בהתבסס על מטריצת פפטיד שמקורה בוירוס הפטיטיס B (HBV), ניתן להעריך תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV במקביל לזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
ניתוח תגובות תאי T HBV ספציפיות ל- CD4 וזיהוי של Epitopes תאי T מוגבלים HLA-DR-CD4 המבוססים על מטריצת פפטיד
במאמר זה
סיכום
תקציר
תאי CD4 T ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של הפטיטיס B כרונית. כאוכלוסיית תאים רב-תכליתית, תאי CD4 T סווגו כתת-קבוצות תפקודיות מובחנות בהתבסס על הציטוקינים שהם מפרישים: לדוגמה, IFN-γ עבור תאי עוזר CD4 T 1, IL-4 ו- IL-13 עבור תאי עוזר CD4 T 2, IL-21 עבור תאי עוזר זקיקי CD4 T, ו- IL-17 עבור תאי עוזר CD4 T 17. ניתוח של נגיף הפטיטיס B (HBV)-ספציפי CD4 T תאים המבוססים על הפרשת ציטוקינים לאחר גירוי פפטידים נגזר HBV יכול לספק מידע לא רק על הגודל של HBV ספציפי CD4 T-cell תגובה, אלא גם על תת קבוצות פונקציונליות של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV. גישות חדשניות, כגון ניתוח תמלול ומטבולומיה, יכולות לספק מידע פונקציונלי מפורט יותר על תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV. גישות אלה דורשות בדרך כלל בידוד של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV המבוססים על ריבוי ריבוי היסטופלים של היסטו-II, בעוד שכרגע המידע על אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell מוגבל. בהתבסס על מטריצת פפטיד שמקורה ב- HBV, פותחה שיטה להערכת תגובות תאי T CD4 ספציפיות ל- HBV ולזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell בו זמנית באמצעות דגימות תאים חד-גרעיניים בדם היקפיים מחולי זיהום HBV כרוניים.
מבוא
נכון לעכשיו, ישנן 3 גישות עיקריות לנתח תאי T ספציפיים אנטיגן. הגישה הראשונה מבוססת על האינטראקציה בין קולטן תא ה- T לפפטיד (אפיטופ). תאי T ספציפיים לאנטיגן יכולים להיות מוכתמים ישירות עם ריבוי קומפלקס היסטו-תאימות (MHC) גדול פפטיד. היתרון של שיטה זו הוא שהיא יכולה להשיג תאי T ספציפיים אנטיגן קיימא, מתאים לניתוח תמלול במורד הזרם / מטבולומיה. מגבלה של שיטה זו היא כי זה לא יכול לספק מידע על התגובה כולה של תא T אנטיגן מסוים, כפי שהוא דורש פפטידים epitope מאומת בעוד מספר אפיטופים מזוהים עבור אנטיגן מסוים מוגבל לעת עתה. בהשוואה לנגיף הפטיטיס B (HBV)-ספציפי CD8 T-cell epitopes, פחות אפיטופים ספציפיים HBV CD4 T-cell זוהו1,2....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל מטופל שנכלל במחקר. פרוטוקול המחקר תואם את ההנחיות האתיות של הצהרת הלסינקי משנת 1975, כפי שבאו לידי ביטוי באישור מוקדם של ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים סאות'ווסט.
1. עיצוב מטריצת הפפטיד שמקורה ב-HBV
- הורד רצפי חומצות אמינו של אנטיגן הליבה HBV ממסדי נתונים NCBI (GenBank: AFY98989.1).
- רכישת פפטידים שמקורם באנטיגן ליבה HBV (פאנל של פפטידים 15-mer חופפים על ידי 10 שאריות, טוהר > 90%, 4 מ"ג / פפטיד) מספק שירות סינתזת פפטיד.
- הגדר מטריצת פפטיד מרובעת של 6×6 עם כל מיקום במטריצה המכילה פפטיד אחד בלבד. ישנן 12 בריכות פפטיד: 6 בריכות פפטיד בשורה ו-6 בריכות פפטידים, 5-6 פפטידים בכל בריכה
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
התדירות של תאי CD4 T מפרישים ציטוקינים מחושבת כסכום של מפיקים בודדים ומפיקים כפולים. כפי שהודגם באיור 1, התדירות של תאי CD4 T4 T מפרישים α ותדירות תאי ה-CD4 T מפרישים Γ IFN בבקרת רקע (DMSO) הם 0.154% ו-0.013% בהתאמה. התדירות של תאי CD4 T4 מפרישים α TNF והתדירות של IFN-γ מפריש תאי CD4 T ספציפיים למאגר פפטיד Core11 הם 0.206 ו- 0.017 בהתאמה, כך שגם TNF-α הפרשת תגובת תאי T של CD4 וגם תגובת תאי T של Γ IFN-γ להפרישת CD4 T-cell עבור מאגר פפטיד זה נחשבים שליליים. התדירות של תאי CD4 T4 T4 מפרישים α ו.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה מפורטים באופן הבא: 1) מספיק מחשבי PBMCs בעלי כדאיות גבוהה כדי להתחיל הרחבת מחשבים אישיים; 2) סביבה מתאימה להרחבת מחשבים אישיים; ו -3) הסרה מלאה של שאריות בריכות פפטיד בתרבות PBMCs לפני זיהוי אפיטופ.
כל הניתוח בפרוטוקול זה תלוי בשגשוג החזק של תאי CD4 T. באופן כללי, מספר מחשבי PBMCs לאחר הרחבה של 10 ימים יהיה פי 2-3 מהמספר ההתחלתי. מספר התא והיכולת של מחשבים אישיים הם 2 גורמי מפתח בהרחבת מחשבים אישיים. אם המטרה היא רק לנתח תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV ללא זיהוי אפ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81930061), הקרן למדעי הטבע צ'ונגצ'ינג (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) ומפתח סיני
פרויקט מתמחה במחלות זיהומיות (2018ZX10723203).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אלבומין בקר V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| מצומד APC אנטי אנושי TNF-& אלפא; | eBioscience | 17-7349-82 | שמור מוגן מפני אור |
| בנזונאז נוקלאז | סיגמא-אולדריץ' | E1014 | הגבל |
| קווי תאים לימפובלסטואידים B גושים (BLCs) | מרכז פרד האצ'ינסון לחקר הסרטן | HLA-DRB1*0803 | |
| קווי תאים לימפובלסטואידים מסוג B הומוזיגוט B (BLCLs) | המרכז לחקר הסרטן פרד האצ'ינסון | HLA-DRB1*1202 הומוזיגוט | |
| בקבוק תרבית תאים (T75) | קורנינג | ||
| (96 בארות, תחתית שטוחה) | קורנינג | 3599 | תחתונה שטוחה |
| (96 בארות, תחתית עגולה) | קורנינג | 3799 | תחתונה עגולה |
| קורנינג | CLS431751 | גודל נקבוביות 70 μ m, לבן, | |
| צינור צנטריפוגה סטרילי (15 מ"ל) | KIRGEN | KG2611 | |
| צינור צנטריפוגה סטרילי (50 מ"ל) | סטרילית 430829 קורנינג | ||
| Eppendorf | 5804R | ||
| Thermo | ST16R | מקוררת | |
| , קירור | Thermo | Legend Micro 21R | |
| ערכת ציטופיקס/ציטופרם (סט מאגר גורמי שעתוק) | BD Biosciences | 562574 | הכן תמיסה לפני השימוש |
| דימתיל סולפוקסיד (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | שמור בטמפרטורת החדר כדי למנוע התגבשות |
| Dulbecco' s תמיסת | מכינים ddH2O (1000 מ"ל) המכילים NaCl (8000 מ"ג), KCl (200 מ"ג), KH2PO4 (200 מ"ג) ו-Na2HPO4.7H2O (2160 מ"ג). התאם את ה-PH ל-7.4. לעקר באמצעות חיטוי. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| טיפים לסינון (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | |
| טיפים לסנן סטרילי (100-1000) | Kirgen | KG5333 | |
| טיפים לסנן סטרילי (1-200) | Kirgen | KG5233 | |
| סטרילי מצומד FITC אנטי אנושי CD4 | BioLegend | 300506 | שמור מוגן מפני אור |
| צבע כדאיות ניתן לתיקון eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | שמור מוגן מפני |
| אור מעכב הובלת חלבון GolgiStop (המכיל מוננסין) | BD Biosciences | 554724 | מעכב הובלת חלבון |
| המוציטומטר | מותג | 718620 | |
| HBV ליבת אנטיגן | פפטידים סיןפפטידים | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 מ"ל |
| סרום אנושי AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 מ"ל |
| יונומיצין | סיגמא-אולדריץ' | I0634 | |
| KCl | סנגון ביוטק | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | סנגון ביוטק | A100781-0500 | |
| LSRציטומטר | |||
| L-גלוטמין | Gibco | 25030081 | שפופרת |
| מיקרוצנטריפוגה 100 מ"ל (1.5 מ"ל) | קורנינג | MCT-150-C | עיקור חיטוי לפני השימוש |
| ב-Microplate | Shakers Scientific | Industries MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | צינורות A100241-0500 | |
| PCR (0.2 מ"ל) | Kirgen | KG2331 | |
| מצומד PE/Cy7 אנטי אנושי CD8 | BioLegend | 300914 | שמור מוגן מפני אור |
| מצומד PE IFN-&גמא אנטי אנושי; | eBioscience | 12-7319-42 | שמור מוגן מפני אור |
| פניצילין סטרפטומיצין | Gibco | 15140122 | 100 מ"ל |
| מצומד PerCP-Cy5.5 אנטי אנושי CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | שמור מוגן מפני אור |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| רקומביננטי אנושי IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| רקומביננטי אנושי IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI בינוני 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 מ"ל |
| נתרן פירובט, 100 מ"מ | Gibco | 15360070 | |
| טריפן כתם כחול (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF מטוהר אנטי אנושי HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard DNA גנומי ערכת טיהור | Promega | A1125 |
מקורות
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
