עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות

Summary

במאמר זה אנו מתארים את ההליכים שפותחו במעבדה שלנו להכנת אבקות של גבישי מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים במיקרו-גבישים (MicroED).

Abstract

מתואר פרוטוקול מפורט להכנת דגימות מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים (MicroED). MicroED פותחה כדי לפתור מבנים של חלבונים ומולקולות קטנות באמצעות ציוד קריו-מיקרוסקופיית אלקטרונים סטנדרטית (cryo-EM). בדרך זו, מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים מסיסים וחלבוני ממברנה נקבעו לאחרונה לרזולוציות גבוהות. פרוטוקולים מוצגים כאן להכנת רשתות של תרופות מולקולות קטנות באמצעות התרופה carbamazepine כדוגמה. מוצגים פרוטוקולים לסינון ואיסוף נתונים. שלבים נוספים בתהליך הכולל, כגון שילוב נתונים, קביעת מבנה וחידוד מוצגים במקום אחר. הזמן הדרוש להכנת רשתות המולקולות הקטנות מוערך בפחות מ-30 דקות.

Introduction

עקיפה אלקטרונית מיקרוקריסטלית (MicroED) היא שיטת קריו-מיקרוסקופיית אלקטרונים (cryo-EM) לקביעת מבני רזולוציה אטומית מגבישים בגודל תת-מיקרומטרי ^1,2. גבישים מיושמים על רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת סטנדרטיות (TEM) ומוקפאים על ידי צלילה לתוך אתאן נוזלי או חנקן נוזלי. לאחר מכן נטענות רשתות לתוך TEM הפועל בטמפרטורות קריוגניות. הגבישים ממוקמים על הרשת ומוקרנים לאיכות עקיפה ראשונית. סיבוב רציף נתוני MicroED נאספים מתת-קבוצה של הגבישים המוקרנים, כאשר הנתונים נשמרים באמצעות מצלמה מהירה כסרט³. סרטים אלה מומרים לפורמט קריסטלוגרפי סטנדרטי ומעובדים באופן כמעט זהה לניסוי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן⁴.

MicroED פותחה במקור כדי לחקור מיקרו-גבישים חלבוניים ^1,2. צוואר בקבוק בקריסטלוגרפיה של חלבונים הוא גידול גבישים גדולים ומסודרים היטב עבור ניסויי עקיפה מסורתיים של קרני רנטגן סינכרוטרון. מכיוון שאלקטרונים מתקשרים עם חומר בסדרי גודל חזקים יותר מקרני רנטגן, מגבלות גודל הגביש הדרושות ליצירת עקיפה ניתנת לגילוי קטנות בהרבה⁵. בנוסף, היחס בין אירועי פיזור אלסטיים לבלתי אלסטיים הוא חיובי יותר עבור אלקטרונים, מה שמרמז על כך שניתן לאסוף נתונים שימושיים יותר עם חשיפה כוללת קטנה יותר⁵. התפתחויות בלתי פוסקות אפשרו איסוף נתוני MicroED מהמיקרו-גבישים המאתגרים ביותר 6,7,8,9.

לאחרונה, MicroED הוכח ככלי רב עוצמה לקביעת המבנים של תרופות מולקולות קטנות מחומרים אמורפיים לכאורה ^10,11,12,13. אבקות אלה יכולות להגיע היישר מבקבוק של מגיב קנוי, עמוד טיהור, או אפילו מריסוק גלולה לאבקה דקה¹⁰. אבקות אלה נראות אמורפיות בעין, אך עשויות להיות מורכבות לחלוטין מננו-גבישים או פשוט מכילות כמויות זעירות של משקעים ננו-גבישיים בחלק גדול יותר שאינו גבישי, אמורפי. היישום של החומר ברשת הוא קל, והשלבים הבאים של זיהוי, סינון ואיסוף נתונים עשויים אפילו להיות אוטומטיים בעתיד הקרוב¹⁴. בעוד שאחרים עשויים להשתמש בשיטות שונות להכנת דגימות ואיסוף נתונים, כאן מפורטים הפרוטוקולים שפותחו ושימשו במעבדת גונן להכנת דגימות של מולקולות קטנות עבור MicroED ואיסוף נתונים.

Protocol

1. הכנת דגימות מולקולות קטנות

1. העבירו כמות קטנה (0.01 - 1 מ"ג) של אבקה, נוזל או מוצקים לבקבוקון קטן או לצינור.
2. עבור דגימות שכבר נמצאות בצורת אבקה, אטמו את הצינורית באמצעות המכסה עד שיהיה צורך בדגימה. יבשו את דגימות הנוזלים לאבקות לפני ניסיונות בשיטה 1 (שלב 3) או 2 (שלב 4).
   הערה: דגימות מומסות בנוזל עשויות להשתמש בשיטה 3 (5.X) להלן

2. הכנת רשתות TEM

הערה: רכיבי TEM מסוימים עם מערכות טוען אוטומטי דורשים לגזור את הרשתות ולהכניס אותן לקלטת לפני הטעינה לעמודה TEM. חיתוך כרוך באבטחה פיזית של רשת TEM 3 מ"מ לתוך טבעת מתכת כי autoloader יכול לתפעל. שלב זה והשלבים הבאים יכולים להתבצע באמצעות רשתות TEM רגילות, או רשתות TEM שנחתכו. עבור ניסויים אלה, לעתים קרובות קל יותר לתפעל את הרשתות אם הן נחתכו מראש.

1. עטפו סרט פלסטיק סביב קצה אחד של שקופית כיסוי זכוכית.
2. הניחו את רשתות ה-TEM על סרט הצילום בחלק העליון של שקופית הכיסוי כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה. זהה את שני צידי הרשת תחת אור. צד הנחושת זוהר ונראה מתכתי, ואילו צד הפחמן נראה בצבע חום אפרורי (איור 1C,D). עבור רשתות חתוכות, צד הפחמן צריך לפנות למשטח השטוח של טבעת הקליפ.
3. מקם את השקופית עם הרשתות בתא הפריקה הזוהר. זוהר פורק את הכיסוי למשך כ- 30 שניות באמצעות ההגדרה השלילית ב- 15 pA. אחסנו את הרשתות על שקופית הכיסוי בתוך צלחת פטרי מזכוכית מרופדת בנייר סינון לפני הוספת דוגמה לרשתות.

3. מריחת דגימה על רשתות על ידי יצירת אבקה עדינה הומוגנית (שיטה 1)

1. הסר רשת TEM משוחררת זוהרת מצלחת הפטרי המכוסה באמצעות פינצטה. הניחו את הרשת על נייר מסנן עגול כשצד הפחמן פונה כלפי מעלה.
2. בעזרת מרית קטנה, מוציאים כף מדידה קטנה מאוד של אבקה (כ-0.1 מ"ג) ומניחים אותה על מכסה זכוכית קטן ומרובע ממש ליד רשת TEM על נייר הסינון. מניחים עוד מגלשת זכוכית מרובעת קטנה או מכסה על גבי האבקה.
3. בעזרת האצבעות, שפשפו בעדינות את שתי מגלשות הזכוכית זו בזו ליצירת אבקה דקה.
4. סובבו את החלקות הכיסויים בזווית ומקמו אותן ממש מעל רשת ה-TEM על נייר הסינון והמשיכו לשפשף את הכיסויים זה בזה, רק כמה סנטימטרים מעל רשת ה-TEM המשוחררת הזוהרת (איור 1).
5. התבונן כדי לראות אם האבקה נופלת לכיוון הרשת. חשוף את האבקה הטחונה דק על ידי הסרת אחד משני כיסויי הזכוכית. הברישו בעדינות את האבקה העדינה מהמכסה באמצעות פיסת נייר סינון לרשת TEM (איור 1).

4. החלת דגימה על רשתות על ידי יישום שיטת "טלטול" (שיטה 2)

1. תפוס רשת באמצעות זוג פינצטה ושחרר אותה לתוך בקבוקון או שפופרת של דגימת אבקה. סגרו את הבקבוקון באמצעות מכסה הפלסטיק כדי להבטיח שאף חומר לא יברח בעת טלטול.
2. תופסים את הבקבוקון ביד, מנערים את הבקבוקון כך שהאבקה והרשת נעות שתיהן במשך כ 10 - 30 שניות.
3. רוקנו את תכולת הבקבוקון על נייר סינון עגול. תופס את הרשת בקצה, מקיש בעדינות על קצה הרשת על נייר הסינון כדי להסיר חומר עודף מהרשת.
   הערה: בהתאם לסוג הבקבוקון ולגודלו, ניתן גם להשתמש בפינצטה כדי להסיר את רשת TEM מבלי לרוקן את התוכן.

5. החלת דגימה על רשתות בשיטת האידוי (שיטה 3)

1. הניחו רשת (חתוכה או לא) על מרכזה של פיסת נייר פילטר עגולה, כאשר צד הפחמן פונה כלפי מעלה וצד הנחושת פונה כלפי מטה.
2. בעזרת מזרק אטום לגז בגודל 10 μL, יש למרוח טיפה קטנה (בערך 1-3 מיקרוליטר) של תרכובת מומסת על צד הפחמן של הרשת.
3. העבירו בעדינות את נייר הסינון עם הרשתות לתוך תא ייבוש ואקום. מכסים את החדר ומדליקים את הוואקום. השאירו את הרשתות תחת ואקום לייבוש עד יום אחד.
4. כבו את השואב ואפשרו לתא להתאוורר למשך 5 דקות. אוורור התא מונע מהרשתות לזוז או לעוף כאשר הוא חשוף.

6. הקפאה וטעינה של רשתות לתוך TEM

1. תפוס את קצה רשת TEM באמצעות קבוצה של פינצטה, וודא שהקצוות אינם מנקבים אף אחד מריבועי הרשת. הרם את הרשת 1-2 ס"מ מעל נייר הסינון וסובב את הרשת בזווית של 90° לנייר שמתחת. טפחו בעדינות על הפינצטה תוך שמירה על הפינצטה הדוקה ברשת כדי להסיר אבקה רופפת.
2. מקפיאים את הרשת על ידי הזזת קצה הפינצטה עם הרשת ישירות לתוך מיכל חנקן נוזלי ביד. מיכל זה הוא בדרך כלל תחנת טעינת הרשת עבור TEM, אך יכול להיות כל מיכל בטוח, כגון תרמוס בטוח לחנקן נוזלי, מקובל להעברה או אחסון. חנקן נוזלי הוא -196 °C.
3. חכו עד שהרשת והפינצטה יפסיקו לרתוח לפני מניפולציות נוספות.
4. תחת חנקן נוזלי או באדי חנקן, הניחו את הרשת במחזיק הדגימה עם כיוון צד הפחמן, כך שהדגימה תיפגע על ידי הקרן לפני סרט התמיכה בפחמן.
5. טען את מחזיק הדגימה לתוך TEM כדי להבטיח שהרשת נשמרת בטמפרטורות חנקן נוזלי בכל עת.
   1. עבור מערכות טוען אוטומטי, מקם את הרשתות החתוכות לתוך קלטת במיכל מקורר חנקן נוזלי. קלטת זו מועברת למיכל תריס המאפשר לרובוטיקה של המעמיס האוטומטי לקבל את הקלטת תוך שמירה על הדגימות בטוחות למעבר בין הטוען האוטומטי לעמודה.
   2. עבור הגדרות TEM לכניסה צדדית, אבטח את הרשת למחזיק TEM מסחרי בכניסה צדדית. למחזיקים אלה יש מיכל להכנת דגימה המלא בחנקן נוזלי כדי לאפשר העברת הרשת למחזיק מבלי לחמם את הדגימה. מחזיק הכניסה הצדדית מוכנס ל- TEM ישירות עם הדגימה המאובטחת בסוף.

7. איסוף נתוני MicroED

1. איתור וסינון ננו-גבישים
   1. פתח את שסתומי העמודה TEM. התאימו את ההגדלה באמצעות לוחות היד להגדלה הנמוכה ביותר האפשרית. מצא את הקרן על ידי התאמת ידית העוצמה בלוחות היד כך שאזור עגול ובהיר ייראה על מסך הפלואורסצנט.
   2. קח אטלס של כל הרשת בהגדלה נמוכה (50 - 300x) באמצעות תוכנה מתאימה^14,15,16 (איור 2). ודא שהמיקרוסקופ מיושר היטב להדמיית הגדלה נמוכה וגבוהה לפני איסוף נתוני MicroED ברזולוציה גבוהה.
   3. זהו ריבועי רשת ללא פחמן שבור, ויש להם חומר/גרגרים שחורים או כהים גלויים על היריעה (איור 2). נווטו ברחבי הרשת, בין אם באמצעות הג'ויסטיק שעל לוחות היד, או באופן וירטואלי באטלס שנאסף, על מנת לחפש ריבועי רשת שאינם שבורים ומכילים מיקרו-גבישים.
   4. הוסף את המרכז של כל אחד מהריבועים הללו לרשימת מיקומי הרשת לצורך בדיקה. ניתן להוסיף מיקומים אלה למחשב נייד, בממשק המשתמש של המיקרוסקופ או בתוכנה לאוטומציה של מיקרוסקופ.
   5. הגדל את ההגדלה ל- 500-1,300x והתאם את הגובה האוצנטרי בכל מיקום רשת מאוחסן ועדכן את ערך Z שנשמר למיקומים שצוינו ב- 7.1.4.
   6. חפש במסך הפלואורסצנטי או במצלמה מהירה בהגדלה גבוהה זו אחר כתמים שחורים/גרגרים קטנים על הרשת. מדגם טוב עם לעתים קרובות יש קצוות חדים בהגדלה גבוהה, מה שמרמז על סדר גבישי.
   7. הזז גביש פוטנציאלי ממוקם למרכז המסך והגדל את ההגדלה כך שה- TEM ייכנס למצב הגדלה גבוהה.
      הערה: מצב זה מכונה מצב הגדלה גבוהה, Zoom2 או SA במכשירים שונים ובדרך כלל מתאים להגדלות של פי 3,000 ומעלה.
   8. הוספת מפתח צמצם של אזור שנבחר. שנו את הצמצם לגודל גדול או קטן יותר כדי להבטיח שהאזור שנבחר פשוט גדול יותר מהגביש (איור 3).
   9. עבור למצב עקיפה על ידי לחיצה על לחצן העקיפה בלוחות היד של TEM, וודא שמסך הפלואורסצנט מוכנס. כוונן את אורך המצלמה באמצעות ידית ההגדלה כך שהקצה יהיה ברזולוציה של 1 Å לפחות.
      הערה: כיול אורכי העקיפה צריך להתבצע על ידי מהנדס שירות באמצעות סורג וופל זהב או דגימה ידועה לפני ניסיון ניסויי MicroED.
   10. התאימו את מוקד העקיפה כך שהנקודה המרכזית תהיה חדה וקטנה ככל האפשר. באמצעות ידיות היסט העקיפה, הזז את הקרן המרכזית למרכז המסך הפלואורסצנטי
   11. הכנס את מעצור הקרן וודא שהקרן נמצאת מאחוריה. הרם את מסך הפלואורסצנט. בצעו חשיפה קצרה (כשנייה אחת) במצלמה (איור 4).
   12. בדוק את דפוס העקיפה המתאים. מועמד טוב לאיסוף מערך נתונים מלא יהיה בעל נקודות חדות המסודרות באופן קבוע בעמודות ובשורות, והעקיפה תתרחב מעבר ל-2 Å, רצוי לפחות עד 1 Å (איור 4). שמור את קואורדינטות הגביש בממשק המשתמש של TEM או על-ידי כתיבתן.
   13. בדיקת עקיפה חוזרת עבור כל הגבישים הפוטנציאליים המעניינים בריבוע הרשת הנוכחי.
2. איסוף נתונים
   1. מרכז גביש מוקרן על המסך בהגדלה גבוהה (> פי 1,000). כוונן את הגובה האוצנטרי של הגביש באמצעות שגרה אוטומטית או ידנית.
   2. הכנס את מפתח הצמצם שנבחר המתאים ביותר לגודל ולצורה של הגביש כפי שנקבע ב- 7.1.8 (איור 3). הטו את הבמה בכיוון השלילי והחיובי עד שהתמונה תוסתר על-ידי פסי הרשת (איור 3). שים לב לזוויות אלה למטרות איסוף נתונים.
   3. קבע את מספר המסגרות שיידרשו כדי לפרוס את הטריז הזוויתי הכולל של ערכת הנתונים. אופייני להשתמש בטריזים של 0.5 - 1.0 ° עבור כל פריים, כאשר הפריימים נקראים כל 1 עד 5 שניות בהתאם לרגישות המצלמה. לדוגמה, טריז המשתרע בין -30° ל- +30°, המסתובב בקצב קבוע של 1° ^s-1 עם מסגרת המוקראת, כל 1 שניות, ידרוש 60 מסגרות בסך הכל.
   4. בהתחשב בטווח ההטיה הכולל המרבי של -72° עד +72°, התחל לסובב את הבמה בקצב קבוע של 1° ^s-1 ולאחר מכן התחל לקרוא את הנתונים כל 1s במצלמה מודרנית עם מצב קריאת תריס מתגלגל (סרט 1). תהליך זה יכול להתבצע באופן ידני או באמצעות תוכנה ספציפית TEM.
      1. הגדר את קצב הסיבוב על ידי ציון % ממהירות ההטיה המרבית ומתי לעצור בממשק המשתמש של המיקרוסקופ או בתוכנה ייעודית. בחקירה זו, זה נמדד להיות 0.3° ^s-1 עבור כל % של מהירות מקסימלית, אבל יהיה צורך לאמת באופן עצמאי עבור כל מיקרוסקופ.
         הערה: איסוף נתוני ההטיה והמצלמה מוגדרים כאן באופן עצמאי, אך תוכנות¹⁴ יכולות לתאם זאת כדי לפשט את התהליך.
      2. יש להשליך כ-1° מכל צד של הטריז שצוין ברוב המקרים כזמן מת, שבו השלב עולה או מאט למהירות הסיבוב הרצויה.
   5. שמור נתונים במגוון תבניות כמסגרות נפרדות או כערימת תמונות (סרט 1).
   6. המר מסגרות עקיפה אלה לפורמט קריסטלוגרפי טיפוסי באמצעות כלי MicroED -זמין כאן (https://cryoem.ucla.edu). תמונות עקיפה הנשמרות בפורמט SMV מעובדות בקלות באמצעות תוכנה קריסטלוגרפית מתועדת^17,18.

Results

MicroED היא שיטת cryoEM הממנפת את האינטראקציות החזקות בין אלקטרונים לחומר, המאפשרת חקירה של גבישים קטנים נעלמים^12,13. לאחר שלבים אלה, צפוי להיות סרט עקיפה בפורמט קריסטלוגרפי שנאסף ממיקרו-גבישים (סרט 1). כאן, הטכניקה מודגמת באמצעות carbamazepine¹². התוצאות מראות מערך נתונים MicroED של סיבוב רציף ממיקרו-גביש קרבמזפינים שזוהה ברשת TEM (סרט 1). למערך נתונים טוב יש נקודות חזקות וברורות שאינן נמרחות או מפוצלות, ...

Discussion

הכנת דגימה היא בדרך כלל תהליך איטרטיבי, שבו אופטימיזציות נעשות לאחר מפגשים של סינון ואיסוף נתונים. עבור דגימות של מולקולות קטנות, לעתים קרובות זה נבון לנסות תחילה להכין את הרשת מבלי לפרוק זוהר ברשתות, שכן תרופות רבות נוטות להיות הידרופוביות^10,11. אם ברשתות יש מעט מדי משקעים ננו-גבישיים, כדאי לנסות שוב לאחר פריקת הזוהר הראשונה של הרשתות. ייתכן שהגבישים מאבקות ליופיליות גדולים ועבים מכדי לאסוף נתונים טובים. במקרים אלה, ייתכן שניתן יהיה לאסוף נתונים מקצה או מחלק דק ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1-1.5 מ"ל צינורות אפנדורף	פישר סיינטיפיק	14-282-300	כל בקבוקון או צינור יתאים.
מהדקי Autogrid	Thermo-Fisher	1036173	רשתות חתוכות אינן נדרשות עבור MicroED. הם נדרשים עבור Thermo-Fisher TEMs המצוידים במערכת טעינה אוטומטית.
טבעות C Autogrid	Thermo-Fisher	1036171
Carbamazapine	Sigma	C4024-1G	כל כמות תספיק לניסויים אלה
גלאי מבוסס CMOS	Thermo-Fisher	CetaD 16M	השתמשנו ב-CetaD 16M, אך כל גלאי עם מצב תריס מתגלגל או קריאה מהירה מספיק מקובל.
תוכנת Delphi	Thermo-Fisher	N/A	תוכנה במערכות Thermo-Fisher TEM המאפשרת סיבוב ידני של שלב הדגימה
תוכנת EPU-D	Thermo-Fisher	N/A	תוכנה מסחרית לרכישת נתוני MicroED
שקופיות כיסוי זכוכית	Hampton	HR3-231
Glow מפרק Pelco		easiGlow
High Precision פינצטה	EMS	78325-AC	כל פינצטה ברמת דיוק גבוהה תעשה
כלי חנקן נוזלי	Spear Lab	FD-800	כלי קצף סטנדרטי לטיפול בדגימות תחת חנקן נוזלי - 800 מ"ל
תוכנת SerialEM	UC Boulder	N/A	תוכנה חינמית המופצת על ידי D. Mastronarde. המחלקה לביולוגיה מולקולרית, תאית והתפתחותית
רשתות TEM	רשת Quantifoil/EMS		300 שימשו כאן, אך כל רשתות פחמן דקות יעבדו. עבור מולקולות קטנות אלה, אנו מציעים להתחיל עם פחמן רציף.
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)	Thermo-Fisher	Talos Arctica
Whatman נייר סינון עגול	Millipore-Sigma	WHA1001090	90 מ"מ ומעלה