מאמר שיטה

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

DOI:

10.3791/62298

⸱

21 באפריל 2021

 , 
1Beijing Institute of Ophthalmology, Beijing Tongren Eye Center, Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University, Beijing Ophthalmology & Visual Science Key Laboratory

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתלת תאי רשתית היא גישה טיפולית מבטיחה, שיכולה לשחזר את ארכיטקטורת הרשתית ולייצב או אפילו לשפר את יכולות הראייה לרשתית המנוונת. עם זאת, ההתקדמות בטיפול בתחליפי תאים מתמודדת כיום עם האתגרים הדורשים מקור מדף של רשתיות אנושיות איכותיות וסטנדרטיות. לכן, יש צורך בפרוטוקול קל ויציב לניסויים. כאן, אנו מפתחים פרוטוקול אופטימלי, המבוסס על שיטת ארגון עצמי עם שימוש במולקולות אקסוגניות וריאגנט A, כמו גם כריתה ידנית ליצירת אורגנואידים תלת מימדיים של הרשתית האנושית (RO). RO שמקורו בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (PSCs) מבטא סמנים ספציפיים לפוטורצפטורים. עם תוספת של COCO, אנטגוניסט רב תכליתי, יעילות ההבחנה של מבשרי פוטורצפטור ומדוכים גדלה באופן משמעותי. השימוש היעיל במערכת זו, שיש לה את היתרונות של קווי תאים ותאים ראשוניים, וללא בעיות המקור הקשורות לאחרון, עלול לייצר תאי רשתית מפגשים, במיוחד פוטורצפטורים. לפיכך, ההתמיינות של PSCs ל-RO מספקת פלטפורמה אופטימלית ורלוונטית ביולוגית למידול מחלות, בדיקת תרופות והשתלת תאים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSCs) מאופיינים בהתחדשות עצמית וביכולתם להתמיין לכל מיני תאים סומטיים. לפיכך, אורגנואידים שמקורם ב-PSCs הפכו למשאב חשוב במחקר ברפואה רגנרטיבית. ניוון הרשתית מאופיין באובדן פוטורצפטורים (מוטות ומדוכים) ואפיתל פיגמנט רשתית. החלפת תאי רשתית יכולה להיות טיפול מעודד למחלה זו. עם זאת, לא ניתן להשיג רשתיות אנושיות למחקר וטיפול במחלות. לכן, אורגנואידים של הרשתית (ROs) שמקורם ב-PSCs, אשר משחזרים ביעילות ובהצלחה תאי רשתית מקומיים רב-שכבתיים, מועילים למחקר בסיסי ותרגומי 1,2,3. המחקר שלנו מתמקד בהתמיינות RO כדי לספק תאים מספיקים ואיכותיים לחקר ניוון הרשתית4.

שיטות להבחנה בין ROs מתפתחות ללא הרף, עם דיפרנציאציה תלת מימדית (3D) מתלים חלוצה על ידי מעבדת Sasai בשנת 20125. הצגנו את התג CRX-tdTomato בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) כדי לעקוב באופן ספציפי אחר התאים המבשרים של הפוטורצפטור ושינינו את השיטה עם תוספת של COCO, אנטגוניסט רב-תכליתי של מסלולי Wnt, TGF-β ו-BMP6. הוכח כי COCO משפר ביעילות את יעילות ההתמיינות של מבשרי פוטורצפטורומדוכים 6,7.

בסך הכל, על ידי שינוי שיטת ההבחנה הקלאסית, פיתחנו פרוטוקול נגיש לקצירת מבשרי פוטורצפטור ומדוכים רבים מ- ROs אנושיים לניתוח מחלת הרשתית הקשורה לפוטורצפטורים באמצעות חקירות מעבדה ולהמשך יישום קליני / השתלה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים בייג'ינג טונגרן, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. H9 hESCs התקבלו ממכון המחקר WiCell והונדסו גנטית לקו תאים המתויגים על ידי tdTomato.

1. דור של ROs אנושיים

  1. תרבו את ה-hESCs בתנאים נטולי הזנה.
    1. מצפים באר אחת של צלחת 6 בארות עם 1 מ"ל של 0.1 מ"ג / מ"ל מגיב A (טבלת חומרים) ב 37 מעלות צלזיוס לפחות חצי שעה בהתאם להוראות היצרן. הפשרה של 1x106 hESCs.
      הערה: הכינו 3 מ"ל של מגיב B (טבלת חומרים) שחומם מראש והעבירו את התאים המוקפאים (1 מ"ל) ל-3 מ"ל של מדיום טרי. אין להעביר את ה-hESCs לתאים בודדים.
    2. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.
    3. זרעו את התאים לתוך צלחת מגיב מצופה A עם 2 מ"ל של מגיב B והחליפו 2 מ"ל של מגיב B מדי יום. תאי מעבר כאשר מגיעים לכ 80% מפגש (בדרך כלל סביב 4 ימים).
  2. יום 0
    1. יש לנתק את ה-hESCs לתרחיף חד-תאי באמצעות מדיום I (טבלה 1). הכן את Medium I על ידי ערבוב הפריטים הבאים: 20% (v/v) תחליף סרום KnockOut (KSR), תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA) של 0.1 mM MEM, פירובט 1 mM, 3 μM IWR-1-endo (IWR1e), 30 ננוגרם/מ"ל COCO, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין (PS), 0.1 mM β-מרקפטואתנול, והמדיום החיוני המינימלי (GMEM) של גלזגו.
      הערה: לפני תחילת הדיסוציאציה, הכינו מדיום I והעבירו 12 מ"ל של מדיום I עם 20 מיקרומטר Y-27632 לצלחת פטרי בגודל 10 ס"מ, 500 מיקרוגרם מגיב C (טבלת חומרים) המכילים 0.05 מ"ג/מ"ל מגיב D (טבלת חומרים) ו-20 מיקרומטר Y-27632 בצינור של 1.5 מ"ל. בצע את השלבים לעיל בחושך, מכיוון שרכיב IWR1e במדיום I רגיש לאור.
    2. שטפו את ה-hESCs עם חיץ מלח (DPBS) של 1x Dulbecco שחומם מראש.
    3. הוסף את המגיב המוכן 500 μL (בצינור 1.5 מ"ל) ודגירה של hESCs במשך 3.5 דקות ב 37 °C ו 5% CO2.
    4. נתקו את התאים על ידי הזזת הצד והתחתית של הצלחת למשך מספר שניות והוסיפו 500 μL של מדיום מוכן I מצלחת פטרי לתוך צלחת hESC.
      הערה: הכן שפופרת של 1.5 מ"ל עם 900 μL של DPBS 1x והשתמש בהמוציטומטר לספירת תאים.
    5. קצירת התאים בצינור חדש של 1.5 מ"ל ופיפטה של מתלה התאים למעלה ולמטה ואז מוציאים 100 μL מהצינור ואז מוסיפים לתוך הצינור עם 900 μL של DPBS לספירת תאים.
    6. פזרו את תרחיף התאים השמאלי בנפח 900 μL ולאחר מכן דיללו את התאים עם מדיום מוכן I בצלחת פטרי ל-9 x 104 תאים /מ"ל.
      הערה: כל נפח המדיום הוא 12 מ"ל; 1.08 x 106 תאים נדרשים בסך הכל.
    7. הוסף 100 μL של תרחיף תאים לכל באר של צלחת שאינה דבקה, V-bottom, 96-well (טבלת חומרים).
      הערה: השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי לקצר את הזמן ולוודא שכל באר מכילה מספר תא שווה ערך. יש לנער את צלחת הפטרי בכל פעם לפני הסרת מנות של 100 μL. חשוב כי התאים מופצים באופן אחיד.
    8. סובבו קלות את צלחת 96 הבאר בשייקר במהירות נמוכה למשך 5 דקות ולאחר מכן דגרו ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.
      הערה: שמור את הצלחת בחושך. הגדר את היום כיום 0.
  3. יום 2
    1. הוסף 1% מגיב A (טבלת חומרים). הכן ריאגנט A (ריכוז חלבון של 10 מ"ג/מ"ל) על ידי הוספת 133.4 μL של מגיב A לתוך 2 מ"ל של בינוני I.
      הערה: יש לשמור על ריאגנט A בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה לפני השימוש כדי להשיג התכה מלאה ואחידה. שים לב למידע על המוצר וחפש את מספר הקטלוג ואת מספר המגרש באתר הרשמי של החברה כדי לקבל את ריכוז החלבון של מגיב A כמו כל בקבוק של מגיב A הוא בריכוז חלבון שונה. אם ריכוז החלבון נמוך, נפח מוגבר של מגיב A יעזור.
    2. מוסיפים 20 μL של מגיב מוכן A לכל באר ופיפטה פעמיים במרכז כדי לפזר את התאים המתים.
      הערה: שמרו על מגיב A ועל צלחת 96 הבאר בתנאי קרירות והשלימו את כל השלבים על הקרח. מניחים את הצלחת בחושך.
  4. ימים 2-12
    1. מנקים את החלק התחתון של צלחת 96 הבאר ודוגרים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עד היום ה-6. ביום 6, שנה מחצית מהמדיום על ידי הסרת 58 μL של המדיום מכל באר והוספת 60 μL של בינוני I.
      הערה: השתמש בפיפטה רב-ערוצית כדי להשלים את חצי השינוי הבינוני. בצעו את הצעד הזה בעדינות כדי להבטיח שלא יוסרו כדורי תאים מהבאר. שאפו את המדיום לצלחת פטרי נקייה בקוטר 10 ס"מ. אם יש כדוריות תאים בפנים, הוסף אותן בחזרה לצלחת 96 הבאר.
  5. ימים 12- 18
    1. שנה את המדיום לבינוני II (טבלה 1) ביום 12. הכן את Medium II באמצעות מגיב A של 1% (v/v) על ידי ערבוב הפריטים הבאים: 10% סרום בקר עוברי (FBS), 0.1 mM NEAA, 1 mM פירובט, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 0.1 mM β-מרקפטואתנול, 100 ננומטר SAG דיהידרוכלוריד ו- GMEM. אחסנו אותו בתנאים קרירים וחשוכים.
    2. קוצרים את כדורי התא בצינור חרוטי של 15 מ"ל מהצלחת בעלת 96 הבארות ומאפשרים לכדורים להתיישב באופן טבעי למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
      הערה: יש להסיר את המדיום ואת הכדורים בעדינות מתחת לפני השטח כדי למנוע בועות.
    3. הסר את supernatant תוך טיפול באורגנואידים. מעבירים את אגרגטי התאים לצלחת תלייה בקוטר 10 ס"מ המכילה 18 מ"ל של מדיום II מוכן עם מגיב A.
      הערה: אין להוסיף את המדיום II המוכן למנה בגודל 10 ס"מ מראש, שכן מגיב A צריך להיות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
    4. דגירה ב 37 °C ו 5% CO2 עד היום 18.
  6. מהיום ה-18 ואילך
    1. שנה את המדיום למדיום III (טבלה 1). הכן את מדיום III בתנאים כהים על ידי ערבוב המרכיבים הבאים: 10% FBS, 1xsupplement 1, 0.5 μM חומצה רטינואית (RA), טאורין 100 μM, 100 U/mL פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין ותערובת 1:1 של תערובת הנשר המעובד (DMEM)/תערובת החומרים המזינים F-12 של דולבקו.
    2. ביום ה -18, כאשר נוצרת שלפוחית אופטית שקופה למחצה, חותכים את האורגנואידים באמצעות סכין מיקרו-כירורגית.
      הערה: מבקעים את האורגנואיד, בדרך כלל לארבעה חלקים, בצלחת פטרי עם מדיום II. כל חתיכה אמורה לגדול לכוס אופטית שלמה בשבועות הבאים.
    3. צוברים את כל הכדורים למרכז המנה. קצירת התאים לתוך צינור בז חרוטי של 15 מ"ל ומאפשרת התיישבות טבעית. לאחר מכן יש להסיר בעדינות את הסופרנטנט.
      הערה: בשל גודלם, ניתן לצבור אורגנואידים במרכז על ידי סיבוב צלחת פטרי בכיוון אחד במשך 90° במישור אופקי מספר פעמים.
    4. משהים ומפזרים את הכדורים בשתי צלחות פטרי בקוטר 10 ס"מ, עם 18 מ"ל בינוני III למנה, ומעבירים בעדינות את הכלים לאינקובטור כדי למנוע צבירת תאים. המשך להתרבות בבינוני III ב 37 °C ו 5% CO2 ולשנות את הבינוני מדי שבוע. ה-CRX התבטא לאחר היום ה-45 ועד היום ה-120, יכולנו לזהות את הקטע החיצוני של הפוטורצפטור.

2. ניתוח ROs אנושיים

  1. ניתוח FACS
    1. הרכיבו מהמנות שלושה אורגנואידים של CRX-tdTomato ושלושה אורגנואידים שמקורם ב-H9 ES באמצעות קצוות חתוכים של 1 מ"ל. לשטוף את האורגנואידים עם 1 מ"ל של DPBS מחומם מראש (טמפרטורת החדר).
    2. הכן את מאגר העיכול על ידי ערבוב תמיסת טריפסין-EDTA של 0.25% עם 0.05 מ"ג/מ"ל של מגיב D.
    3. נתקו את האורגנואידים לתאים בודדים על ידי שימוש במאגר העיכול המוכן למשך 8 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן הוסף את אותו נפח של DPBS עם 10% FBS ו 0.05 מ"ג / מ"ל של מגיב D כדי להשבית את התגובה.
    4. להשעות ולפזר קלות את התאים ולאחר מכן לסנן באמצעות מסננת תאים של 100 מיקרומטר ולהשתמש במערכת מיון תאים המופעלת על ידי פלואורסצנציה (FACS) בקו לייזר עירור של 561 ננומטר ובמסנן 780/60 כדי לנתח את האותות החיוביים של CRX-tdTomato.
      הערה: CRX מתבטא בתחילה ביום 45 ומתגבר עם הבשלת האורגנואידים. עשרת אלפים תאים משמשים עבור כל בדיקה, עבור כל נקודת זמן, לפחות שלוש חזרות הושלמו.
  2. כימות עוצמת פלואורסצנציה של ROs
    1. הכינו את האורגנואידים הקיימים באופן אקראי להדמיה.
      הערה: הגדר את הפרמטרים והשתמש באותם מסננים ופרמטרים עבור כל צגי עוצמת הפלואורסצנטיות.
    2. צלם תמונות ונתח את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת באמצעות תוכנה מתאימה (לדוגמה, ImageJ).
    3. ייבא את התמונות ולאחר מכן המר ל- 8 סיביות באמצעות Image | סוג.
    4. התאם את הסף באמצעות פרמטרי ברירת המחדל לפי Image | התאמת | סף.
    5. קבע את השטח הנמדד ולאחר מכן הערך האפור באמצעות נתח | למדוד.
      הערה: הערכים הממוצעים בלוח התוצאות הם עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של השטח הנמדד.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

האיור הסכמטי מתאר את פרוטוקול ההתמיינות לשיפור תאים מבשרים באמצעות COCO (איור 1). מ- PSC ל- ROs, פרטים רבים עלולים לגרום לשינויים בתוצאות. מומלץ להקליט כל שלב ואפילו את המספר הקטלוגי ואת מספר המגרש של כל מדיום כדי לעקוב אחר ההליך כולו.

כאן אנו מספקים תמונות שדה בהירות לימים 6, 12, 18 ו-45 (איור 2). ביום השישי, האורגנואידים הם בדרך כלל בקוטר של כ-600 מיקרומטר בלוח של 96 בארות, עם חיבורים צפופים בפנים ושפה בהירה (אי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התמיינות אורגנואידית רשתית היא שיטה רצויה ליצירת תאי רשתית מתפקדים בשפע. ה-RO הוא תרכובת של תאי רשתית שונים, כגון תאי גנגליון, תאים דו קוטביים ופוטורצפטורים, הנוצרים על ידי תאי גזע פלוריפוטנטיים לכיוון הרשתית העצבית 4,5,8,9. למרות שניתן לקצור ROs נפגשים, זה גוזל זמן, מה שעשוי לדרוש תקופות גידול ארוכות (עד 180 יום). עם זאת, עבור השתלת פוטורצפטורים, או חקר ניוון חרוט-מוט או רוד-חרוט, כדאי להשיג א...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לחברי מעבדת 502 על התמיכה הטכנית וההערות המועילות בנוגע לכתב היד. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג'ינג (Z200014) ותוכנית המו"פ הלאומית של סין (2017YFA0105300).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
2-מרקפטואתנולLife Technologies21985-023
COCOR& D Systems3047-CC-050DAN Domain משפחת אנטגוניסטים של BMP
DMEM/F-12Gibco10565-042
DMSOSigmaD2650
DPBSGibcoC141905005BT
EDTAThermo15575020
סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך לתאי גזע עובריים אנושייםתעשייה ביולוגית04-002-1A
GMEMGibco11710-035
KnockOut החלפת סרום-רב-מיניםGibcoA3181502
MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)sigmaM7145
Pen StrepGibco15140-122
Primesurface 96 V-plateSbioMS9096SZצבירת תאים ב-1.2.7
פירובטSigmaS8636
מגיב ABD356231מטריג'ל ב-1.1.1
מגיב BStemCell5990mTeSR-E8 , PSCs מדיום בסיסי ב-1.1.2
מגיב CGibco12563-011TrypLE Express ב-1.2
מגיב DRoche11284932001DNase I , ב-1.2
חומצה רטינואיתSigmaR2625-100MG
SAGEnzo Life ScienceALX-270-426-M001
תוסף תזונה 1Life Technologies17502-048N-2 תוסף (100X), נוזלי, תוסף במדום III
טאוריןסיגמאT-8691-25G
טריפסין-EDTA (0.25%), פנול אדוםGibco25200056דיסוציאציה אורגנואידים ב-2.1.3
Wnt אנטגוניסט I, IWR-1-endo - Calbiochemמעכב סיגמא681669Wnt
Y-27632 2HClSelleckS1049

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xie, H., et al. Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids. Science Advances. 6 (6), 5247(2020).
  2. Lu, Y. F., et al. Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development. Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).
  3. Cowan, C. S., et al. Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
  4. Jin, Z. B., et al. Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells. Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).
  5. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  6. Pan, D., et al. COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids. Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366(2020).
  7. Zhou, S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling. Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).
  8. Deng, W. L., et al. Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients. Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).
  9. Gao, M. L., et al. Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128(2020).
  10. Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. The road to restore vision with photoreceptor regeneration. Experimental Eye Research. 202, 108283(2020).
  11. Reichman, S., et al. From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).
  12. Kuwahara, A., et al. Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue. Nature Communications. 6, 6286(2015).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CRX

מאמרים קשורים