אם הזרוע מכילה חריץ למזרק, חבר סמן לחריץ המזרק כדי לסמן את המיקום.
    26. קדח חור בור קטן בגולגולת במיקום זה. אין להפעיל לחץ רב מדי כדי למנוע קידוח לתוך המוח.
    27. לטעון מזרק המילטון 5 μL, 26 גרם עם 5-10 x 104 תאים, בנפח של 1-2 μL, ולחבר את הזרוע סטריאוטקסית.
    28. הכנס באיטיות את מחט מזרק המילטון 2 מ"מ לתוך המוח.
    29. התחילו להזריק תאים בקצב הרצוי, בדרך כלל 0.2-0.5 מיקרוליטר/דקה.
    30. לאחר השלמת ההזרקה, לאט לאט למשוך את המחט מהמוח.
    31. ממלאים את חור הבור בשעוות עצם.
    32. סגור את החתך עם תפרים כירורגיים או דבק כירורגי.
    33. העבירו את העכבר בחזרה לכלוב ועקבו אחר החלמתו מההרדמה.
    34. לעקוב אחר מצבם של בעלי החיים באופן קבוע ולהרדים אותם כאשר מגיעים לקריטריונים של נקודת קצה הומנית בפרוטוקול המאושר.
      הערה: גידול מוצלח במוח גורם להידרדרות במצבו של החיה, המתבטאת לעתים קרובות בהטיית ראש, פרוות שיער גסה, גוף כפוף, עיניים מכווצות, פעילות מופחתת וציון מצב גוף נמוך (BCS < 2).
    35. בצע נקרופסי על בעלי חיים המתת חסד, ואחריו ניתוח היסטולוגי כדי לאשר את נוכחותם של גידולים במוח. רשום את משך הזמן שלוקח מהשתלה ועד המתת חסד.
  3. השתלת מודלים של PDX על ידי הזרקה תוך לבבית
    הערה: מודל זה יכול לשמש לחקר טרופיזם איברים ברגע שתאי הגידול נמצאים במחזור. סעיף זה משתמש גם בערכת דיסוציאציה של הגידול ודורש אופטימיזציה לפי סוג רקמה.
    1. בצע את השלבים 2.2.1-2.2.13.
    2. מרדימים את בעל החיים בתא אינדוקציה עם 2-5% איזופלורן וחמצן. לאחר ההרדמה, להעביר את בעל החיים לקונוס האף כדי לשמור על הרדמה ב 1.5-2.5% isoflurane עם אספקת חמצן רציפה. ודא את עומק ההרדמה באמצעות חוסר רפלקס דוושה. יש למרוח את משחת העיניים הווטרינרית למניעת יובש בעיניים במהלך הניתוח. לספק תמיכה תרמית לבעל החיים לאורך כל ההליך עד שבעל החיים מתאושש.
    3. לאחר מכן, מקם את העכבר במצב שכיבה.
    4. כדי להכין את האזור הכירורגי על החזה, לגלח את הפרווה ולחטא אותו עם שלושה קרצוף לסירוגין של פובידון-יוד ו 70% אתנול.
    5. צייר 0.5-10 x 105 תאים לתוך מזרק על מחט 28 גרם, עד נפח של 100 μL.
      הערה: מספר התאים הנדרש משתנה בהתאם לאגרסיביות של המודל ויש לקבוע אמפירית את מספר התאים האופטימלי עבור כל מודל.
    6. אתר את אתר ההזרקה (מעט משמאל לעצם החזה של העכבר ובאמצע הדרך בין החריץ החזה לתהליך הקסיפואידים).
    7. הכנס את המחט אנכית לתוך העכבר באתר ההזרקה.
    8. שימו לב לכניסה המוצלחת לחדר השמאלי דרך זרם אחורי של דם הנכנס למזרק. לאט לאט לחלק את התאים לתוך החדר השמאלי מבלי להזיז את המחט.
    9. משוך לאט את המחט החוצה אנכית מהעכבר.
    10. החל חתיכת גזה סטרילית על אתר ההזרקה ולהפעיל לחץ במשך כ 1 דקות עד הדימום מפסיק, תוך מתן אפשרות לתנועת החזה לנשימה.
    11. הסר את העכבר מההרדמה ואפשר לו להתאושש על פד מחומם.
      הערה: צמיחת גידול מוצלחת גורמת להידרדרות במצבו של החיה, המתבטאת לעתים קרובות בפרוות שיער פרועה, גוף כפוף, עיניים מכווצות, פעילות מופחתת וציון מצב גוף נמוך (BCS < 2).
    12. לעקוב אחר מצבם של בעלי החיים באופן קבוע ולהרדים אותם כאשר מגיעים לקריטריונים של נקודת קצה הומנית בפרוטוקול המאושר.
    13. בצע נקרופסי כדי לזהות גרורות על בעלי החיים המתת חסד, ואחריו ניתוח היסטולוגי כדי לאשר את נוכחותם של גידולים באיבר היעד. רשום את משך הזמן שלוקח מהזרקה תוך לבבית להמתת חסד.

תוצאות

גידולי PDX בעלי התפשטות אגפית הם הקלים ביותר לשתלה, ניטור וכריתה, והם מומלצים בדרך כלל לביסוס ראשוני והתפשטות של גידולי PDX (איור 1). בעת הקמה או הפצה של גידולי PDX, זה נבון להשתיל גידולים במספר בעלי חיים, מכיוון שקצב לקיחת הגידול עשוי להשתנות ולא כל פיסת גידול תמיד תיקח בעכברים. פותחו שיטות להקמה והתפשטות של גרורות במערכת העצבים המרכזית, PDXs, ישירות במוח13. עם זאת, שיטות אלה עדיין מאתגרות יותר עם שיעורי נטילה נמוכים יותר והגידולים קשים יותר באופן משמעותי להפצה ולניטור מאשר השתלת אגף.

אם גידולים של חולים אינם זמינים, גרורות במערכת העצבים המרכזית ניתן להשיג גידולי PDX גם ממגוון מקורות, כולל מאגרים של מעבדות אקדמיות או חברות מסחריות. לאחר רכישת הגידולים, העדיפות הראשונה תהיה להפיץ ולשמר בהקפאה חומר רב ככל האפשר, ולהבטיח מספר רב של גידולים במעבר נמוך נשמרים. זה מבטיח כי מספיק חומר זמין עבור מספר בלתי מוגבל של מחקרים הבאים עם מודלים PDX. בדומה לקווי תאים אימורטליים, גידולי PDX צריכים להישמר בהקפאה ולהשתמש בהם במספרי מעבר נמוכים, שכן נדידה גנטית גורמת לשינויים בפנוטיפ ובגנוטיפ של PDX לאורך זמן12,14,15. ללא קשר למקור גידולי PDX, חשוב לבצע בדיקות סקר תכופות של PDX ומושבות עכברים עבור פתוגנים אנושיים ועכברים כאחד, כגון HIV והפטיטיס לבני אדם ו- Corynebacterium bovis לעכברים. זה יגביל את ההתפשטות של פתוגנים לא רצויים מה-PDX הן לאדם המטפל בהם והן לעכברים אחרים במחקר ולוויבריום.

שיטות ההשתלה המתוארות כאן יכולות לשמש לחקר הביולוגיה של הגידול, להערכת היבטים רבים של המפל הגרורתי ולמחקרים פרה-קליניים. היתרון העיקרי של השתלת אגפים הוא קלות ניטור הגידול לאורך זמן, שכן גידולים נראים לעין, וניתן למדוד את צמיחתו בקלות באמצעות קליפר. שיטה זו יכולה להיות מקום טוב להתחיל בו לקביעת היתכנות של יעד לתרופה. השתלה תוך גולגולתית מועדפת אם נוכחות המיקרו-סביבה במוח חשובה ויכולה לשנות את הצמיחה או הפרופיל המולקולרי של הגידול. בנוסף, השתלה תוך גולגולתית ממקמת את הגידול מאחורי מחסום הדם במוח (BBB), מה שהופך אותו חיוני למחקרים פרה-קליניים הבוחנים את יעילות התרופות הדרושות כדי לחצות את מחסום הדם-מוח. עם זאת, קשה לעקוב אחר הצמיחה של גידולי PDX ודורש הדמיה רדיולוגית או הדמיה ביולומינסנטית אם התאים מסומנים. לדעת מתי להתחיל את הטיפול התרופתי באופן פרה-קליני ידרוש נתוני הדמיה כדי לעקוב אחר גדילה או ידע על הישרדות ממוצעת של עכברים הנושאים גידול PDX מסוים. יתר על כן, השתלה תוך גולגולתית עוקפת את כל השלבים החיוניים של המפל הגרורתי, מה שהופך אותה למתאימה רק לחקר יעילות התרופה והמיקרו-סביבה של הגידול במוח. למרות ההבדלים במיקרו-סביבה של הגידול, המורפולוגיה של גידולי PDX דומה ללא קשר לאתר ההשתלה, כפי שניתן לראות בגידול PDX זה (CM04) שמקורו בגרורות במוח שמקורן בגידול ראשוני של סרטן ריאה מסוג תאים קטנים (איור 2). ניתן לראות את המורפולוגיה של סרטן הריאה של תאים סרטניים בעלי גרעינים קטנים וציטופלסמה דלה בגידול האגפי, גידול תוך גולגולתי וגרורות בטניות כתוצאה מהזרקה תוך לבבית. יתר על כן, גרורות ספונטניות מגידולים שהושתלו באגף נצפו בעבר12 , דבר המצביע על כך שניתן לשחזר ולחקור את התהליכים הגרורתיים כגון intravasation, extravasation ו- colonization בגידולים באגף, שאחרת לא היו אפשריים עם גידולים אורתוטופיים במוח. באופן כללי, הוא ציין כי השתלת אגף היא שיטה מתאימה לחקר ביולוגיה גרורות CNS וניהול מחקרים פרה-קליניים.

הזרקה תוך לבבית משמשת לרוב לחקר טרופיזם איברים ופוטנציאל גרורתי של גידולים. תאי הגידול המוזרקים יצטרכו לעבור מספר שלבים של המפל הגרורתי, כולל הישרדות במחזור הדם, אקסטרווסציה והתיישבות של האתר הגרורתי. בדומה להזרקה אורתוטופית למוח, ייתכן שיהיה קשה לעקוב אחר התקדמות גרורות סרטניות ללא הדמיה רדיולוגית או תיוג תאים. עם זאת, כמו בהשתלה אורתוטופית, חיסון מוצלח גורם להידרדרות במצבם של בעלי החיים לאורך זמן עם התפשטות הגידול. איור 3A מדגים גרורות למוח לאחר הזרקה תוך-לבבית במודל PDX של גרורות במערכת העצבים המרכזית, M2, שמקורן במלנומה. הזרקה תוך-לבבית של גידול PDX (CM04) גרמה לגרורות לחלל הבטן ולכבד (איור 3B). לאיברים אחרים שנבדקו, כגון הריאה, הכליות והשחלות לא היו גרורות נראות לעין.

figure-results-1
איור 1: תרשים זרימה המציג את זרימת העבודה הכללית של הקמה, הפצה ושימוש ב-PDX עבור מחקרים פרה-קליניים. עבור כל שיטת חיסון, שלבים של המפל הגרורתי המעורב מפורטים מתחת לכל שיטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-2
איור 2: היסטולוגיה של גידולי PDX בשיטות חיסון שונות. המטוקסילין ואאוזין (H&E) צביעה של גרורות במערכת העצבים המרכזית גידול PDX שמקורו בסרטן ריאה של תאים קטנים (CM04) שהושתל בעכברים מדוכאי חיסון על ידי שלוש השיטות הוא בעל מאפיינים פתולוגיים ומורפולוגיים דומים של סרטן ריאה של תאים קטנים, עם גרעינים קטנים וציטופלסמה דלה. לוח ההזרקה התוך לבבי מראה גרורות בבטן. קנים של תאים קטנים ויחס גרעיני לציטופלזמי גבוה ניכרים בכל שלוש התמונות. התמונות צולמו בסורק שקופיות והוגדלו ל-10x. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-3
איור 3: גרורות שנצפו לאחר הזרקה תוך-לבבית. צביעת H&E של רקמות עם גרורות נראות לעין במהלך הערכה על ידי נקרופסי לאחר הזרקה תוך לבבית של (A) M2 ו- (B) CM04. התמונות צולמו (A) בסורק שקופיות והוגדלו ל-1x (שמאל) או 20x (מימין) או (B) במיקרוסקופ רגיל בהגדלה של פי 10. נתון זה שונה מהפרסום הקודם שלנו12. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

דיון

בכתב היד הנוכחי פורטו שיטות להקמה והפצה של PDX. כמו כן הודגמו שלוש שיטות חיסון שונות שניתן להשתמש בהן להקמת מחקרים פרה-קליניים בעת הערכת גרורות במערכת העצבים המרכזית. שיטת הבחירה צריכה להיות תלויה במטרות הניסוי. במקרים מסוימים, כדאי להשתמש ביותר ממסלול חיסון אחד. לדוגמה, השתלת אגפים תת עורית מספקת גישה פשוטה לחקר יעילות התרופה על צמיחת הגידול והערכת התרופה על מטרתה והיא גם מספקת חזותית לגודל הגידול שניתן לעקוב ולמדוד בקלות. עם זאת, לאחר קביעת היתכנות המטרה ותכונות הצמיחה האנטי-סרטניות, ניתן להקים מחקר אורתוטופי כדי להעריך את היעילות של הביולוגי לחצות את מחסום הדם-מוח ולחקור את השפעתו בתוך המיקרו-סביבה של גידול המוח. כמו כן, הישרדות מוערכת טוב יותר במחקרים אורתוטופיים והזרקות תוך לב.

הזרקה תוך גולגולתית של גרורות במוח מודלים PDX הוא לעתים קרובות המודל הפרה-קליני המועדף בשל נוכחותם של מיקרו-סביבה במוח ו- BBB. עם זאת, מחקרים הראו כי גרורות במוח יש את היכולת לשנות את BBB, אשר משפיע על חדירות של מולקולות לגידול16. שינויים אלה ב- BBB לא יבואו לידי ביטוי על ידי גידולים מושתלים תוך גולגולתיים, ובגלל זה מחקרים פרה-קליניים עשויים שלא לשקף באופן מלא את התגובה של גידולי חולים. אפילו עם אזהרה זו, הזרקה תוך גולגולתית נותרה השיטה הטובה ביותר לבדוק את החדירות והיעילות של תרופות לחצות את BBB במודלים פרה-קליניים. אתגר נוסף עם מודלים תוך גולגולתיים הוא שהם קשים למעקב אחר צמיחת הגידול ודורשים שימוש בטכניקות הדמיה. התמרה ויראלית של PDX עם סמנים פלואורסצנטיים או ביולומינסנטיים שימשה באופן מסורתי, אך יכולה להיות מאתגרת לביצוע. עם זאת, מספר טכניקות הדמיה מפותחות לשימוש בעכברים שאינם דורשים החדרת סמנים, אשר יכולים לשפר את קלות הניטור של גידולי מוח אורתוטופיים אלה עבור מחקרים פרה-קליניים. אלה כוללים טכנולוגיות הדמיה כגון דימות תהודה מגנטית (MRI) וטומוגרפיה פליטת פוזיטרונים (PET) הדמיית טומוגרפיה מיקרו ממוחשבת (micro-CT). לבסוף, הזרקה תוך גולגולתית עשויה שלא לשקף במדויק את המיקרו-סביבה של גרורות במערכת העצבים המרכזית מחוץ למוח, כגון גרורות לפטומנינגיאליות. במקרה זה, הזרקה לתוך cisterna magna יכול להתבצע כדי לייצג בצורה מדויקת יותר גרורות leptomeningeal17.

אפיון התכונות הפנוטיפיות והמולקולריות של מודל PDX חשוב לבחירת המודלים הטובים ביותר למחקרים פרה-קליניים. חביון הגידול יכול לנוע בין 7-140 ימים ושיעורי הנטילה יכולים להיות גם משתנים מאוד12. המספר האופטימלי של בעלי חיים להשתלה ועיתוי תחילת הטיפול יצטרכו להתבסס על המאפיינים של כל מודל PDX ויש לקבוע אותם אמפירית. יתר על כן, הפרופיל המולקולרי של גידולי PDX חשוב גם לבחירת המודלים המייצגים ביותר של PDX למחקרים פרה-קליניים. ככל שהמודל מייצג מולקולרית קרוב יותר את הרקמה התורמת, כך סביר להניח שהוא ינבא יותר את התגובה הקלינית. כמו כן, קריטי להבטיח כי המטרות שנבחרו מתוך נתונים אנושיים נמצאות ב- PDX שנבחרו למחקרים ונשמרות לאורך כמה דורות, כפי שהוכח רצף השבטים קשור לפרופיל גנומי שונה של השיבוט הדומיננטי המכהן. לאור זאת, הפרופילים הפנוטיפיים והמולקולריים של גידולי PDX גרורות במערכת העצבים המרכזית אופיינו בהרחבה במשך דורות רבים12.

למרות היתרונות הרבים של שימוש במודלים PDX גרורות CNS, ישנן מספר מגבלות הקשורות לשימוש בהם. ראשית, מיקרו-סביבה חלופית של הגידול ובמיוחד היעדר מערכת חיסונית הן מגבלות מתועדות היטב של מודלים PDX18. קסנוגרפט של גידול אנושי בעכברים גורם להחלפת סטרומה אנושית בסטרומה של עכבר עם כל מעבר עוקב והסטרומה האנושית מוחלפת בדרך כלל לחלוטין לאחר מספר מעברים19. עם זאת, ההבדלים במיקרו-סביבה של הגידול אינם גורמים להבדלים גדולים בפרופיל המולקולרי של גידולי PDX מושתלי אגפים בהשוואה לגידול המקורי של המטופל12, דבר המצביע על כך שמודלים של אגפים עדיין מייצגים מודלים ניסיוניים טובים לחקר גרורות במערכת העצבים המרכזית. שנית, השימוש בבעלי חיים מדוכאי חיסון גורם להיעדר חדירה של תאי מערכת החיסון לגידול ולתגובה חיסונית כללית של הפונדקאי, מה שמגביל את הדרך הבסיסית שבה הפונדקאי מנסה להילחם בצמיחת סרטן12. בעוד עכברים אנושיים שהושתלו בתאי חיסון אנושיים זמינים לחקר האינטראקציות של תאי חיסון ספציפיים עם הגידול, עדיין קיימות שאלות ומחלוקות רבות לגבי הגישות, השיטות והפרשנות של תוצאות אלה20.

בעוד שרוב PDX הוכחו כיציבים גנטית, אנו ואחרים הראינו כי במקרים נדירים, גם בהיעדר טיפולים או לחצים סלקטיביים חיצוניים אחרים, ייתכנו שינויים בשיבוטים של הגידולים, כגון השתלטות שיבוט מינורית12,14,15. זה יכול לגרום לשינויים דרמטיים בפרופיל המולקולרי, אשר בסופו של דבר יגרום לכך שהגידול לא ישקף את השיבוטים הדומיננטיים בגידול החולה12. בעוד PDX המציגים רצף שבטים יכול להיות בשימוש במחקרים פרה-קליניים, גנים רבים המיועדים למיקוד (למשל, Her2) עלולים ללכת לאיבוד עם רצף השבטים. לכן, מומלץ לבצע בדיקות תכופות של מודלים של PDX כדי לקבוע אם הם עדיין שומרים על הפרופיל המולקולרי של השיבוט הרצוי.

לסיכום, מודלים PDX מייצגים מערכת מודל מצוינת לחקר לא רק גרורות CNS אלא גם סוגים אחרים של גידולים. פיתוח מודלים אלה הראה כי הם משקפים במידה רבה את הפרופיל הפנוטיפי, המולקולרי וההטרוגניות של גרורות CNS אנושיות 8,9,10,12. הם משמשים כמודלים יעילים לחקר הביולוגיה של גרורות במערכת העצבים המרכזית וגם משמשים גם כמודלים פרה-קליניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, ומחליפים מודלים של קו תאים בשימוש יתר ששימשו בעבר למחקרי in vivo של גרורות במערכת העצבים המרכזית. אין ספק שההבדלים בין PDX לגידול של חולה תורם קיימים12,18. ידיעת ההבדלים הללו חשובה לתכנון וביצוע נכון של מחקרים פרה-קליניים. לבסוף, על ידי בחירה בין מספר מסלולי חיסון, מודלים PDX הם תכליתיים בשימוש שלהם המאפשר מחקר של היבטים מרובים של המחלה. מודלים של PDXs ללא ספק ימלאו תפקיד חשוב בקידום ההבנה שלנו של גרורות במערכת העצבים המרכזית ופיתוח טיפולים חדשניים.

גילויים

למחברים אין גילויים.

תודות

איור 3A נלקח מהפרסום הקודם שלנו12 ונוצר במעבדה של ד"ר יאן סרקריה במאיו קליניק.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מחט 25GVWRBD305122
70 ומיקרו; מסננת תאים mVWR21008-952
מגבוני אתנול 70%VWR470106-486
שעוות עצםMedVetW31G-RL
CIEA NOG עכברTaconicNOG-F
DMEMThermoFisher11965092
Ethiqa XR (בופרנורפין SR)MWI072117
FBSThermoFisher
gentleMACS C TubeMiltenyi130-093-237
gentleMACS Octo DissociatorMiltenyi130-095-937
מזרק המילטוןסיגמא20919
גורם גדילה מטריג'ל מופחת (GFR)קורנינג354230
משחת עינייםMedVetPH-PURALUBE-VET
PBS/DPBSThermoFisher14040133
Povidone יוד ספוגיותVWR15648-906
מסגרת סטריאוטקסיתStoelting51730
מקדחה כירורגיתStoelting58610
דבק כירורגיMedVetVG3
תפרים כירורגייםMedVetMMV-661-V
מזרקVWR53548-001
ערכת דיסוציאציה של גידולMiltenyi130-095-929
16000044

מקורות

  1. Cruz-Munoz, W., Kerbel, R. S. Preclinical approaches to study the biology and treatment of brain metastases. Seminars in Cancer Biology. 21 (2), 123-130 (2011).
  2. Owonikoko, T. K., et al. Current approaches to the treatment of metastatic brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 11 (4), 203-222 (2014).
  3. Salhia, B., et al. Integrated genomic and epigenomic analysis of breast cancer brain metastasis. PLoS One. 9 (1), 85448(2014).
  4. Kotecha, R., Gondi, V., Ahluwalia, M. S., Brastianos, P. K., Mehta, M. P. Recent advances in managing brain metastasis. F1000Research. 7, 1000(2018).
  5. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  6. Klinghammer, K., et al. A comprehensively characterized large panel of head and neck cancer patient-derived xenografts identifies the mTOR inhibitor everolimus as potential new treatment option. International Journal of Cancer. 136 (12), 2940-2948 (2015).
  7. Lee, H. W., et al. Patient-derived xenografts from non-small cell lung cancer brain metastases are valuable translational platforms for the development of personalized targeted therapy. Clincal Cancer Research: An Official journal of the American Association of Cancer Research. 21 (5), 1172-1182 (2015).
  8. Ni, J., et al. Combination inhibition of PI3K and mTORC1 yields durable remissions in mice bearing orthotopic patient-derived xenografts of HER2-positive breast cancer brain metastases. Nature Medicine. 22 (7), 723-726 (2016).
  9. Oshi, M., et al. Novel breast cancer brain metastasis patient-derived orthotopic xenograft model for preclinical studies. Cancers (Basel). 12 (2), 444(2020).
  10. Garman, B., et al. Genetic and genomic characterization of 462 melanoma patient-derived xenografts, tumor biopsies, and cell lines. Cell Reports. 21 (7), 1936-1952 (2017).
  11. Krepler, C., et al. A comprehensive patient-derived xenograft collection representing the heterogeneity of melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  12. Tew, B. Y., et al. Patient-derived xenografts of central nervous system metastasis reveal expansion of aggressive minor clones. Neuro-Oncology. 22 (1), 70-83 (2020).
  13. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622(2019).
  14. Davies, N. J., et al. Dynamic changes in clonal cytogenetic architecture during progression of chronic lymphocytic leukemia in patients and patient-derived murine xenografts. Oncotarget. 8 (27), 44749-44760 (2017).
  15. Eirew, P., et al. Dynamics of genomic clones in breast cancer patient xenografts at single-cell resolution. Nature. 518 (7539), 422-426 (2015).
  16. Arvanitis, C. D., Ferraro, G. B., Jain, R. K. The blood-brain barrier and blood-tumour barrier in brain tumours and metastases. Nature Reviews. Cancer. 20 (1), 26-41 (2020).
  17. Choi, S., et al. In vivo bioluminescence imaging for leptomeningeal dissemination of medulloblastoma in mouse models. BMC Cancer. 16 (1), 723(2016).
  18. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
  19. Bradford, J. R., et al. Whole transcriptome profiling of patient-derived xenograft models as a tool to identify both tumor and stromal specific biomarkers. Oncotarget. 7 (15), 20773-20787 (2016).
  20. Yip, H., Haupt, C., Maresh, G., Zhang, X., Li, L. Humanized mice for immune checkpoint blockade in human solid tumors. American Journal of Clinical and Experimental Urology. 7 (5), 313-320 (2019).

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים