Method Article

הדמיה בזמן לשגות של arborization עצבי באמצעות תיוג וירוסים דליל אדנו הקשורים של אוכלוסיות תאי רשתית ממוקדים גנטית

DOI:

10.3791/62308

⸱

March 19th, 2021

 , 
1Program for Neuroscience and Mental Health, Hospital for Sick Children, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מציגים שיטה לחקירת מורפוגנזה נויריט ברשתית לאחר הלידה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות זמן. אנו מתארים גישה לתיוג דליל ורכישה של סוגי תאי רשתית ותהליכים עדינים שלהם באמצעות וקטורים וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גילוי מנגנונים שמעצבים ארבורים דנדריטיים דורש שיטות להמחשה, דימוי וניתוח דנדריטים במהלך הפיתוח. רשתית העכבר היא מערכת מודל רבת עוצמה לחקירה של מנגנונים ספציפיים לסוג התא של מורפוגנזה עצבית וקישוריות. הארגון וההרכב של תת-סוגים ברשתית מוגדרים היטב, וכלים גנטיים זמינים כדי לגשת לסוגים ספציפיים במהלך הפיתוח. סוגי תאי רשתית רבים מגבילים גם את הדנדריטים ו/או האקסונים שלהם לשכבות צרות, מה שמאפשר הדמיה בזמן לשגות. תרביות רשתית העכבר מתאימות היטב להדמיית תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מולטיפוטונית, אך חסרות שיטות המותאמות לדינמיקת דנדריט הדמיה עם רזולוציה זמנית ומבנית. מוצג כאן היא שיטה לתייג ולדמיין בדלילות את ההתפתחות של אוכלוסיות רשתית ספציפיות המסומנות על ידי מערכת Cre-Lox. וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) הזמינים מסחרית המשמשים כאן מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre- תלוי. משלוח תוך עיני של AAVs בעכברים יילודים מייצר תיוג פלואורסצנטי של סוגי תאים ממוקדים על ידי 4-5 ימים לאחר ההזרקה (dpi). אותות פלואורסצנטיים ממברנה ניתנים לזיהוי על ידי הדמיה קונפוקלית ולפתור מבני ענף עדינים ודינמיקה. קטעי וידאו באיכות גבוהה המשתרעים על פני 2-4 שעות נרכשים מהדמיית רשתית שטוחה-תושבות עם נוזל שדרתי מלאכותי מחומצן (aCSF). כמו כן מסופק צינור לאחר עיבוד תמונה עבור deconvolution ותיקון סחיפה תלת מימדי (3D). פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללכוד כמה התנהגויות תאיות ברשתית שלמה ולזהות גורמים חדשניים השולטים מורפוגנזה neurite. אסטרטגיות התפתחותיות רבות הנלמדות ברשתית יהיו רלוונטיות להבנת היווצרות מעגלים עצביים במקומות אחרים במערכת העצבים המרכזית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

דנדריטים של נוירונים ברשתית יוצרים דפוסים מורכבים, אך ספציפיים, המשפיעים על תפקידם בתוך מעגלים עצביים. ברשתית החולייתנית, סוגים מגוונים של תאי גנגליון רשתית (RGCs) ואינטראורונים תא amacrine נושאים מורפולוגיות דנדריטיות ייחודיות השונות בגודל ארבור, מיקום, אורך ענף, וצפיפות1. במהלך התפתחות לאחר הלידה, RGCs ותאי amacrine להרחיב תהליכים דנדריטיים תוססים לתוך נוירופיל הנקרא שכבת plexiform הפנימית (IPL), שם הם מקבלים קלט תא דו קוטבי המשדר אותות photoreceptor2. כפי שנתפס על ידי הדמיה בזמן-לשגות של אוכלוסיות רשתית שכותרתו פלואורסצנטית בזחלי אפרוחים או דגי זברה, מורפוגנזה דנדריט הוא דינמי מאוד 3,4,5

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערה: פרוטוקול זה משתרע על פני יומיים עם פרק זמן מינימלי של 4-5 ימים להעברה ויראלית בין ימי ניסוי (איור 1A). ניסויים בבעלי חיים מבוצעים בהתאם להנחיות המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים לשימוש בבעלי חיים במחקר וטיפול בבעלי חיים במעבדה תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי המעבדה לשירותים לבעלי חיים שימוש וטיפול בבעלי חיים הוועדה בבית החולים לילדים חולים (טורונטו, קנדה).

1. הכנות לזריקות AAV יילודים וניסויי הדמיה

  1. בחר קו עכבר Cre כדי לתייג את אוכלוסיות תאי הרשתית של עניין. אשר ביטוי רקומבינאז Cre בזמן זריקות AAV על ידי מעבר לכתב מהונדס Cre או באמצעות חיסונים עם נוגדן Cre.
  2. לגדל עכברי Cre מהונדסים (בני 8-16 ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

באמצעות הפרוטוקול לעיל, וידאו 3D ברזולוציה גבוהה של דנדריטים תאים starburst פיתוח נרכש, פירוק, ותיקן עבור סחיפה 3D. הקרנות מקסימליות של מטוס Z הופקו כדי ליצור סרטוני דו-ממד לניתוח (סרטון משלים 1, איור 5A). פירוק תלת-ממדי של כל נקודת זמן הגביר את הרזולוציה של תחזיות פילופודיה עדינות (איור 5B, C). בליטות פילופודיה עדינות הן תכונה של פיתוח דנדריטים רשתית36 , צריך להיות גלוי במהלך הדמיה. טרנספקטיה AAV תיצור ש.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

וידאו זה מדגים צינור ניסיוני המשתמש בכלים גנטיים קיימים כדי לדמיין דינמיקה של דנדריט של פיתוח נוירונים ברשתית עם הדמיה חיה קונפוקלית. כמו כן הוכחו זריקות תוך עיניות של AAVs תלויי Cre קידוד חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה לעכברים יילודים. תאים בודדים של אוכלוסיות ממוקדות גנטית מסומנים בבהירות כבר 4-5 dpi. הרכבות שטוחות ברשתית הוכנו לתאי הדמיה סטנדרטיים כדי לבצע הדמיה קונפוקלית של תאים חיים. שיטה זו מייצרת קטעי וידאו ברזולוציה גבוהה של זמן לשגות של תאים בודדים ואת התחזיות העדינות שלהם. תחזיות קטנות נפתרות ומכמתות באמצע.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים למדיסון גריי על שעזרה לי כשלא היה לי. מחקר זה נתמך על ידי מענק גילוי NSERC (RGPIN-2016-06128), מלגת סלואן במדעי המוח ויו"ר מחקר קנדה רובד 2 (ל- J.L.L. ). ס. אינג-אסטבס נתמך על ידי תוכנית המחקר למדעי הראייה ומלגות לתואר שני של NSERC- דוקטורט.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Addgene הכנה ויראלית #45185-AAV9
Addgene הכנה ויראלית #45186-AAV9
כלי דיסקציה
נייר סינון תאיתWhatman1001-070
Dumont #5 מלקחיים עדיניםFST11252-20נדרשים שני מלקחיים של Dumont #5 למיקרו-דיסקציה של הרשתית
מלקחיים DumontVWR82027-426
מספריים עדיניםFST14058-09
ניירות סינון מעורב של קרום אסתר תאית (MCE), הידרופילי, 0.45 ומיקרו; m גודל נקבוביותMilliporeHABG01 300
צלחת פטרי, 50 ופעמים; 15 מ"מVWR470313-352
פיפטת העברה חד פעמית מפוליאתילןVWR470225-034
מברשת צבע עם קצה עגול, גודל 3/0ציוד אמנות קונבנציונליתשתי מברשות צבע בגודל 3/0 (או קטנות יותר) נדרשות למספריים כירורגיות להרכבה שטוחה ברשתית
FST14007-14
Vannas מספריים קפיציים - 2.5 מ"מ קצה חיתוךFST15000-08
<חזק>מערכת דגירה הדמיה חיהצינורות פוליאתילן חזקים>
קאמרית, PE-160 10'WarnerInstruments64-0755
בקר חימום דו-ערוצי, דגם TC-344CWarner Instruments64-2401
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR מטרת טבילה אובייקטיביתLeica15506374
כבל בקר מחמםWarner InstrumentsCC-28
תא דגירה גדול לאמבטיה עם תמיכת פרוסותWarner InstrumentsRC-27L
MPII משאבה מיני-פריסטלטיתמכשיר הרווארד70-2027
PM-6D פלטפורמה מחוממת מגנטית (מחמם תא דגירה)Warner InstrumentsPM-6D
חתיכות צינורות ראש משאבה למשאבה מיני-פריסטלטית MPIIמכשיר הרווארד55-4148
עוגן לדוגמא (נבלים)Warner Instruments64-0260עוגן לדוגמא חייב להיות תואם לתא הדגירה
Sloflo מחמם תמיסה בשורהWarner InstrumentsSF-28
<זריקות חזקות>יילודים
10 ומיקרו; מזרק L מיקרוליטר סדרה 700, מחט נשלפתHamilton Company80314
30 גרם מחטים היפודרמיות (0.5 אינץ')BD PrecisionGlide305106
נימי זכוכית דקים 4 אינץ', ללא נימה (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ/0.75 מ"מ) WPI World Precision InstrumentsTW100-4
אתנול 99.8% (לדילול ל-70% במים מזוקקים כפולים [ddH2O])סיגמא-אולדריץ'V001229 
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYFפן וקטור ליבהAV-9-PV2453Addgene פלסמיד #45185 
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP
1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF		פן וקטור ליבתAV-9-PV2454Addgene פלסמיד #45186
ChAT-IRES-Cre קו עכבר טרנסגנימעבדת ג'קסון6410
תוכן צבע FCF ירוק מהיר ≥ 85%Sigma-AldrichF7252-25G
חולץ מיקרופיפטות בוער/חום, דגם P-97Sutter Instrument Co.P-97
משחת קעקועים ירוקהKetchum MFG Co329A
מי מלח חוצץ פוספט, pH 7.4, נוזלי, מסונן סטרילי, מתאים לתרבית תאיםSigma-Aldrich806552
Pneumatic PicoPumpWPI World Precision InstrumentsPV-820
<חזק>נוזל מוחי עורקי מחומצן (aCSF) ריאגנטים
סידן כלוריד דיהידראט (CaCl2· 2H2O)Sigma-AldrichC7902
קרבוגן (5% CO2, 95% O2)ספק X02OX95C2003102 AirGasעשוי להשתנות בהתאם לאזור
D-(+)-גלוקוזסיגמא-אולדריץ'G7021
HEPES, חומצה חופשיתBio BasicHB0264
תמיסת חומצה הידרוכלורית, 1 NSigma-AldrichH9892
מגנזיום כלוריד הקסהידרט (MgCl2· 6H2O)Sigma-AldrichM2670
(6.0-7.7)VWRBDH35317.604
אשלגן כלורי (KCl)Sigma-AldrichP9541
נתרן כלורי (NaCl)Bio BasicDB0483
נתרן פוספט מונו-בסיסי (NaH2PO4)Sigma-AldrichRDD007
Software
ImageJהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH)קוד
חנות רצועות בדיקת pH של פתוח

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lefebvre, J. L., Sanes, J. R., Kay, J. N. Development of dendritic form and function. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 31, 741-777 (2015).
  2. Graham, H. K., Duan, X. Molecular mechanisms regulating synapt....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Neuronal ArborizationTime Lapse ImagingRetinal Cell PopulationsAdeno Associated VirusSparse LabelingConfocal MicroscopyCre Lox SystemDendrite DynamicsRetinal Flat Mount3D Deconvolution

Related Articles