מאמר שיטה

בידוד אדיפוציטים חומים מרקמת שומן חום אינטרסקפולרית של מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים

DOI:

10.3791/62332

⸱

12 במרץ 2021

 ,  , 
1Masonic Medical Research Institute

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מחקר זה מתאר שיטה חדשה לבידוד אדיפוציטים חומים מורין לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רקמת שומן חום (BAT) אחראית לתרמוגנזה שאינה רועדת ביונקים, ואדיפוציטים חומים (BAs) הם היחידות הפונקציונליות של BAT. BAs מכילים גם טיפות ליפידים מולטילוקולריות וגם מיטוכונדריה בשפע, והם מבטאים חלבון 1 (UCP1) שאינו מתמזג. BAs מסווגים לשני תתי-סוגים בהתבסס על מקורם: BAs קלאסיים שמקורם בעוברים (cBAs) ו-BAs שמקורם באדיפוציטים לבנים. בשל צפיפותם הנמוכה יחסית, לא ניתן לבודד BAs מ- BAT בשיטת צנטריפוגה מסורתית. במחקר זה פותחה שיטה חדשה לבידוד BAs מעכברים לצורך ניתוח ביטוי גנים וחלבונים. בפרוטוקול זה, BAT בין-סקפולרי מעכברים בוגרים עוכל בתמיסת קולגן ותמיסת Dispase, וה-BAs המנותקים הועשרו בתמיסת יודיקסנול של 6%. לאחר מכן, BAs מבודדים הוכנסו לריאגנט Trizol לבידוד סימולטני של RNA, DNA וחלבון. לאחר בידוד RNA, השלב האורגני של הליזאט שימש למיצוי חלבונים. הנתונים שלנו הראו שתמיסת יודיקסנול 6% העשירה ביעילות BAs מבלי להפריע למחקרי מעקב אחר גנים וביטוי חלבונים. גורם גדילה שמקורו בטסיות דם (PDGF) הוא גורם גדילה המווסת את הצמיחה וההתרבות של תאים מזנכימליים. בהשוואה לרקמת השומן החומה, ל-BAs המבודדים היה ביטוי גבוה יותר באופן משמעותי של Pdgfa. לסיכום, שיטה חדשה זו מספקת פלטפורמה לחקר הביולוגיה של אדיפוציטים חומים ברמה של תא יחיד.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

גם לעכברים וגם לבני אדם יש שני סוגים של רקמות שומן: רקמת שומן לבנה (WAT) ורקמת שומן חומה (BAT)1. WAT מאחסן אנרגיה בצורה של טריגליצרידים באדיפוציטים לבנים, והאדיפוציטים החומים (BAs) של BAT מפזרים אנרגיה כימית כחום2. בהתבסס על מקורם ההתפתחותי, BAs מסווגים עוד יותר ל-BAs קלאסיים (cBAs) שנוצרו במהלך התפתחות העובר ול-BAs שמקורם באדיפוציטים לבנים (תאי בז'/בריט, שהומרו מאדיפוציטים לבנים בתנאי עקה)3. BAs הם רב-לוקולריים ומבטאים את החלבון התרמוגני שאינו מתחבר לחלבון 1 (UCP1)4. מחסן BAT אינטרסקפולרי (iBAT) הוא אחד ממחסני ה-cBAs העיקריים ביונקים קטנים5, בעוד שתאי בז' מפוזרים בתוך WAT6.

בשל אופי פיזור האנרגיה שלהם, BAs קיבלו תשומת לב רבה כיעד טיפולי להפחתת השמנת יתר7. כדי לנצל את BAs לצורך טיפול בהשמנת יתר, חיוני להבין את המנגנונים המולקולריים השולטים בתפקוד, בהישרדות ובגיוס של BAs. רקמות שומן כולל BAT ו- WAT הן הטרוגניות. מלבד אדיפוציטים, רקמות השומן מכילות סוגי תאים רבים אחרים, כגון תאי אנדותל, תאי גזע מזנכימליים ומקרופאגים8. למרות שקיימים כלים גנטיים לדלדול ספציפי של גנים מועמדים בעכברים BAs, כגון UCP1::Cre line9, טכניקות לטיהור BAs מ-BAT או WAT מוגבלות, מה שמקשה על חקר BAs ברמה של תא יחיד. בנוסף, ללא קבלת BAs טהורים, היחסים בין BAs לבין אלה שאינם BAs לא יהיו מוגדרים בבירור. לדוגמה, קולטן גורם גדילה אלפא (PDGFRα) שמקורו בטסיות משמש כסמן לתאים מזנכימליים לא מובחנים, והוא מתבטא בתאי האנדותל והאינטרסטיציאליים של BAT. ב-BAT בלחץ קר, תאי אב חיוביים PDGFRα מולידים BAs10 חדש. PDGFRα מופעל על ידי הליגנד PDGF שלו, גורם גדילה המווסת את הצמיחה וההתרבות של תאים מזנכימליים11; עם זאת, לא ברור אם BAs משפיעים על ההתנהגות של תאי אב חיוביים PDGFRα על ידי הפרשת PDGF.

לאחרונה פורסם פרוטוקול בידוד BAs, המבוסס על מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנציה (FACS)12. בפרוטוקול זה, נעשה שימוש בתמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) כדי להפריד בין BAs ללא BAs, וה-BAs המועשרים טוהרו עוד יותר על ידי FACS. היישום של פרוטוקול זה מוגבל על-ידי הדרישה של תהליך FACS, המסתמך הן על ציוד והן על חוויות פעולה של FACS. במחקר זה פותח פרוטוקול חדש לבידוד BAs מ-BAT. ה-BAs המבודדים על ידי פרוטוקול זה יכולים לשמש ישירות למחקרי ביטוי גנים וחלבונים. יתר על כן, נתונים ממחקר זה מצביעים על כך ש- BAs הם משאב PDGF מרכזי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל העכברים הוחזקו בתנאים נטולי פתוגנים, וכל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). UCP1::Cre9 ורוזה 26tdTomato עכברים קווים13 דווחו בעבר. כל העכברים הוחזקו בטמפרטורת החדר עם מחזור אור/חושך של 12 שעות.

1. הכנת התמיסה ורקמת השומן החום (BAT)

  1. הכן תמיסת עיכול ותמיסת הפרדה בצינורות צנטריפוגה 15 מ"ל.
  2. 10 מ"ל של תמיסת עיכול BAT: ל-10 מ"ל של תמיסת מלח סטרילית עם חיץ פוספט (PBS), יש להוסיף 3.5 מ"ג/מ"ל Dispase II, 1 מ"ג/מ"ל קולגן II ו-10 מ"ל CaCl2 כדי ליצור תמיסת עיכול BAT.
  3. 10 מ"ל של 12% תמיסת יודיקסנול (תמיסת הפרדה): לערבב 1 מ"ל של 10x PBS, 2 מ"ל של 60% יודיקסנול, 0.01 מ"ל של 1 M MgCl 2, 0.025 מ"ל של 1 M KCl, 0.1 מ"ל של 0.2 M חומצה אתילנדיאמינטטראאצטית (EDTA) ו-6.865 מ"ל של ddH2 O כדי לקבל 12% יודיקסנול.
  4. המתת עכבר מבוגר אחד עם מנת יתר של CO2 . בקצרה, מלא את כלוב העכבר עם 100% CO2 בשיעור תזוזה של 10-30% נפח כלוב לדקה 5 דקות מאוחר יותר, לאשר את המוות על ידי בדיקת היעדר נשימה נראית לעין.
  5. נתחו את החיה ואספו BAT בין-גולגולתי. הסר את שכבות ה-WAT והשרירים תחת מיקרוסקופ סטריאו.
  6. כדי לקבל עיכול מספיק, לחתוך כל אונת BAT לתוך ~ 3 מ"מ 3 חלקים ומניחים אותם לתוך בקבוק נקי 50 מ"ל עם מוט ערבוב מתכת תמיסת עיכול5 מ" ל. לפני תחילת העיכול, תנו לבקבוקון המכיל BAT וחיץ עיכול לשבת על קרח למשך שעה אחת.
    הערה: בשלבים הבאים, כ-80 מ"ג BAT שימשו לבידוד אדיפוציטים חומים.

2. הליך בידוד BAs

  1. מניחים את הבקבוקון על מערבל מגנטי הסגור באינקובטור. הגדר את מהירות הערבוב ב -60 סל"ד ואת הטמפרטורה של האינקובטור ב -35 מעלות צלזיוס, בהתאמה. העיכול יימשך כ-30 דקות. אם פרוסות ה-BAT יוצרות גושים סביב מוט המערבל במהלך העיכול, השתמשו בקצה פיפטה של 1 מ"ל כדי לשבש את הרקמות המצטברות.
  2. הניחו מסנן מסננת של 70 מיקרומטר על גבי צינור צנטריפוגה נקי של 50 מ"ל. פיפטה סביב 4 מ"ל תא השעיה דרך המסננת. לשטוף את המסננת עם 4 מ"ל של 12% יודיקסנול פתרון. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב את התאים ואת תמיסת יודיקסנול. העבר את תערובת התאים לשתי מבחנות פוליסטירן שקופות של 5 מ"ל.
    הערה: בסוף העיכול, תמיסת העיכול צריכה להיות עכורה, מה שמעיד על עיכול מספיק. השתמש בתמיסת עיכול טרי בכל פעם. לאחר ההכנה, יש להשתמש בתמיסת העיכול תוך שעתיים.
  3. חזור על שלב 2.2 ו -2.3 פעם נוספת אם העיכול אינו מספיק.
  4. השאירו את צינורות הפוליסטירן השקופים המכילים את תמיסת ההפרדה וה-BAs על הקרח למשך שעה אחת. ה- BAs ייצרו שכבה בחלק העליון.
  5. הוציאו 20 μL מה-BAs המבודדים לבדיקה במיקרוסקופ.

3. רנ"א וחלבון בידוד מ-BAs

  1. פיזמו את שכבת ה-BAs לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה בגודל 1.7 מ"ל לבידוד RNA וחלבונים. הסר בזהירות את תמיסת היודיקסנול המוגזמת מבלי לשבש את שכבת ה- BAs.
  2. הוסיפו 1 מ"ל טריזול כדי לבודד בו-זמנית RNA, DNA וחלבון לתמיסת התא. מערבבים מספיק כדי lyse את התאים.
  3. הוסיפו 200 מיקרון ליטר של כלורופורם כדי להפריד בין הפאזות.
  4. צנטריפוגה את הצינור עבור 9,981 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
  5. לאחר צנטריפוגה, השתמש בפאזה המימית לבידוד RNA. במחקר זה, RNA כולל שימש לשעתוק הפוך, ו- RT-PCR כמותי בוצע עם PCR בזמן אמת. רצפי פריימרים מפורטים בטבלת החומרים.
  6. העבר 300 μL של הפאזה האורגנית לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל.
  7. לשלב האורגני, הוסיפו 2.5 נפח 100% אתנול ומערבולת במשך 10 שניות.
  8. הוסף 200 μL של 1-ברומו-3-כלורופרופאן ומערבולת במשך 10 שניות.
  9. הוסף 600 μL של מים מזוקקים כפולים מערבולת במשך 10 שניות.
  10. תן לתמיסה המעורבת לעמוד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  11. צנטריפוגה ב 9,981 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. בשלב זה יופרדו השלבים. שלב החלבון ממוקם בשכבה האמצעית.
  12. הסר את התמיסה המימית העליונה. הוסף 1 מ"ל 100% אתנול לתוך הפתרון הנותר.
  13. צנטריפוגה למשך 10 דקות, 9,981 x גרם, 4 מעלות צלזיוס. לאחר צנטריפוגה, כדור החלבון ייווצר. השליכו את הסופר-נטנט.
  14. לשטוף את הכדור עם 1 מ"ל 100% אתנול.
  15. צנטריפוגה למשך 10 דקות, 9981 x גרם, 4 מעלות צלזיוס. שמור את הכדור והשלך את הסופרנטנט.
  16. יש לייבש את הכדור באוויר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
  17. מדוד את משקל הכדור הרטוב. הוסף 1% תמיסת SDS ביחס של 20 μL / מ"ג גלולה.
  18. ממיסים את הכדור על ידי הכנסת הצינור לשייקר מחומם. הגדר את הטמפרטורה ב 55 °C (75 °F), ואת המהירות ב 11 x גרם. זה בדרך כלל לוקח 5-10 דקות כדי להמיס לחלוטין את גלולת החלבון.
    הערה: ריכוז החלבון המומס ניתן למדידה על ידי בדיקת BCA14.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הכנת BAT אינטראקפולרי לבידוד אדיפוציטים חומים
תהליך הבידוד של האדיפוציטים החומים (BAs) מתואר באיור 1A. התהליך כולו, החל מהכנת BAT ופתרונות עיכול/הפרדה ועד לקבלת BAs מבודדים ייקח כ-4 שעות.

בעכברים בוגרים, BAT בשפע קיים באזור הבין-שבדי. ה-BAT הבין-סקפולרי הזה (iBAT) מכוסה על-ידי שכבות שרירים ו-WAT (איור 1B). לפני תחילת הליך העיכול, יש להסיר את שכבות השרירים וה-WAT כדי להפיק iBAT נקי (איור 1C

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

במחקר זה פותחה שיטה חדשה לבידוד BAs לניתוח ביטוי גנים וחלבונים.

בפרוטוקול בידוד BAs שפורסם, נעשה שימוש בפתרון BSA של 3% להעשרת BAs12. עם זאת, לא ניתן היה להשתמש ישירות ב-BAs המועשר שהושגו על ידי פרוטוקול זה שפורסם לצורך ניתוח ביטוי חלבונים. הסיבה לכך היא שה-BSA המרוכז הקיים בתמיסת ה-BAs מפריע למעקב אחר מיצוי חלבונים. כאשר ה-BAs המועשרים בתמיסת 3% BSA טופלו במגיב Trizol, נוצרו אגרגטים של חלבונים דביקים, שרובם לא היו מסיסים בתהליך מיצוי החלבון GTPC. בנוסף, במוצר מיצוי החל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Z. Lin נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות HL138454-01 וקרנות מכון המחקר הרפואי הבונים החופשיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
<חזק>נוגדנים
<חזק>אנטיגן<חזק>חברה<חזק>קטלוג
PPAR&גמא;LSBioLs-C368478
PDGFRaסנטה קרוזsc-398206
UCP1R& D systemIC6158P
<חזק>כימי ותמיסות
קולגנאז, סוג IIThermo Fisher Scientific17101015
1-Bromo-3-chloropropaneSigma-AldrichB62404
אלבומין סרום בקר (BSA) GoldbioA-421-10
סידן כלוריBio BasicCT1330
ChloroformIBI ScientificIB05040
Dispase II, פרוטאזSigma-AldrichD5693
EDTABio BasicEB0107
אתנולIBI ScientificIB15724
LiQuant Universal Green qPCR מאסטר מיקסLifeSctLS01131905Y
מגנזיום כלוריד הקסהידרטבוסטון ביופרודקטסP-855
OneScrip פלוס cDNA סינתזה SuperMixABMG454
OptiPrep (יודיקסאנול)Cosmo Bio USAAXS-1114542
PBS (10x)Caisson LabsPBL07
PBS (1x)Caisson LabsPBL06
ערכת בדיקת חלבון Pierce BCAThermo Fisher Scientific23227
אשלגן כלוריBoston BioProductsP-1435
SimplyBlue כתם בטוחInvitrogenLC6060
נתרן דודציל סולפט (SDS)Sigma-Aldrich75746
מגיב טריזולטכנולוגיות חיים15596018
<חזק>פריימרים
שם הגן (מינים) הפוכה
Pdgfra (עכבר)CTCAGCTCTCTCTCCCAgGCAACGCATCTCAGAGAAAAGG
Pdgfa (עכבר)TGTGCCCATTCGCAGGAAGAagagTTGGCCACCTTGACACTGCG
36B4(עכבר)TGCTGAACATCTCCCCCCTCTCTCTCCACAGACAATGCCAGGAC
Ucp1ACTGCCACACCTCCAGTCATTCTTTGCCTCACTCAGGATTGG<
חזק>ציוד
<חזק>שם<חזק>חברה><חזק>יישום<חזק>
Keyence BZ-X700Keyenceהדמיה חום אדיפוציטים
מערבל מגנטיVWRDissociate BAT
QuantStudio 6 Flex מערכת PCR בזמן אמתמיושמת BiosystemPCR
כמותי מערכת ההדמיה של Odyssey FcLI-CORהדמיית כתם מערבי
קדימה

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
  2. Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, Cairo. 305763(2013).
  3. Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
  4. Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
  5. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
  6. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
  7. Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
  8. Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
  9. Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
  10. Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
  11. Kim, W. -S., Park, H. -S., Sung, J. -H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
  12. Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
  13. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
  14. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  15. Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
  16. Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
  17. Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674(2019).
  18. Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
  19. Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
  20. Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
  21. Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SDS PAGE1

מאמרים קשורים