הפרוטוקול נועד לספק שיטה סטנדרטית לרטט של ביציות כבשים בוגרות וצעירות. הוא כולל את כל השלבים מהכנת אמצעי ההבשלה במבחנה לתרבות שלאחר ההתחממות. אוציטים עוברים רטט בשלב MII באמצעות Cryotop כדי להבטיח את עוצמת הקול החיונית המינימלית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ויטריפיקציה של אין ויטרו התבגר אוציטס שנאספו מן השחלות למבוגרים טרום-פוברטל בכבשים
במאמר זה
סיכום
תקציר
במשק החי, מערכות ייצור עובר במבחנה ניתן לפתח ומתקיים הודות למספר רב של שחלות וביצים שניתן להשיג בקלות מבית מטבחיים. השחלות הבוגרות נושאות תמיד מספר זקיקי נמלים, ואילו בתורמים לפני גיל ההתבגרות המספרים המקסימליים של ביציות זמינים בגיל 4 שבועות, כאשר השחלות נושאות מספר שיא של זקיקים antral. לכן, כבשים בני 4 שבועות נחשבים לתורמים טובים, גם אם היכולת ההתפתחותית של ביציות טרום-דוקטורט נמוכה יותר בהשוואה למקבילם הבוגר.
מחקר בסיסי ויישומים מסחריים יקודמו על ידי האפשרות של cryopreserving בהצלחה ביציות vitrified שהושגו מתורמים מבוגרים וקדם-פתורליים כאחד. הוויטריפיקציה של ביצית שנאספה מתורמים טרום-פתריאליים תאפשר גם לקצר את מרווח הייצור ובכך להגדיל את הרווח הגנטי בתוכניות הרבייה. עם זאת, אובדן הפוטנציאל ההתפתחותי לאחר cryopreservation עושה ביציות יונקים כנראה אחד מסוגי התאים הקשים ביותר cryopreserve. בין טכניקות ההקפאה הזמינות, רטט מוחל באופן נרחב על ביציות בעלי חיים ובני אדם. למרות ההתקדמות האחרונה בטכניקה, חשיפות לריכוזים גבוהים של סוכנים קריופרוטקטיביים, כמו גם פציעה מצמררת ומתח אוסמוטי עדיין גורמים למספר שינויים מבניים ומולקולריים ומפחיתים את הפוטנציאל ההתפתחותי של ביציות יונקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול להסתבכות של ביציות כבשים שנאספו מתורמים צעירים ובוגרים והתבגרו במבחנה לפני ההקפאה. הפרוטוקול כולל את כל ההליכים החל מהבשלת ביצית במבחנה ועד תקופת ההזדווגות, ההתחממות והדגירה שלאחר ההתחממות. אוציטים הנבטים בשלב MII אכן יכולים להיות מופרים לאחר ההתחממות, אך הם זקוקים לזמן נוסף לפני ההפריה כדי לשחזר נזק עקב הליכי cryopreservation ולהגדיל את הפוטנציאל ההתפתחותי שלהם. לכן, תנאי תרבות שלאחר ההתחממות ותזמון הם צעדים חיוניים לשיקום הפוטנציאל ההתפתחותי ביצית, במיוחד כאשר ביצית נאספים מתורמים צעירים.
מבוא
אחסון ארוך טווח של הגמטות הנשיות יכול להציע מגוון רחב של יישומים, כגון שיפור הרבייה של בעלי חיים ביתיים על ידי תוכניות בחירה גנטית, תרומה לשימור המגוון הביולוגי באמצעות תוכנית שימור מינים לשעבר של חיות בר, וחיזוק המחקר והיישומים הביוטכנולוגיים במבחנה הודות לזמינות של ביציות מאוחסנות שישולבו בייצור עוברי במבחנה או בתוכניות השתלה גרעינית1,2,3. ויטריפיקציה של ביציות לנוער גם תגדיל את הרווח הגנטי על ידי קיצור מרווח הייצור בתוכניות הרבייה4. רטט על ידי קירור מהיר במיוחד והתחממות של ביציות נחשב כיום גישה סטנדרטית עבור הקפאה ביציות בעלי חיים5....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
פרוטוקול בעלי החיים והנהלים המיושמים להלן תואמים את ההנחיות האתיות החלות באוניברסיטת ססארי, בהתאם להנחיית האיחוד האירופי 86/609/EC ולהמלצת נציבות הקהילות האירופיות 2007/526/EC.
1. הכנת מדיה למניפולציה ביצית
- הכן את המדיום להובלת השחלות שנאספו על ידי שכשהם מלוחים אגירה פוספט של Dulbecco עם 0.1 g / L פניצילין ו 0.1 g / L סטרפטומיצין (PBS).
- הכן את המדיום עבור אוסף ביציות והתבגרות על ידי דילול 9.5 גרם של רקמות תרבית בינונית (TCM) 199 באבקה עם 1 L של מים מילי-Q בתוספת פניצילין (0.1%) וסטרפטומיצין (0.1%).
- לאחר דילול, לסנן 100 מ"ל של בינוני ולאחסן אותו ב 4 °C (70 °F) כמו בינוני התבגרות מלאי (SMM) לשמש במשך שבוע אחד. ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ההקפאה של ביצית מתורמים צעירים נמוכה יותר בהשוואה למבוגרים. ההשפעה הראשונה שנצפתה היא שיעור הישרדות נמוך יותר לאחר התחממות לעומת ביציות למבוגרים (איור 1A;χ2 מבחן P<0.001). ביציות נעורים הראו שלמות קרום נמוכה יותר לאחר ההתחממות (איור 1B). השימוש בטרהלוז במדיום ההבשלה נועד לאמת אם סוכר זה יכול להפחית קריו-ינחוי ביציות לנוער. הנתונים הראו23 כי ביציות התבגרו במשך 24 שעות עם תוספי trehalose הראו שיעורי הישרדות גבוהים יותר לאחר vi.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הקפאה של ביציות במשפחה יכולה לאפשר לא רק שימור ארוך טווח של משאבים גנטיים נשיים, אלא גם לקדם את הפיתוח של ביוטכנולוגיה עוברית. לפיכך, פיתוח שיטה סטנדרטית עבור ויטריפיקציה ביצית ינצל הן את בעלי החיים והן את מגזר המחקר. בפרוטוקול זה, מוצגת שיטה מלאה להסתערות ביציות כבשים למבוגרים ויכולה להוות נקודת התחלה איתנה לפיתוח מערכת ויטריפיקציה יעילה עבור ביצית לנוער.
אחד היתרונות העיקריים של השיטה המוצעת הוא שהיא כוללת את כל השלבים מאוסף ביציות, התבגרות במבחנה, ויטריפיקציה והתחממות. יתר על כן, הוא כולל ת.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
המחברים לא קיבלו מימון ספציפי לעבודה זו. פרופסור מריה גרציה Cappai וד"ר ולריה Pasciu הם הודה בהכרת תודה על קריינות וידאו ועל הקמת המעבדה במהלך עשיית וידאו.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 2&פריים;,7&פריים;-דיכלורופלואורסצין דיאצטט | סיגמא-אולדריץ' | D-6883 | |
| אלבומין בקר שבר V, ללא פרוטאז | סיגמא-אולדריץ' | A3059 | |
| ביסבנזימיד H 33342 טריהידרוכלוריד (הוכסט 33342) | סיגמא-אולדריץ' | 14533 | |
| סידן כלורי (CaCl2 2H20) | סיגמא-אולדריץ' | C8106 | |
| חומצת לימון | Sigma-Aldrich | C2404 | |
| מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי | Leica Microsystems GmbH, Wetzlar | TCS SP5 DMI 6000CS | |
| Cryotop Kitazato | טכנולוגיות ביולוגיות רפואיות | ||
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | M9768 | |
| D- (-) פרוקטוז | סיגמא-אולדריץ' | F0127 | |
| D(+)טרהלוז מיובש | סיגמא-אולדריץ' | T0167 | |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | סיגמא-אולדריץ' | D2438 | |
| דולבקו פוספט חוצץ מלח | סיגמא-אולדריץ' | D8537 | |
| חלמון ביצה | סיגמא-אולדריץ' | P3556 | |
| אתילן גליקול (EG) | סיגמא-אולדריץ | 324558 | |
| FSH | סיגמא-אולדריץ' | F4021 | |
| חומצה גלוטמית | סיגמא-אולדריץ | G5638 | |
| גלוטרלדהיד | סיגמא-אולדריץ | G5882 | |
| גליצרול | סיגמא-אולדריץ | G5516 | |
| גליצין | סיגמא-אולדריץ' | G8790 | |
| הפרין | סיגמא-אולדריץ' | H4149 | |
| HEPES | סיגמא-אולדריץ' | H4034 | |
| היפוטרין | סיגמא-אולדריץ' | H1384 | |
| מיקרוסקופ הפוך | דיאפוט, ניקון | ||
| L-אלנין | סיגמא-אולדריץ' | A3534 | |
| L-ארגינין | סיגמא-אולדריץ' | A3784 | |
| L-אספרגין | סיגמא-אולדריץ' | A4284 | |
| L-חומצה אספרטית | סיגמא-אולדריץ | A4534 | |
| L-ציסטאין | Sigma-Aldrich | C7352 | |
| L-ציסטין | סיגמא-אולדריץ' | C8786 | |
| L-גלוטמין | סיגמא-אולדריץ' | G3126 | |
| LH | סיגמא-אולדריץ | L6420 | |
| L-היסטידין | סיגמא-אולדריץ' | H9511 | |
| L-איזולאוצין | סיגמא-אולדריץ' | I7383 | |
| L-לאוצין | סיגמא-אולדריץ | ' L1512 | |
| ל-ליזין | סיגמא-אולדריץ' | L1137 | |
| ל-מתיונין | סיגמא-אולדריץ' | M2893 | |
| ל-אורניתין | סיגמא-אולדריץ' | O6503 | |
| ל-פנילאלנין | סיגמא-אולדריץ' | P5030 | |
| ל-פרולין | סיגמא-אולדריץ' | P4655 | |
| ל-סרין | Sigma-Aldrich | S5511 | |
| L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T1020 | |
| L-Valine | Sigma-Aldrich | V6504 | |
| מגנזיום כלוריד heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Makler Counting Chamber | Sefi-Medical Instruments Ltd. Biosigma S.r.l. | ||
| בינוני 199 | Sigma-Aldrich | M5017 | |
| שמן מינרלי | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| MitoTracker אדום CM-H2XRos | ThermoFisher | M7512 | |
| נסיוב עגל חדש מושבת בחום (FCS) | Sigma-Aldrich | N4762 | |
| פניצילין G מלח נתרן | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| פנול אדום | סיגמא-אולדריץ' | P3532 | |
| אלכוהול פוליוויניל (87-90% הידרוליזה, משקל מול ממוצע 30,000-70,000) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| אשלגן כלורי (KCl) | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| סרום כבשים | Sigma-Aldrich | S2263 | |
| נתרן אזיד | Sigma-Aldrich | S2202 | |
| נתרן ביקרבונט (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| נתרן כלורי (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| סירופ תמיסת נתרן dl-לקטט | Sigma-Aldrich | L4263 | |
| נתרן פירובט | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| מנתח מחלקת זרע | Microptic S.L. | S.C.A. v 3.2.0 | |
| תוכנה סטטיסטית Minitab 18.1 | 2017 | ||
| Olimpus | SZ61 | ||
| Streptomycin sulfate | Sigma-Aldrich | S9137 | |
| טאורין | Sigma-Aldrich | T7146 | |
| TRIS | Sigma-Aldrich | 15,456-3 |
מקורות
- Arav, A. Cryopreservation of oocytes and embryos. Theriogenology. 81 (1), 96-102 (2014).
- Mullen, S. F., Fahy, G. M. A chronologic review of mature oocyte vitrification research in cattle, pigs, and sheep. Theriogenology. 78 (8), 1709-1719 (2012). <....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
