הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

מודל עכברי אורתוטופי של סרטן השחלות באמצעות סטרומה אנושית לקידום גרורות

2.9K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62382

⸱

23 במרץ 2021

 ,  ,  ,  , 
1Division of Hematology/Oncology, Department of Medicine, Hillman Cancer Center, University of Pittsburgh, 2Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Sciences, Magee-Womens’ Hospital, University of Pittsburgh Medical Center

במאמר זה

סיכום

השתלה אורתוטופית של תאי סרטן שחלות מעורבבים עם תאי סטרומה אנושיים מספקת מודל עכבר המפגין התנהגות גרורתית מהירה ומפוזרת האופיינית לסרטן השחלות האנושי. מודל זה מאפשר גם לחקור אינטראקציות בין תאי גידול ותאי סטרומל, כמו גם את תפקידם בהתקדמות הגידול ובגרורות.

תקציר

סרטן השחלות מאופיין בגרורות מוקדמות ומפושטות, כאשר 70% מהנשים סובלות ממחלה גרורתית בזמן האבחון. בעוד שקיימים מודלים אלגנטיים של עכברים טרנסגניים של סרטן השחלות, עכברים אלה יקרים ולוקח זמן רב לפתח גידולים. מודלים של קסנוגרפט בהזרקה תוך-צפקית חסרים סטרומה אנושית ואינם מודלים במדויק גרורות של סרטן השחלות. אפילו xenografts שמקורם בחולה (PDX) אינם מסכמים במלואם את המיקרו-סביבה הסטרומלית האנושית מכיוון שקטעי PDX סדרתיים מדגימים אובדן משמעותי של סטרומה אנושית. היכולת למדל בקלות סרטן שחלות אנושי בתוך מיקרו-סביבה סטרומלית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית היא צורך שלא נענה. כאן, הפרוטוקול מציג מודל עכבר סרטן שחלות אורתוטופי באמצעות תאי סרטן שחלות אנושיים בשילוב עם תאי גזע מזנכימליים הקשורים לקרצינומה שמקורם בחולה (CA-MSCs). CA-MSCs הם תאי אב סטרומליים, המניעים את היווצרות המיקרו-סביבה הסטרומלית ותומכים בצמיחת סרטן השחלות ובגרורות. מודל זה מפתח גרורות מוקדמות ומפזר המחקה הצגה קלינית. במודל זה, תאי סרטן השחלות המבטאים לוציפראז מעורבבים ביחס של 1:1 עם CA-MSCs ומוזרקים לבורסה השחלתית של עכברי NSG. צמיחת הגידול והגרורות עוקבות באופן סדרתי לאורך זמן באמצעות הדמיית ביולומינסנציה. הגידולים המתקבלים גדלים באגרסיביות ויוצרים גרורות בבטן עד 14 יום לאחר ההזרקה. עכברים חוו ירידה משמעותית במשקל הגוף כסמן למחלה מערכתית ועלייה בנטל המחלה. ביום ה-30 לאחר ההזרקה, העכברים עמדו בקריטריונים של ירידה של >10% במשקל הגוף וגרורות תוך בטניות מאושרות ב-100% מהעכברים ו-60%-80% גרורות ריאות וכבד פרנכימלי. באופן קולקטיבי, השתלה אורתוטופית של תאי סרטן השחלות ותאי סטרומה מייצרת גידולים המחקים מקרוב את ההתנהגות הגרורתית המוקדמת והמפוזרת של סרטן השחלות האנושי. יתר על כן, מודל זה מספק כלי לחקר תפקידם של תאי סרטן השחלות: אינטראקציות של תאי סטרומה בהתקדמות גרורתית.

מבוא

סרטן השחלות היא מחלה קטלנית עם שיעור התמותההחמישי בגובהו מבין כל סוגי הסרטן בנשים1. רוב הנשים עם סרטן השחלות מאובחנות בשלב מתקדם, עם התפשטות גרורתית ב-70% מהחולות בזמן האבחון. גורמים כמו גרורות מוקדמות ושלב מתקדם באבחון תורמים לשיעורי התמותה הגבוהים הנראים במחלה זו. יתר על כן, מאפייני המחלה הייחודיים הללו הציבו אתגר לביסוס מודלים של עכברי סרטן השחלות, כולל שכפול נדידת מחלה מהירה לחלל הצפק 2,3,4.

פתוגנזה של סרטן השחלות, כולל התפשטות הצפק, מקלה על ידי היווצרות מיקרו-סביבת גידול תומכת (TME) הכוללת אלמנטים רבים5. מרכיב קריטי אחד של סרטן השחלות TME הוא תאי הגזע המזנכימליים הקשורים לקרצינומה (CA-MSC). CA-MSCs הם תאי אב סטרומליים המשפרים את התחלת סרטן השחלות, גדילה, עמידות לכימותרפיה וגרורות 6,7. CA-MSCs גם מניעים את היווצרות סרטן השחלות TME באמצעות גירוי פיברוזיס הקשור לגידול, גרימת אנגיוגנזה ושינוי המיקרו-סביבה החיסונית 6,8,9. בהתחשב בפונקציות העוצמתיות של CA-MSCs בתוך סרטן השחלות TME, מידול סרטן השחלות האנושי בתוך מיקרו-סביבה סטרומלית רלוונטית מבחינה פיזיולוגית הוא קריטי בחקר התקדמות סרטן השחלות וגרורות.

לאחרונה, מודלים של עכברים טרנסגניים זכו למשיכה בחקר גרורות ספונטניות של סרטן השחלות. עם זאת, עכברים טרנסגניים הם יקרים ומציגים מהלך זמן ממושך להתפתחות מחלה גרורתית. בעוד שלמודלים אחרים של עכברים זמינים כגון המודל התוך-צפקי ו-xenografts שמקורם בחולה (PDX) יש מרווחי זמן גרורתיים קצרים יחסית, הם אינם מסכמים באופן מלא גרורות של סרטן השחלות בשל היעדר מיקרו-סביבה סטרומלית רלוונטית 10,11,12. בניסיון להתגבר על אתגר זה, מחקר זה מציג מודל עכברי סרטן שחלות אורתוטופי באמצעות תאי סרטן שחלות אנושיים בשילוב עם CA-MSCs שמקורם בחולה. במודל המתואר כאן, שילוב CA-MSCs עם תאי סרטן השחלות יוצר גידולים עם גרורות מוקדמות ומפושטות, כפי שמודגם על ידי נוכחות של גרורות תוך בטניות ב-100% מהעכברים תוך 30 יום לאחר ההזרקה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

דגימות המטופלים התקבלו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי IRB (PRO17080326) של אוניברסיטת פיטסבורג. שיטות ניסוי בבעלי חיים נערכו על פי הפרוטוקול שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת פיטסבורג.

1. בידוד ואימות של תאי גזע מזנכימליים הקשורים לקרצינומה שמקורם בחולה (CA-MSCs)

הערה: CA-MSCs נגזרים מרקמת סרטן שחלות אנושית שנכרתה בניתוח (מחקר זה משתמש בקרצינומה סרוסית בדרגה גבוהה), כולל החצוצרה, השחלה ו/או משקעים גרורתיים אומנטליים. מדיום CA-MSC מוכן מ-MEBM (מדיום בסיסי של תאי אפיתל חלב) בתוספת 10% FBS מומת בחום, 1x B27, 20 ננוגרם/מ"ל EGF, 1 ננוגרם/מ"ל הידרוקורטיזון, 5 מיקרוגרם/מ"ל אינסולין, 100 מיקרומטר β-מרקפטואתנול, 10 ננוגרם/מ"ל β-FGF, 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו-20 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין 7,13.

  1. בידוד CA-MSC
    1. בעזרת אזמל סטרילי ומלקחיים, חלקו את דגימת הרקמה לחתיכות בגודל של כ-1 מ"מ3 . מניחים שלוש חתיכות מהרקמה בכל באר של צלחת תרבית תאים בת 6 בארות.
      הערה: ניתן לחתוך 0.2 גרם מרקמת הגידול ל-12 חתיכות וניתן לחלק אותם לארבע בארות של צלחת תרבית תאים בת 6 בארות.
    2. הוסף שכבה דקה של מדיה CA-MSC, כ-1 מ"ל לכל באר. הנח את צלחת תרבית התאים באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2.
    3. לאחר 24 שעות, הסר את המדיה בזהירות מבלי להפריע לחלקי הרקמה. הוסף כ -1 מ"ל מדיה טרייה לכל באר. פיפטו את המדיה לאט מבלי להפריע לחיבורי הרקמות. הנח את צלחת תרבית התאים בחזרה באינקובטור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2.
      הערה: בדוק את הרקמה במיקרוסקופ הפוך מדי יום והחלף את המדיה כמתואר בשלב 1.1.3 בכל פעם שתאים מתים נראים במצע התרבית.
    4. לאחר 7 ימים, הסר את חלקי הרקמה על ידי איסוף הרקמה באמצעות מלקחיים סטריליים ושטוף את התאים הדבקים פעם אחת עם PBS (PBS ללא Ca2+/Mg2+, 1 מ"ל לבאר). לאחר מכן, הוסיפו מדיום CA-MSC טרי (2 מ"ל לבאר) והניחו את צלחת תרבית התאים בחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2.
  2. הרחבת CA-MSCs
    1. כאשר CA-MSCs מתחילים לצמוח מהרקמה בתוך צלחת 6 הבארות, בדוק את התאים במיקרוסקופ הפוך כל יומיים כדי להבטיח צמיחה תאית. לאחר שהתאים מגיעים למפגש של 90%, המשך בשלבים הבאים.
    2. שאפו את המדיה מצלחת תרבית התאים, ולאחר מכן שטפו את התאים פעם אחת עם 1-2 מ"ל PBS לבאר (PBS ללא Ca2+/Mg2+).
    3. הוסף 300 מיקרוליטר לבאר של תמיסת 0.05% טריפסין/0.02% EDTA (טריפסין/EDTA). סובב את לוחית תרבית התאים כדי לכסות את התאים בטריפסין/EDTA והחזר את לוחית תרבית התאים לחממה למשך 2-3 דקות או עד לניתוק התאים.
    4. הוסף מדיום CA-MSC טרי כדי לנטרל את הטריפסין (1 מ"ל לבאר) ולהשעות מחדש את התאים. צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים עם מדיום גידול. העבירו את התאים התלויים מחדש לבקבוק25 ס"מ 2 בנפח כולל של 5 מ"ל של אמצעי תרבית.
      הערה: ניתן להעביר תאים שנאספו משלוש בארות של צלחת תרבית תאים בת 6 בארות לבקבוקבגודל 25 ס"מ. יש לבדוק את התאים לנוכחות מיקופלזמה (בהתאם לפרוטוקול זיהוי מיקופלזמה מבוסס כגון PCR) מכיוון שהם נגזרים מרקמה אנושית שנכרתה בניתוח14,15.
    5. ברגע שהתאים מגיעים למפגש של 70%-80%, העבירו את התאים מבקבוק25 ס"מלבקבוק 75 ס"מ לפי השלבים שתוארו קודם לכן 1.2.2-1.2.4. הרחב את התאים כל 5-7 ימים כדי לקבל את מספר התא הדרוש לאימות CA-MSC ולהליך החיסון האורתוטופי.
      הערה: מכיוון ש-CA-MSCs הם תאים שמקורם בחולה, זמן ההכפלה התאית שונה בין קווי התאים. רוב CA-MSCs דורשים 3-4 ימים כדי להכפיל את מספרם. עם זאת, חלק מ-CA-MSCs דורשים 5-7 ימים כדי להכפיל את מספרם. ניתן לעבור CA-MSCs 8-10 פעמים. לאחר מעבר 10, CA-MSCs עשויים להזדקן או להתמיין.
  3. אימות CA-MSC
    1. אימות ביטוי פני השטח של CA-MSC: השתמש ב-0.5 x 106 CA-MSCs (כ-70% מפגש בבקבוקבגודל 75 ס"מ) לניתוח זרימה ציטומטרי כדי להבטיח ש-CA-MSCs מבטאים סמני משטח מתאימים כפי שהוגדרו על ידי הנחיות האגודה הבינלאומית לטיפול תאי, כפי שתואר קודם לכן (CD73/CD90/CD105 חיובי; CD45/CD34/CD14 או CD11b/CD79a או CD19/HLA-DR נגטיב)7,16. אשר את מספר התא לאחר טריפסיניזציה וספור באמצעות המוציטומטר עם אי הכללת טריפאן-כחול של תאים מתים.
      הערה: אם ניתוח ציטומטריית הזרימה מדגים שהתאים טהורים ב-<90%, מיין את התאים עבור אוכלוסיית CA-MSC.
    2. אימות התמיינות CA-MSC: כדי לאמת התמיינות שושלת, זרע CA-MSCs לבאר אחת של צלחת בת 6 בארות בצפיפות תאים של 5 x 104 תאים / באר ב -2 מ"ל של מדיה MSC (באר אחת לכל תנאי התמיינות). לאחר 24 שעות, שנה את המדיה לאמצעי ההתמיינות המתאים כדי לגרום להתמיינות אדיפוציט לעומת כונדרוציטים לעומת אוסטאוציטים כפי שתואר קודם לכן 7,16.
      הערה: בהתאם להנחיות ISCT, MSCs חייבים להדגים התמיינות במבחנה לשני קווים לפחות (אדיפוציט, כונדרוציט או אוסטאוציטים).
  4. ביום הליך הזרקת העכבר המתוכנן, אסוף את התאים על ידי ביצוע השלבים 1.2.2 ו- 1.2.4. לאחר מכן, ספרו את התאים באמצעות המוציטומטר עם אי הכללה של טריפאן-כחול לצורך כדאיות והשעו מחדש את התאים במדיום CA-MSC בצפיפות של 1 x 108 תאים/מ"ל (0.5 x 106 CA-MSCs להזרקה). הניחו את התאים התלויים על קרח.
    הערה: בדרך כלל, ניתן להפיק לפחות 1 x 107 CA-MSCs מדגימת גידול אחת (0.2 גרם רקמה). זה מאפשר להשתמש בקו CA-MSC יחיד שמקורו בחולה עבור רוב הניסויים בעכברים. ניתן לשלב CA-MSCs ממטופלות שונות, אך אנו ממליצים שהם נגזרים מאותו תת-סוג היסטולוגי של סרטן השחלות. לרוב קווי CA-MSCs לוקח חודשיים ו/או 6-7 מעברים להגיע ל-1 x 107 תאים. ניתן להקפיא CA-MSCs באמצעות אמצעי הקפאת תאים סטנדרטיים ולאחסן אותם בחנקן נוזלי ללא הגבלת זמן לשימוש מאוחר יותר.

2. הכנת תאי סרטן השחלות

  1. שמור על תאי OVCAR3-Luc במדיום DMEM עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) ופניצילין/סטרפטומיצין (פניצילין: 100 יחידות/מ"ל, סטרפטומיצין: 0.1 מ"ג/מ"ל). תאי תרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה לחה של 5% CO2 .
  2. ביום ההזרקה, אסוף תאי OVCAR3-Luc באמצעות השלבים הבאים.
    1. ראשית, שאפו את המדיה מבקבוק תרבית התאים ושטפו את התאים פעם אחת עם 5-7 מ"ל PBS לכל בקבוק 75 ס"מ2 (PBS ללא Ca2+/Mg2+). שאפו את ה-PBS והוסיפו תמיסת טריפסין/EDTA (2 מ"ל לכל 75 ס"מ2 בקבוק). לאחר מכן, החזירו את בקבוק תרבית התאים לחממה למשך 3-5 דקות או עד לניתוק התאים.
    2. באמצעות מיקרוסקופיה, הקפידו על טריפסיניזציה מלאה של התאים (וודאו שכל התאים מנותקים מבקבוק התרבית). כדי לעצור את הטריפסיניזציה, הוסף DMEM טרי המכיל סרום לבקבוק (2-3 מ"ל לכל 75 ס"מ2 בקבוק) והשהה מחדש את התאים. בעזרת פיפטה, העבירו את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
    3. צנטריפוגה ב -300 x גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש את התאים עם מדיום גידול. לאחר מכן, ספרו את התאים והשעו מחדש במצע הגידול בצפיפות של 1 x 108 תאים/מ"ל (0.5 x 106 תאי OVCAR3-Luc להזרקה). הניחו את התאים התלויים על קרח.

3. חיסון אורתוטופי

  1. הכנת תרחיף תאים
    1. מערבבים CA-MSCs ותאי OVCAR-Luc ביחס של 1:1.
    2. הפשירו את מטריצת קרום המרתף הקפואה באמבט קרח. לאחר מכן, הוסף את תרחיף התאים שהוכן בשלב 3.1.1 למטריצת קרום המרתף ביחס של 1:1 (ריכוז התא הסופי: 1 x 106/20 מיקרוליטר של מטריצת ממברנה בינונית-בסיסית) וערבב היטב. יש לשמור את מתלי התאים המוכנים באמבט קרח עד לשימוש.
      הערה: מתואר כאן יחס CA-MSC ל-OVCAR-Luc של 1:1 בהתבסס על ניסיון קודם עם הדגם שהוזכר. עבודות קודמות מדגימות כי CA-MSCs נמצאים בדרך כלל ביחס של 1:10 לתאי הגידול כאשר הם מכומתים ישירות מרקמת המטופל. כפי שנדון להלן, התחלה עם יחס CA-MSC לתאי גידול של 1:1 מניבה יחס משוער של 1:10 של CA-MSC לתאי גידול הן באתרים הראשוניים והן באתרים הגרורתיים בנקודות הקצה הניסיוניות באמצעות מודל זה.
  2. כירורגיה
    הערה: יש לבצע ניתוח בתנאים סטריליים ולהשתמש במכשירים כירורגיים סטריליים. מומלץ להשתמש בעכברי NSG נקבות בגיל 8 שבועות למודל אורתוטופי זה.
    1. להרדים את העכבר באמצעות שאיפה עם איזופלורן (4% לאינדוקציה, 2% לתחזוקה) וחמצן (100%, מד זרימה 0.5-1 ליטר לדקה). הנח את העכבר על מערכת חרוט האף לפני הניתוח. כדי לספק הרדמה לאורך כל הניתוח (ראה הוראות מפורטות להלן), הכנס את ראש העכבר למערכת חרוט האף של איזופלורן.
    2. יש להזריק לעכבר 5 מ"ג/ק"ג קרפרופן, משכך כאבים טרום ניתוחי עם מזרק אינסולין.
    3. בעזרת קוצץ, גלח את החלק הזנבי השמאלי של העכבר בין שולי החוף לעצם הירך. עקר את האזור המגולח בתמיסת פובידון-יוד וספוגיות אלכוהול. לאחר מכן, העבירו את העכבר למערכת חרוט האף הכירורגית והתאימו את האיזופלורן ל-1.5% להרדמה תחזוקתית.
    4. בצע חתך עור אופקי של 1-2 ס"מ כ-2-3 ס"מ מתחת לשולי החוף. אחזו בצפק הקודקודי בעזרת מלקחיים והרמו (הצפק ייראה מבריק ויתאפיין במשקעים של רקמת שומן). בצע חתך של 1 ס"מ בצפק הקודקודי כדי לפתוח את חלל הבטן.
    5. התבונן באוסף רקמת השומן המקיפה את שחלת העכבר (בורסת השחלות) עם כניסת הצפק. השתמש במלקחיים מעוקלים כדי לתפוס ולחשוף את בורסת השחלות. תוך כדי אחיזה חזקה בשחלה עם המלקחיים, הזרקו 20 מיקרוליטר מתרחיף התאים שהוכן בשלב 3.1.2 לבורסה.
    6. החזר בזהירות את השחלה לחלל הבטן. בעזרת תפר חומצה פוליגליקולית נספגת 6-0 המחובר למחט, החזר את שולי חתך הצפק הקודקודי סגור את חתך העור בעזרת קליפסים לפצעים.
    7. הסר את העכבר מחרוט האף והנח את העכבר בכלוב נקי נפרד תחת אור מחמם עד שהוא יקבל הכרה ושומר על שכיבה על עצם החזה. לאחר מכן, החזר את העכבר לכלוב שלו.
    8. עקוב אחר העכברים מדי יום במשך 3-7 ימים לאחר הניתוח. הניחו ג'ל קרפרופן בכלובי העכברים לשליטה בכאבים. הסר את קליפס הפצע 7-10 ימים לאחר הניתוח.

4. מעקב אחר צמיחת הגידול ומשקל גוף העכבר מדי שבוע

  1. מערכת הדמיה in vivo (IVIS): החל מהשבוע הראשון לאחר החיסון האורתוטופי, בצע הדמיה in vivo כל שבוע במשך 3-4 השבועות הבאים.
    1. הכן את התמיסה של D-luciferin (מצע של לוציפראז גחלילית) על ידי המסה של 15 מ"ג ב-1 מ"ל PBS וסינון דרך ממברנה של 0.22 מיקרומטר לעיקור.
    2. הפעל את ה- IVIS בהתאם להוראות היצרן. לחץ על סמל שולחן העבודה של Living Image Software . לאחר מכן, בלוח הבקרה של רכישת IVIS, בחר אתחול. שלב זה יכול להימשך עד 10-15 דקות. במהלך תקופה זו, הכינו את העכברים להדמיה.
    3. להרדים כל עכבר באמצעות תא האיזופלורן המחובר ל- IVIS (2%-4% איזופלורן ומד זרימת חמצן עד 0.5-1 ליטר לדקה). יש להזריק את ה-D-לוציפרין (100 מיקרוליטר/10 גרם משקל גוף) באמצעות הזרקה תוך צפקית באמצעות מזרק אינסולין.
    4. הנח את החיה שהוזרקה בלוציפרין בחזרה לתא האיזופלורן.
      הערה: חשוב לתעד את זמן ההזרקה על מנת לשמור על עקביות הזמן בין הזרקת לוציפרין לביצועי ההדמיה לאורך כל המחקר.
    5. העבר את העכבר המורדם לתא ההדמיה והגדר את מערכת ההדמיה להגדרות המתאימות. לאחר מכן, רכוש את התמונה בזמן המתאים.
    6. לאחר שמירת התמונות, הוציאו את העכברים מתא ההדמיה והחזירו אותם לכלובים שלהם.
      הערה: ניתן לתייג CA-MSCs גם עם תג פלואורסצנטי ונדידה/גרורות משותפת של תאי CA-MSCs ו-OVCAR3-Luc המנוטרים in vivo באמצעות תעלה פלואורסצנטית ב-IVIS.

5. הערכת CA-MSC: משקעים גרורתיים של תאי גידול

  1. בהגיעם לנקודת הקצה שהוגדרה מראש (עלייה במשקל >20% עם נוכחות מיימת, ירידה במשקל <10%, כיב גידול, ציון מיזוג גוף של 2 או פחות17), המתת חסד של העכברים בהתאם לסטנדרטים מוסדיים לרווחת בעלי חיים.
  2. בצע נתיחה על כל עכבר בנפרד. הנח מחט סטרילית של 18 גרם תוך הצפק כדי לשאוב מיימת. לאחר מכן, חשפו את בית החזה ואת חלל הבטן. לכמת את המחלה הגרורתית הגסה באמצעות בדיקה ויזואלית של מעורבות הגידול של איברי העכברים18.
  3. הסר את רקמת הגידול באמצעות אזמל סטרילי ו-i) תקן ב-paraformaldehyde להטמעת פרפין בסופו של דבר, ii) הקפאת בזק והטמעה באמצעי הטמעת קריוסטט OTC, iii) הקפאת הבזק לניתוח DNA, RNA או חלבון במורד הזרם, או iv) להתנתק לתאים בודדים לצורך ציטומטריית זרימה או בידוד FACS.
    הערה: CA-MSCs נשארים ברי קיימא במודל זה וניתן לבודד אותם מחדש עבור יישומים במורד הזרם. בהתאם למטרת המחקר, ניתן לחקור את האינטראקציות בין CA-MSC לתאי גידול באמצעות גישות אימונוהיסטוכימיות, גישות זרימה ציטומטריות או שמירה על תאים מבודדים מחדש בתרבית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הגישה המתוארת מחקה מקרוב את המיקרו-סביבה התומכת של סרטן השחלות (בפרט, קרצינומה סרוסית בדרגה גבוהה) על ידי הזרקה משותפת של תאי גזע מזנכימליים שמקורם בחולה (CA-MSCs) ותאי סרטן השחלות לבורסה של השחלות. ראשית, CA-MSCs בודדו מסרטן שחלות אנושי ראשוני שנכרת בניתוח בדרגה גבוהה המעורב באומנטום (כל CA-MSCs ששימשו בניסוי זה נגזרו מאותה מטופלת). לאחר שבועיים של ציפוי דגימות הרקמה, CA-MSCs נבדקו כדי לעמוד בקריטריונים שהוגדרו על ידי האגודה הבינלאומית לטיפול תאי (ISCT) עבור תאי גזע מזנכימליים/תאי סטרומה מזנכימליים מולטיפוטנטיים. מכיוון...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

למרות מאמצים קליניים ומחקריים משמעותיים, נעשתה התקדמות מינימלית בטיפול ומניעה של סרטן השחלות1. בעוד שמגוון מודלים של עכברים שימשו לחקר התקדמות סרטן השחלות וגרורות, מודלים אלה התמודדו עם מגבלות משמעותיות. בפרט, מודלים קודמים של עכברים לא הצליחו לסכם באופן מלא את ההיסטוריה הטבעית של התקדמות סרטן השחלות, כולל המאפיין הבולט של גרורות תוך בטניות מוקדמות ומפוזרות11,12. מחקרים אחרונים הראו כי המיקרו-סביבה הסטרומל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגודי אינטרסים.

תודות

ברצוננו להודות לתוכנית הביו-דגימה הגינקולוגית האונקולוגית-פרומרק על העזרה באיסוף רקמות. LGC נתמך על ידי מענק הכוכב העולה של טינה וקרן מרי קיי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
0.05% טריפסין/0.02% EDTASigmaSLCD2568
אנטי אנושי CD105BD Pharmingen560847
אנטי אנושי CD73BD Pharmingen555596
אנטי אנושי CD90BD Pharmingen561443
B27Gibco17504-044
β-FGFGibcoPHG0261
β-mercaptoethanolMP Biomedicals194834
קרפרופןהנרי שיין11695-6934-1
D-luciferinPerkinElmer122799
DMEDGibco11995-065
EGFGibcoPHG0311
GentamicinGibco15710072
אינסולין FBSGibco16000069
InsulinGibco12585014
מזרק אינסוליןBD Pharmingen324704
מערכת הדמיה In vivo IVISPerkinElmerIVIS Lumina X5
MatrigelCorning354230
MEBM (מדיום בסיסי של תאי אפיתל חלב)ATCCPCS-600-030
ערכת בדיקת מיקופלזמהעכברי ABmG238
NSGמעבדת ג'קסון5557
OVCAR3ATCCHTB-161
פניצילין/סטרפטומיציןתפר חומצה
ACE003-2480
פוליגליקולית Gibco 15070063

מקורות

  1. American Cancer Society. K. S. f. O. C. American Cancer Society. , (2020).
  2. Konecny, G. E., et al. Prognostic and therapeutic relevance of molecular subtypes in high-grade serous ovarian cancer. Journal of the National Cancer Institute. 106 (10), (2014).
  3. Verhaak, R. G., et al. Prognostically relevant gene signatures of high-grade serous ovarian carcinoma. The Journal of Clinical Investigation. 123 (1), 517-525 (2013).
  4. Tothill, R. W., et al. Novel molecular subtypes of serous and endometrioid ovarian cancer linked to clinical outcome. Clinical Cancer Research: An Official Journal of the American Association for Cancer Research. 14 (16), 5198-5208 (2008).
  5. Ghoneum, A., Afify, H., Salih, Z., Kelly, M., Said, N. Role of tumor microenvironment in ovarian cancer pathobiology. Oncotarget. 9 (32), 22832-22849 (2018).
  6. Coffman, L. G., et al. Human carcinoma-associated mesenchymal stem cells promote ovarian cancer chemotherapy resistance via a BMP4/HH signaling loop. Oncotarget. 7 (6), 6916-6932 (2016).
  7. Coffman, L. G., et al. Ovarian carcinoma-associated mesenchymal stem cells arise from tissue-specific normal stroma. Stem Cells. 37 (2), 257-269 (2019).
  8. Spaeth, E. L., et al. Mesenchymal stem cell transition to tumor-associated fibroblasts contributes to fibrovascular network expansion and tumor progression. PLoS One. 4 (4), 4992(2009).
  9. Atiya, H., Frisbie, L., Pressimone, C., Coffman, L. Mesenchymal stem cells in the tumor microenvironment. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1234, 31-42 (2020).
  10. Magnotti, E., Marasco, W. A. The latest animal models of ovarian cancer for novel drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 13 (3), 249-257 (2018).
  11. Connolly, D. C., Hensley, H. H. Xenograft and transgenic mouse models of epithelial ovarian cancer and non-invasive imaging modalities to monitor ovarian tumor growth in situ: applications in evaluating novel therapeutic agents. Current Protocols in Pharmacology. 45 (1), 1-26 (2009).
  12. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. The Journal of Pathology. 233 (3), 228-237 (2014).
  13. McLean, K., et al. Human ovarian carcinoma-associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production. The Journal of Clinical Investigation. 121 (8), 3206-3219 (2011).
  14. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Comparative PCR analysis for detection of mycoplasma infections in continuous cell lines. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (2), 79-85 (2002).
  15. Nikfarjam, L., Farzaneh, P. Prevention and detection of Mycoplasma contamination in cell culture. Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).
  16. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  17. Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49 (3), 319-323 (1999).
  18. Fan, H., et al. Epigenomic reprogramming toward mesenchymal-epithelial transition in ovarian-cancer-associated mesenchymal stem cells drives metastasis. Cell Reports. 33 (10), 108473(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

NSG

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.