כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור מערכים של מיקרוטיסות שרירי השלד האנושיים בתלת-ממד ופולשניות מינימלית במורד הזרם בתקיפות תפקודיות, כולל כוח התכווצות ניתוחי טיפול בסידן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הערכת מדדים תפקודיים של בריאות שריר השלד במיקרוטיסוסות שריר השלד האנושי
במאמר זה
סיכום
תקציר
מודלים תלת-ממדיים (3D) במבחנה של שריר השלד הם התקדמות חשובה במחקר הביו-רפואי מכיוון שהם מאפשרים את ההזדמנות ללמוד רפורמציה בשרירי השלד ולתפקד במתכונת מדרגית הניתנת למניפולציות ניסיוניות. מערכות תרבית שרירים תלת-ממדיות רצויות מכיוון שהן מאפשרות למדענים לחקור את שרירי השלד אקס ויו בהקשר של תאים אנושיים. מודלים במבחנה תלת-ממדית מחקים מקרוב היבטים של מבנה הרקמה המקומי של שריר השלד הבוגר. עם זאת, היישום האוניברסלי שלהם מוגבל על ידי הזמינות של פלטפורמות כי הם פשוטים לפברק, עלות וידידותי למשתמש, ולהניב כמויות גבוהות יחסית של רקמות שריר השלד האנושי. בנוסף, מכיוון ששריר השלד ממלא תפקיד תפקודי חשוב הפוגע לאורך זמן במדינות מחלה רבות, פלטפורמה ניסיונית למחקרי מיקרוטיסו היא המעשית ביותר כאשר מדידות כוח סידן חולפות וצמצמות זעיר פולשניות יכולות להתבצע ישירות בתוך הפלטפורמה עצמה. בפרוטוקול זה, ייצור של פלטפורמה 96-well המכונה 'MyoTACTIC', וייצור המוני של microtissues שריר השלד האנושי 3D (hMMTs) מתואר. בנוסף, השיטות ליישום זעיר פולשני של גירוי חשמלי המאפשר מדידות חוזרות ונשנות של כוח שריר השלד וטיפול בסידן של כל מיקרוטיסה לאורך זמן מדווחות.
מבוא
שריר השלד הוא אחת הרקמות הנפוצות ביותר בגוף האדם ותומך בתפקודי גוף מפתח כגון קטר, הומאוסטזיס חום ומטבוליזם1. מבחינה היסטורית, מודלים של בעלי חיים ומערכות תרבית תאים דו-ממדיות (2D) שימשו לחקר תהליכים ביולוגיים ופתוגנזה של מחלות, כמו גם לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות בטיפול במחלות שרירי השלד2,3. בעוד מודלים של בעלי חיים שיפרו מאוד את הידע שלנו על שרירי השלד בבריאות ובמחלות, השפעתם התרגומית נפגעה על ידי עלויות גבוהות, שיקולים אתיים והבדלים בין המינים2,4. בפנייה למערכות מבוססות תאים אנושיים כדי לחקור את שרירי השלד, מערכות תרבית תאים דו-....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. ייצור צלחת מיוטקטית PDMS
הערה: ייצור צלחת MyoTACTIC PDMS דורש עובש PU שלילי, אשר ניתן לייצר כפי שתואר בעבר30. קובץ SolidWorks של עיצוב בעזרת מחשב (CAD) עבור עיצוב הלוחות MyoTACTIC הפך לזמין ב- GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
- הכן ~ 110 גרם של פתרון פולימר PDMS בכוס פלסטיק חד פעמית ביחס של 1:15 של מונומר לסוכן ריפוי באמצעות הרכיבים בערכת אלסטומר הסיליקון. מערבבים את תמיסה פולימרית במשך 2-3 דקות באמצעות פיפטה סרולוגית חד פעמית 5 מ"ל עד מעורב לחלוטין הומוגני.
אזהרה: הימנע ממגע פתרון פולימר PDMS עם העור והעיניים; ולהימנע משאיפה. תמיד ללבוש חלוק מעבדה וכפפות חד פעמיו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
מתוארות כאן שיטות להטיל פלטפורמת תרבות MyoTACTIC מבוססת PDMS בת 96 טוב מתבנית PU, לפברק מערכים של רקמות העתק hMMT, ולנתח שני היבטים של פונקציית hMMT בתוך ייצור ייצור כוח התקן התרבות וטיפול בסידן. איור 1 מציע סקירה סכמטית של הכנת בארות התרבות MyoTACTIC לפני זריעת hMMT. PDMS הוא פולימר מבוסס סיליקון בשימוש נרחב, שניתן לעצב בקלות כדי ליצור התקנים מורכבים32. פרוטוקול מבוסס PDMS תוכנן להטיל מספר בלתי מוגבל של התקני תרבות 96-well מתוך עובש PU שלילי מיוצר30.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כתב יד זה מתאר שיטות לפברק ולנתח מודל תרבות hMMT תלת-ממדי שניתן ליישם במחקרים של ביולוגיה בסיסית של שרירים, מידול מחלות או לבדיקת מולקולות מועמדות. פלטפורמת MyoTACTIC ידידותית לעלות, קלה לייצור, ודורשת מספר קטן יחסית של תאים כדי לייצר מיקרוטיסות שרירי השלד. h hMMTs שנוצר בתוך פלטפורמת התרבות MyoTACTIC מורכבים ממיוטיובים מיושרים, רב-גרעיניים ומפוספסים, ומגיבים לגירויים חשמליים על ידי ייזום סידן ארעי המפעיל התכווצות (איור 2, איור 3, איור 4
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.
תודות
ברצוננו להודות למוחמד אפשר, הבן אברהא, מוחסן אפשר-בקושלי וסאדה דאבודי על תרומתם להמצאת פלטפורמת התרבות המיומטקטית והקמת שיטות הייצור והניתוח המתוארות כאן. HL קיבלה מימון מתוכנית הכשרה של המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה (NSERC) במלגת הנדסה ויזמות של אוניברסיטת טורונטו וילדקט. PMG הוא יו"ר המחקר בקנדה בתיקון אנדוגני וקיבל תמיכה למחקר זה ממכון אונטריו לרפואה רגנרטיבית, רשת תאי הגזע, ומרפואה על ידי עיצוב, תוכנית מצוינות מחקר ראשונה בקנדה. דיאגרמות סכמטיות נוצרו באמצעות BioRender.com.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת מלח 0.9%, | מותג בית | 1010 | 10 מ"ל של התמיסה מיוצרות ומאוחסנות בטמפרטורה של 4 מעלות; C |
| 25G Needle | BD, Medstore, אוניברסיטת טורונטו | 2548-CABD305127 | |
| 6-חומצה אמינוקפרואית, ≥ 99% (טיטרציה), אבקת | סיגמא - Aldrich | A2504-100G | תמיסת מלאי של 50 מ"ג / מ"ל נוצרת על ידי המסת 5 מ"ג של אבקת חומצה 6-אמינוקפרואית ב -100 מ"ל מים מזוקקים ואוטומטיים. התמיסה מסוננת בוואקום ו-10 מ"ל מאחסנים ב-4° C |
| 6.35 מ"מ ID צינורות VWR | 60985-528 | ||
| AB1167 Myoblast Cell | Line Institut de Myologie (פריז, צרפת) | ||
| מחולל צורות גל שרירותיות | Rigol | DG1022Z | |
| תמצית קרום מרתף (Geltrex) | Thermo Fisher Scientific | A14132-02 | מאוחסן כציטוטים של 50 µ L או 100 ומיקרו; L ב-80° C |
| סיגמא תא ואקום ספסל | - Aldrich | D2672 | |
| BNC לכבל | הוזמן מאמזון | ||
| תרבית פלסטיק | Sarstedt | כולל צלחות תרבית, פיפטות סרולוגיות וכו' | |
| דימתיל סולפוקסיד | סיגמא - Aldrich | D8418-250ML | |
| DPBS, אבקה, ללא סידן, ללא מגנזיום | תרמו פישר מדעי | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Gibco | 11995-065 | זהו DMEM עתיר גלוקוז עם L-גלוטמין ונתרן פירובט |
| סרום בקר עוברי | פישר 10437028 | ||
| פיברינוגן מ-Bovine Plasma | Sigma - Aldrich | F8630-5G | Aliquots הנעים בין 7 - 10 מ"ג של אבקת פיברינוגן מיוצרים ומאוחסנים ב-20° |
| מסנן מזרק C Filtropur, גודל נקבוביות 0.22um | Sarstedt | 83.1826.001 | |
| סרום סוסים | Gibco | 16050-122 | |
| אינסולין רקומביננטי אנושי | סיגמא - Aldrich | 91077C | תמיסת מלאי היא פי 100 ומיוצרת על ידי המסת 1 מ"ג של אינסולין רקומביננטי אנושי ב-1 מ"ל של DMEM ו-1 & מיקרו; L של NaOH 10N. הפתרון מסונן ומאוחסן כ-1 מ"ל ב-4° |
| C תוכנת רכישת תמונה | Olympus | cellSens Dimension | |
| תוכנת עיבוד תמונה | המכונים הלאומיים לבריאות | ImageJ | |
| תנור איזוטמפ | תרמו פישר סיינטיפיק | 201 | |
| מיקרוסקופ | אולימפוס | IX83 | |
| מיקרוסקופ - תושבת מצלמה | Labcam | Labcam לאייפון | הוזמן מאמזון |
| פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| מזרקים חד פעמיים מפלסטיק, 1 סמ"ק | BD | 2606-309659 | |
| מזרקים חד פעמיים מפלסטיק, 50 סמ"ק | BD | 2612-309653 | |
| פלורוניק F-127, אבקה, BioReagent | Sigma - Aldrich | P2443-250G | תמיסת מלאי של 5% של חומצה פלורונית מיוצרת על ידי המסת 5 גרם אבקת חומצה פלורונית ב-100 מ"ל מים צוננים, אוטוקלאבים ומזוקקים. התמיסה מסוננת בוואקום ו-10 מ"ל מאחסנים ב-4° C |
| Polydimethylsiloxane (ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184) | Dow | 4019862 | זמינות גם ב-Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich וכו'. |
| עובש שלילי פוליאוריטן | בבית | ||
| סוכן שחרור | Mann Release Technologies | 200 | |
| משאבת ואקום שבשבת סיבובית | אדוארדס | A65401906 | |
| אזמל | אלמדיק, Medstore, אוניברסיטת טורונטו | 2586-M36-0100 | |
| סכין גילוח קצה יחיד | VWR | 55411-050 | |
| תאי שריר שלד בזאליים | פרומוסל | C-23260 | 30 מ"ל אליציטוטים נוצרים ומאוחסנים ב-4 מעלות צלזיוס. |
| מדיום צמיחת תאי שריר שלד (מוכן לשימוש) | Promocell | C-23060 | 42 מ"ל אליקוטים נוצרים ומאוחסנים ב-4°C. |
| סמארטפון (iPhone) | Apple | SE | |
| Standard Duty משאבת ואקום יבשה | Welch | 2546B-01 | |
| שקית עיקור | Alliance | 211-SCM2 | |
| Thimble | Igege | הוזמן מאמזון | |
| תרומבין מפלזמה אנושית | סיגמא - Aldrich | T6884-250UN | 100 יחידות טרומבין מומסות ב-1 מ"ל של תמיסת BSA של 0.1%. 10 ומיקרו; L aliquots מוכנים ומאוחסנים בטמפרטורה של - 20 מעלות צלזיוס. |
| חוט נחושת מצופה פח | Arco | B8871K48 | הוזמן מאמזון |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| Trypsin-EDTA, 0.25% | Thermo FIsher Scientific | 25200072 | |
| תא ואקום 2 | SP Bel-Art | F42027-0000 |
מקורות
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal Muscle: A brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. Animal models of Duchenne muscular....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
