תאי גזע גליומה (GSCs) הם חלק קטן של תאים סרטניים הממלאים תפקידים חיוניים בייזום גידולים, אנגיוגנזה ועמידות לתרופות בגליובלסטומה (GBM), הגידול המוחי העיקרי הנפוץ וההרסני ביותר. הנוכחות של GSCs עושה את GBM עקשן מאוד לרוב סוכנים ממוקדים בודדים, ולכן שיטות סינון תפוקה גבוהה נדרשים לזהות טיפולי שילוב יעילים פוטנציאליים. הפרוטוקול מתאר זרימת עבודה פשוטה כדי לאפשר סינון מהיר לטיפול משולב פוטנציאלי עם אינטראקציה סינרגטי. השלבים הכלליים של זרימת עבודה זו מורכבים הקמת GSCs מתויג לוציפראז, הכנת לוחות מצופים מטריג'ל, הקרנת סמים משולבת, ניתוח, ואימות התוצאות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
זרימת עבודה מהירה של סינון לזיהוי טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות תאי גזע גליומה שמקורם במטופל
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי גזע גליומה (GSCs) הם חלק קטן של תאים סרטניים הממלאים תפקידים חיוניים בייזום גידולים, אנגיוגנזה ועמידות לתרופות בגליובלסטומה (GBM), הגידול המוחי העיקרי הנפוץ וההרסני ביותר. הנוכחות של GSCs עושה את GBM עקשן מאוד לרוב סוכנים ממוקדים בודדים, ולכן שיטות סינון תפוקה גבוהה נדרשים לזהות טיפולי שילוב יעילים פוטנציאליים. הפרוטוקול מתאר זרימת עבודה פשוטה כדי לאפשר סינון מהיר לטיפול משולב פוטנציאלי עם אינטראקציה סינרגטי. השלבים הכלליים של זרימת עבודה זו מורכבים הקמת GSCs מתויג לוציפראז, הכנת לוחות מצופים מטריג'ל, הקרנת סמים משולבת, ניתוח, ואימות התוצאות.
מבוא
גליובלסטומה (GBM) הוא הסוג הנפוץ והאגרסיבי ביותר של גידול ראשוני במוח. נכון לעכשיו, ההישרדות הכוללת של חולי GBM שקיבלו טיפול מקסימלי (שילוב של ניתוח, כימותרפיה והקרנות) עדיין קצרה מ -15 חודשים; אז טיפולים חדשניים ויעילים עבור GBM נדרשים בדחיפות.
נוכחותם של תאי גזע גליומה (GSCs) ב- GBM מהווה אתגר ניכר לטיפול הקונבנציונלי שכן תאים דמויי גזע אלה ממלאים תפקידי מפתח בשמירה על מיקרו-סביבה של גידול, עמידות לתרופות והישנות גידול1. לכן, מיקוד GSCs יכול להיות אסטרטגיה מבטיחה לטיפול GBM2. עם זאת, חיסרון משמעותי ליעילות התרופה ב- GBM הוא אופיה ההטרוגנטי, כולל אך לא רק ההבדל במוטציות גנטיות, תת-סוגים מעורב....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
דגימת GBM נרכשה ממטופל במהלך ניתוח שגרתי לאחר שקיבלה הסכמה מדעת מלאה על ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי של בית החולים המסונף הראשון של האוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג.
1. בידוד ותרבות של GSCs שמקורם בחולים
- מניחים רקמת גליובלסטומה טרייה שנקטפה בניתוח בצינור צנטריפוגה 15 מ"ל מלא PBS סטרילי ולאחסן את הרקמה על קרח עד לפעולה נוספת.
- טחון את רקמת GBM לכ 0.5 עד 1 מ"מ קוטר חתיכות באמצעות מספריים ביתור לשטוף את דגימות הרקמה עם מדיום בזאלי עצבי כדי להסיר פסולת הסלולר בארון בטיחות ביולוגית.
- לעכל את שברי הרקמה עם 1 מ"ג / מ"ל collagenase A ב 37 °C במשך 30 דקות צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (7 °F).
- ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
תאי XG387 יצרו נוירוספירות במדיום התרבותי המתואר בטבלה 1 בצלחת תרבות אולטרה-נמוכה של 6 בארות או בצלחת לא מצופה5 (איור 1A). ראשית, בוצעה בדיקה כדי לבדוק אם עוצמת הביו-אור מתאי XG387-Luc הייתה פרופורציונלית למספר התא. כפי שניתן לראות באיור 1B, עוצמת הביו-אור עלתה באופן פרופורציונלי לצפיפות התא והביאה לתיקון ליניארי ביניהם (Pearson r = 0.9872; p < 0.0001; איור 1C). מאז ביו-luminescence של תאי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
במחקר הנוכחי תואר פרוטוקול שניתן ליישם כדי לזהות טיפול משולב פוטנציאלי עבור GBM באמצעות GSCs שמקורם במטופל. שלא כמו המודל המדדי הסטנדרטי של סינרגיה/תוספות כגון Loewe, BLISS או HSA, נעשה שימוש בזרימת עבודה פשוטה ומהירה שאינה דורשת שילוב של זוג תרופות בריכוזים מרובים באופן פקטורלי מלא כשיטות המסורתיות. בתהליך עבודה זה, SI (אינדקס רגישות) שמקורו במחקר כדי להעריך את ההשפעה הרגישה של siRNAs בשילוב עם מעכב מולקולרי קטן הוצג לכמת את אפקט התרופה הסינרגיסטית של שני מעכבים מולקולריים קטנים7. טווח ערכי SI הו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין קונפליקטים לחשוף.
תודות
אנו מודים לקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81672962), לקרן תוכנית החדשנות המחוזית של ג'יאנגסו ולקרן פרויקט המפתח המשותף של אוניברסיטת דרום מזרח והאוניברסיטה הרפואית נאנג'ינג על תמיכתם.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| B-27 | Gibco | 17504-044 | 50X |
| EGF | Gibco | PHG0313 | 20 ננוגרם/מ"ל |
| FGF | Gibco | PHG0263 | 20 ננוגרם/מ"ל |
| Gluta Max | Gibco | 35050061 | 100X |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | 1X |
| פניצילין-סטרפטומיצין | HyClone | SV30010 | P: 10,000 יחידות/מ"ל ס: 10,000 ug/ml |
| נתרן פירובט | Gibco | 2088876 | 100 מ"מ |
| טבלה 1. ה ניסוח של GSC מדיום תרבית שלם. | |||
| ABT-737 | MCE | סלקטיבי וחיקוי BH3 BCL-2, BCL-xL ו BCL-w מעכב | |
| Adavosertib (MK-1775) | MCE | Wee1 מעכב | |
| Axitinib | MCE | מעכב טירוזין קינאז רב-ממוקד | |
| AZD5991 | MCE | Mcl-1 מעכב | |
| A 83-01 | MCE | מעכב חזק של TGF-ובטא; קולטן מסוג I ALK5 קינאז | |
| CGP57380 | סלק | פוטנט MNK1 מעכב | |
| Dactolisib (BEZ235) | Selleck | Dual ATP-competitive PI3K ו mTOR מעכב | |
| Dasatinib | MCE | Dual משפחת Bcr-Abl ו-Src טירוזין קינאז מעכב | |
| ארלוטיניב | MCE | EGFR מעכב טירוזין קינאז | |
| גפיטיניב | MCE | EGFR טירוזין קינאז מעכב | |
| Linifanib | MCE | מעכב רב-מטרתי של VEGFR ו PDGFR משפחה | |
| Masitinib | מעכב MCE | של c-Kit | |
| ML141 | Selleck | מעכב לא תחרותי של Cdc42 GTPase | |
| OSI-930 | MCE | מעכב רב-מטרתי של Kit, KDR ו-CSF-1R | |
| Palbociclib | MCE | סלקטיבי CDK4 ו CDK6 מעכב | |
| SB 202190 | MCE | סלקטיבי עמ' 38 מפת קינאסה מעכב | |
| ספנטרוניום ברומיד (YM-155) | MCE | Survivin מעכב | |
| TCS 359 | מעכב FLT3 חזק | של Selleck | |
| UMI-77 | MCE | סלקטיבי Mcl-1 מעכב | |
| 4-הידרוקסיטמוקסיפן (אפימוקסיפן ) | סלק | סלקטיבי קולטן אסטרוגן (ER) טבלת מודולטור | |
| 2. המידע של 20 סוכנים ממוקדים המשמשים במסך הבדיקה. כל אלה הם מעכבים מולקולריים קטנים סלקטיביים. הספק, השם והיעדים ניתנו בטבלה. |
מקורות
- Lathia, J. D., Mack, S. C., Mulkearns-Hubert, E. E., Valentim, C. L., Rich, J. N. Cancer stem cells in glioblastoma. Genes & Development. 29 (12), 1203-1217 (2015).
- Binello, E., Germano, I. M. Targeting glioma stem cells: a novel framework for brain tumors. Cancer Science. 102 ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
