Method Article

עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים של מולקולות קטנות

DOI:

10.3791/62313

⸱

March 15th, 2021

 , 
1Howard Hughes Medical Institute, University of California Los Angeles, 2Department of Biological Chemistry, University of California Los Angeles, 3Department of Physiology, University of California Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במאמר זה אנו מתארים את ההליכים שפותחו במעבדה שלנו להכנת אבקות של גבישי מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים במיקרו-גבישים (MicroED).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מתואר פרוטוקול מפורט להכנת דגימות מולקולות קטנות לניסויי עקיפה של אלקטרונים מיקרו-גבישיים (MicroED). MicroED פותחה כדי לפתור מבנים של חלבונים ומולקולות קטנות באמצעות ציוד קריו-מיקרוסקופיית אלקטרונים סטנדרטית (cryo-EM). בדרך זו, מולקולות קטנות, פפטידים, חלבונים מסיסים וחלבוני ממברנה נקבעו לאחרונה לרזולוציות גבוהות. פרוטוקולים מוצגים כאן להכנת רשתות של תרופות מולקולות קטנות באמצעות התרופה carbamazepine כדוגמה. מוצגים פרוטוקולים לסינון ואיסוף נתונים. שלבים נוספים בתהליך הכולל, כגון שילוב נתונים, קביעת מבנה וחידוד מוצגים במקום אחר. הזמן הדרוש להכנת רשתות המולקולות הקטנות מוערך בפחות מ-30 דקות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עקיפה אלקטרונית מיקרוקריסטלית (MicroED) היא שיטת קריו-מיקרוסקופיית אלקטרונים (cryo-EM) לקביעת מבני רזולוציה אטומית מגבישים בגודל תת-מיקרומטרי 1,2. גבישים מיושמים על רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת סטנדרטיות (TEM) ומוקפאים על ידי צלילה לתוך אתאן נוזלי או חנקן נוזלי. לאחר מכן נטענות רשתות לתוך TEM הפועל בטמפרטורות קריוגניות. הגבישים ממוקמים על הרשת ומוקרנים לאיכות עקיפה ראשונית. סיבוב רציף נתוני MicroED נאספים מתת-קבוצה של הגבישים המוקרנים, כאשר הנתונים נשמרים באמצעות מצלמה מהירה כסרט3. סרטים אלה מומרים לפורמט קריסטלוגרפי סטנדרטי ומעובדים באופן כמעט זהה לניסוי קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. הכנת דגימות מולקולות קטנות

  1. העבירו כמות קטנה (0.01 - 1 מ"ג) של אבקה, נוזל או מוצקים לבקבוקון קטן או לצינור.
  2. עבור דגימות שכבר נמצאות בצורת אבקה, אטמו את הצינורית באמצעות המכסה עד שיהיה צורך בדגימה. יבשו את דגימות הנוזלים לאבקות לפני ניסיונות בשיטה 1 (שלב 3) או 2 (שלב 4).
    הערה: דגימות מומסות בנוזל עשויות להשתמש בשיטה 3 (5.X) להלן

2. הכנת רשתות TEM

הערה: רכיבי TEM מסוימים עם מערכות טוען אוטומטי דורשים לגזור את הרשתות ולהכניס אותן לקלטת לפני הטעינה לעמודה TEM. חיתוך כרוך באבטחה פיזית של רשת TEM 3 מ"מ לתוך טבעת מתכת כי autoloader יכול לתפעל. שלב זה והשלבים הבאים יכולים להתבצע באמצעות רשתות....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MicroED היא שיטת cryoEM הממנפת את האינטראקציות החזקות בין אלקטרונים לחומר, המאפשרת חקירה של גבישים קטנים נעלמים12,13. לאחר שלבים אלה, צפוי להיות סרט עקיפה בפורמט קריסטלוגרפי שנאסף ממיקרו-גבישים (סרט 1). כאן, הטכניקה מודגמת באמצעות carbamazepine12. התוצאות מראות מערך נתונים MicroED של סיבוב רציף ממיקרו-גביש קרבמזפינים שזוהה ברשת TEM (סרט 1). למערך נתונים טוב יש נקודות חזקות וברורות שאינן נמרחות או מפוצלות, .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת דגימה היא בדרך כלל תהליך איטרטיבי, שבו אופטימיזציות נעשות לאחר מפגשים של סינון ואיסוף נתונים. עבור דגימות של מולקולות קטנות, לעתים קרובות זה נבון לנסות תחילה להכין את הרשת מבלי לפרוק זוהר ברשתות, שכן תרופות רבות נוטות להיות הידרופוביות10,11. אם ברשתות יש מעט מדי משקעים ננו-גבישיים, כדאי לנסות שוב לאחר פריקת הזוהר הראשונה של הרשתות. ייתכן שהגבישים מאבקות ליופיליות גדולים ועבים מכדי לאסוף נתונים טובים. במקרים אלה, ייתכן שניתן יהיה לאסוף נתונים מקצה או מחלק דק .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעבדת גונן נתמכת על ידי כספי המכון הרפואי הווארד יוז. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות P41GM136508.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.1-1.5 מ"ל צינורות אפנדורףפישר סיינטיפיק14-282-300כל בקבוקון או צינור יתאים.
מהדקי AutogridThermo-Fisher1036173רשתות חתוכות אינן נדרשות עבור MicroED. הם נדרשים עבור Thermo-Fisher TEMs המצוידים במערכת טעינה אוטומטית.
טבעות C AutogridThermo-Fisher1036171
CarbamazapineSigmaC4024-1Gכל כמות תספיק לניסויים אלה
גלאי מבוסס CMOSThermo-FisherCetaD 16Mהשתמשנו ב-CetaD 16M, אך כל גלאי עם מצב תריס מתגלגל או קריאה מהירה מספיק מקובל. 
תוכנת DelphiThermo-FisherN/Aתוכנה במערכות Thermo-Fisher TEM המאפשרת סיבוב ידני של שלב הדגימה
תוכנת EPU-DThermo-FisherN/Aתוכנה מסחרית לרכישת נתוני MicroED
שקופיות כיסוי זכוכיתHamptonHR3-231
Glow מפרק PelcoeasiGlow
High Precision פינצטהEMS78325-ACכל פינצטה ברמת דיוק גבוהה תעשה
כלי חנקן נוזליSpear LabFD-800כלי קצף סטנדרטי לטיפול בדגימות תחת חנקן נוזלי - 800 מ"ל
תוכנת SerialEMUC BoulderN/Aתוכנה חינמית המופצת על ידי D. Mastronarde. המחלקה לביולוגיה מולקולרית, תאית והתפתחותית
רשתות TEMרשת Quantifoil/EMS300 שימשו כאן, אך כל רשתות פחמן דקות יעבדו. עבור מולקולות קטנות אלה, אנו מציעים להתחיל עם פחמן רציף. 
מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (TEM)Thermo-FisherTalos Arctica
Whatman נייר סינון עגולMillipore-SigmaWHA100109090 מ"מ ומעלה
רשתות Q310CMA-Multi-A

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals. eLife. 2, 01345(2013).
  2. Nannenga, B. L., Shi, D., Leslie, A. G. W., Gonen, T. High-resolution structure determination by continuous-rotation data ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microcrystal Electron DiffractionSmall Molecule StructureMicroED ProtocolElectron Cryo MicroscopyTEM Grid PreparationHigh Resolution StructureDiffraction Data CollectionCrystallographic SoftwareSample PreparationAtomic Resolution

Related Articles