מאמר שיטה

ניתוח תגובות תאי T HBV ספציפיות ל- CD4 וזיהוי של Epitopes תאי T מוגבלים HLA-DR-CD4 המבוססים על מטריצת פפטיד

DOI:

10.3791/62387

⸱

20 באוקטובר 2021

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, Southwest Hospital, Third Military Medical University (Army Medial University), 2Chongqing Key Laboratory for Research of Infectious Diseases

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בהתבסס על מטריצת פפטיד שמקורה בוירוס הפטיטיס B (HBV), ניתן להעריך תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV במקביל לזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תאי CD4 T ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה של הפטיטיס B כרונית. כאוכלוסיית תאים רב-תכליתית, תאי CD4 T סווגו כתת-קבוצות תפקודיות מובחנות בהתבסס על הציטוקינים שהם מפרישים: לדוגמה, IFN-γ עבור תאי עוזר CD4 T 1, IL-4 ו- IL-13 עבור תאי עוזר CD4 T 2, IL-21 עבור תאי עוזר זקיקי CD4 T, ו- IL-17 עבור תאי עוזר CD4 T 17. ניתוח של נגיף הפטיטיס B (HBV)-ספציפי CD4 T תאים המבוססים על הפרשת ציטוקינים לאחר גירוי פפטידים נגזר HBV יכול לספק מידע לא רק על הגודל של HBV ספציפי CD4 T-cell תגובה, אלא גם על תת קבוצות פונקציונליות של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV. גישות חדשניות, כגון ניתוח תמלול ומטבולומיה, יכולות לספק מידע פונקציונלי מפורט יותר על תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV. גישות אלה דורשות בדרך כלל בידוד של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV המבוססים על ריבוי ריבוי היסטופלים של היסטו-II, בעוד שכרגע המידע על אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell מוגבל. בהתבסס על מטריצת פפטיד שמקורה ב- HBV, פותחה שיטה להערכת תגובות תאי T CD4 ספציפיות ל- HBV ולזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell בו זמנית באמצעות דגימות תאים חד-גרעיניים בדם היקפיים מחולי זיהום HBV כרוניים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נכון לעכשיו, ישנן 3 גישות עיקריות לנתח תאי T ספציפיים אנטיגן. הגישה הראשונה מבוססת על האינטראקציה בין קולטן תא ה- T לפפטיד (אפיטופ). תאי T ספציפיים לאנטיגן יכולים להיות מוכתמים ישירות עם ריבוי קומפלקס היסטו-תאימות (MHC) גדול פפטיד. היתרון של שיטה זו הוא שהיא יכולה להשיג תאי T ספציפיים אנטיגן קיימא, מתאים לניתוח תמלול במורד הזרם / מטבולומיה. מגבלה של שיטה זו היא כי זה לא יכול לספק מידע על התגובה כולה של תא T אנטיגן מסוים, כפי שהוא דורש פפטידים epitope מאומת בעוד מספר אפיטופים מזוהים עבור אנטיגן מסוים מוגבל לעת עתה. בהשוואה לנגיף הפטיטיס B (HBV)-ספציפי CD8 T-cell epitopes, פחות אפיטופים ספציפיים HBV CD4 T-cell זוהו1,2, מה שהפך שיטה זו פחות ישימה לניתוח של תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV כיום.

הגישה השנייה מבוססת על upregulation של סדרה של סמנים המושרה הפעלה לאחר גירוי פפטיד אנטיגן3. הסמנים הנפוצים כוללים CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. שיטה זו שימשה כעת לניתוח תגובות תאי T ספציפיים אנטיגן אצל אנשים מחוסנים5,6, זיהום וירוס חיסוני אנושיחולים 7, ותסמונת נשימה חריפה חמורה קורונה 2 חולי זיהום8,9. שלא כמו הבדיקה המבוססת על ריבוי פפטיד-MHC, שיטה זו אינה מוגבלת על ידי אפיטופים מאומתים ויכולה להשיג תאים ברי קיימא לניתוח במורד הזרם. מגבלה של שיטה זו היא כי זה לא יכול לספק מידע על פרופיל ציטוקינים של תאי T ספציפי אנטיגן. כמו כן, הביטוי של סמנים אלה המושרה הפעלה על ידי כמה תאים אנטיגן-ספציפיים מופעלים עשוי לתרום אותות הרקע בניתוח, אשר יכול להיות בעיה במיוחד כאשר תאי T אנטיגן ספציפיים היעד הם נדירים. נכון לעכשיו, קיים יישום מוגבל של שיטה זו בתאי CD4 T ספציפיים ל- HBV4. השאלה אם ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לנתח תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV באופן אמין זקוקה לחקירה נוספת.

הגישה השלישית מבוססת על הפרשת הציטוקינים לאחר גירוי פפטיד אנטיגן. בדומה לניתוח מבוסס סמן המושרה על-ידי הפעלה, שיטה זו אינה מוגבלת על-ידי אפיטופים מאומתים. שיטה זו יכולה לחשוף ישירות את פרופיל הציטוקינים של תאי T ספציפיים לאנטיגן. הרגישות של שיטה זו נמוכה יותר מאשר השיטה מבוססת סמן המושרה הפעלה כפי שהוא מסתמך על הפרשת ציטוקינים של תאי T ספציפיים אנטיגן ומספר ציטוקינים נבדק מוגבל בדרך כלל. נכון לעכשיו, שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב בניתוח של תאי T ספציפיים ל- HBV. כמו ציטוקינים הפרשת תאי T ספציפיים HBV בקושי ניתן לזהות על ידי גירוי פפטיד ex vivo ישיר10,11, פרופיל ציטוקינים של תאי T ספציפיים HBV מנותח בדרך כלל לאחר 10 ימים במבחנה פפטיד מגורההרחבה 12,13,14,15,16. סידור של בריכות פפטיד בצורת מטריצה נוצל כדי להקל על זיהוי של אפיטופים ספציפיים אנטיגן17,18. עם השילוב של מטריצת פפטיד וניתוח הפרשת ציטוקינים, פותחה שיטה להערכת תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV ולזיהוי אפיטופים ספציפיים ל- CD4 T-cell בו זמנית16. בפרוטוקול זה, הפרטים של שיטה זו מתוארים. אנטיגן הליבה HBV נבחר כדוגמה של הדגמה בפרוטוקול זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל מטופל שנכלל במחקר. פרוטוקול המחקר תואם את ההנחיות האתיות של הצהרת הלסינקי משנת 1975, כפי שבאו לידי ביטוי באישור מוקדם של ועדת האתיקה הרפואית של בית החולים סאות'ווסט.

1. עיצוב מטריצת הפפטיד שמקורה ב-HBV

  1. הורד רצפי חומצות אמינו של אנטיגן הליבה HBV ממסדי נתונים NCBI (GenBank: AFY98989.1).
  2. רכישת פפטידים שמקורם באנטיגן ליבה HBV (פאנל של פפטידים 15-mer חופפים על ידי 10 שאריות, טוהר > 90%, 4 מ"ג / פפטיד) מספק שירות סינתזת פפטיד.
  3. הגדר מטריצת פפטיד מרובעת של 6×6 עם כל מיקום במטריצה המכילה פפטיד אחד בלבד. ישנן 12 בריכות פפטיד: 6 בריכות פפטיד בשורה ו-6 בריכות פפטידים, 5-6 פפטידים בכל בריכה16. בריכות הפפטיד בשורה ובריכות הפפטיד בעמודה במטריצה מייצגות 2 תצורות נפרדות של אנטיגן ליבת HBV.
  4. עבור 3/4 של פפטידים שנרכשו, לערבב פפטידים באותה שורה / עמודה של המטריצה לתוך 12 בריכות פפטיד נפרדות על ידי המסת אותם יחד דימתיל סולפוקסיד (DMSO) (2 מיקרוגרם / μL עבור כל פפטיד). יש לאחסן ב- -80 °C לניתוח תגובות תאי T ספציפיים ל- CD4 HBV.
  5. ממיסים את שאר הפפטידים בנפרד (10 מיקרוגרם/מיקרו-לן) ומאחסנים ב-80 מעלות צלזיוס לזיהוי אפיטופ.

2. בידוד של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs)

  1. דגימה 5 מ"ל של דם ורידים מחולי זיהום HBV כרוניים.
    הערה: נפח הדם צריך להיות מוערך בערך על פי מספר בריכות פפטיד בתוספת 1 בקרת רקע ושליטה חיובית אחת. ניתוח של מאגר פפטיד אחד צריך 3 x 105 מחשבים אישיים. בממוצע, 1 x 106 PBMCs ניתן להשיג מ 1 מ"ל של דם.
  2. בודדו מחשבים אישיים מדם באמצעות צנטריפוגה הדרגתית הדרגתית בצפיפות פיקול (800 × גרם, 20 דקות) והקפאו מחשבי PBMCs מבודדים בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר.
  3. השתמש פיפטה פסטר כדי לאסוף גרנולוציטים בין שכבת פיקול ברורה לשכבת תא הדם האדום. לחלץ DNA גנומי מגרנולוציטים באמצעות ערכת טיהור DNA גנומית על פי פרוטוקול היצרן.
  4. שלח את דגימת הדנ"א לספקי שירותי genotyping כדי לקבוע את הגנוטיפ HLA-DRB1.

3. הרחבה במבחנה של מחשבים אישיים באמצעות מטריצת פפטיד HBV

  1. הפשר מחשבים אישיים.
    1. RPMI חם 1640 בתוספת 1:10,000 בנזונאז (25 U/mL) עד 37 °C (50 °F) באמבט מים.
      הערה: בנזונאז עוזר להגביל את גושי התאים במהלך ההפשרה. כל מדגם ידרוש 20 מ"ל של RPMI 1640 עם בנזונאז. חשב את הסכום הדרוש להפשרת כל הדגימות, והכן aliquot נפרד של מדיה (37 °C) עם 1:10,000 בנזונאז (25 U / mL). להפשיר לא יותר מ-5 דגימות בכל פעם.
    2. הסר דגימות חנקן נוזלי ולהפשיר במהירות בקבוקונים קפואים באמבט מים (37 °C (37 °F).
    3. העבר את השעיית התא המופשרת לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. הוסף 1 מ"ל של בנזונאז RPMI 1640 (37 °C) טיפה לצינור. לאט להוסיף 6 מ"ל של RPMI RPMI 1640 בנזונאז (37 °C) לצינור הצנטריפוגה, לשטוף cryovial עם עוד 2 מ"ל של RPMI 1640 בנזונאז (37 °C) כדי לאחזר את כל התאים. המשך עם שאר הדגימות מהר ככל האפשר.
      הערה: דילול איטי של דגימות cryopreserved הוא המפתח כדי לשמור על הכדאיות של תאים מופשרים.
    4. צנטריפוגה (400 × גרם, 10 דקות), להסיר את supernatant, ולשחרר את הכדור על ידי הקשה על הצינור.
    5. בעדינות resuspend הכדור ב 1 מ"ל של RPMI RPMI 1640 בנזונאז חם. מערבבים בעדינות ומסננים תאים באמצעות מסננת תאים של 70 מיקרומטר במידת הצורך (כלומר, אם קיים גוש גלוי).
    6. Aliquot השעיה 10 μL לדלל מלוחים פוספט של Dulbecco חוצץ (DPBS), להוסיף כחול טריפן (0.04%), לטעון על hemocytometer, לחכות 1 דקה, ולספור את מספר התאים קיימא (תאים ברורים).
    7. הוסף 9 מ"ל של RPMI RPMI 1640 בנזונאז (37 °C) לצינור, צנטריפוגה (400 × גרם, 10 דקות), להסיר את supernatant, ולשחרר את הכדור על ידי הקשה על הצינור.
  2. PBMCs resuspend ב RPMI 1640 בתוספת 25 mM HEPES, 2 mM L-גלוטמין, 1 mM נתרן pyruvate, 100 פניצילין U / mL, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, ו 10% סרום AB אנושי (מדיום תרבות מלאה). התאם את צפיפות התאים ל- 1.5 x 106 תאים/מ"ל. צלחת PBMCs בלוחות 96-באר (תחתון שטוח) בצפיפות של 3 x 105 תאים / טוב.
  3. הוסף בריכות פפטיד נגזר HBV (2 מיקרוגרם / מ"ל עבור כל פפטיד יחיד) לכל באר. עבור בארות של בקרת רקע ושליטה חיובית, הוסף את אותה כמות ממס (DMSO, 1 μL / mL). הוסף 10 U /mL IL-2 ו 10 ננוגרם / מ"ל IL-7. דגירה ב 37 °C (5°F) ו 5% CO2.
  4. ביום 3, תוספת תרבות בינוני עם 50 U/mL של IL-2 ו 10 ננוגרם / מ"ל של IL-7.
    הערה: במהלך היום הראשון עד יום 3, לא תצפה התפשטות ברורה של תאי T. מספר התא הכולל יקטן בדרך כלל ב- 1/3 עד 1/2, עקב מותם של תאים שאינם T כגון תאי B, תאי NK, תאי NKT ומונוציטים.
  5. ביום 7, החליפו חצי מהמדיום התרבותי במדיום טרי המכיל פפטידים (4 מיקרוגרם/מ"ל), IL-2 (100 U/mL) ו-IL-7 (20 ננוגרם/מ"ל).
    הערה: כדי למנוע הפרעה לתאים בתחתית, pipette על 90 μL של תרבות בינוני בזהירות מהחלק העליון של המדיום. במהלך היום 3 עד יום 7, התפשטות תאי T חזקה תיצפה, ותאי T מתרבים בדרך כלל מצטברים כדי ליצור אשכולות.
  6. ביום 10, בעדינות pipette תרבית תאים בכל באר 7-9 פעמים כדי disaggregate אשכולות תאים, לספור את מספר התאים קיימא, ולהעביר2×10 5 תאים בכל באר ללוח 96 באר (תחתית עגולה) עבור ניתוח תגובת תאי T-T ספציפי HBV.
  7. המשך פולחן שאר התאים לזיהוי אפיטופ ביום 12, להתאים את נפח של מדיום תרבית עד 100 μL (השלכת מדיום מוגזם), ותוספת תרבות עם 100 μL של מדיום תרבות מלאה טרי המכיל פפטידים (4 מיקרוגרם / מ"ל), IL-2 (100 U / mL), ו IL-7 (20 ננוגרם / מ"ל).
    הערה: במהלך היום 7 עד יום 10, תאי T ממשיכים להתרבות במרץ. החלף את מדיום התרבות כמו בשלב 3.5 אם המדיום הופך צהוב. באופן כללי, מספר התא יעלה על 6×105 ביום 10. כל באר מציגה בדרך כלל מספר תא דומה, סופרת מספר תא ב- 3 בארות ומשתמשת בערך הממוצע כהערכה של מספר התא עבור כל הבארות.

4. ניתוח תגובות תאי T-T ספציפיים ל- CD4 HBV על ידי ציטומטריית זרימה תאית

  1. מחשבים אישיים מגרה עם בריכות פפטיד
    1. עבור התאים שהועברו ללוח 96 באר (תחתית עגולה), לשטוף 3 פעמים בצלחת (550 × גרם, 3 דקות). השתמש 200 μL של בינוני עבור כל לשטוף (RPMI 1640 עבור 2 שטיפות הראשונות, תרבות מלאה בינונית עבור הכביסה האחרונה). זרוק את אנטנטי העל.
      הערה: הסרת ציטוקינים שיורית בתרבות על ידי כביסה חוזרת עלולה להפחית ביעילות את הרקע בניתוח ציטומטריית זרימה תאית.
    2. עבור כל באר של תאים מגורה עם בריכת פפטיד ספציפית, להוסיף 200 μL של מדיום תרבות מלאה בתוספת אותן בריכות פפטיד (2 מיקרוגרם / מ"ל עבור כל פפטיד יחיד). לקבלת הבאר של בקרת רקע, להוסיף מדיום תרבות מלאה בתוספת 1 μL / mL של DMSO. עבור הבאר של שליטה חיובית, להוסיף מדיום תרבות מלאה בתוספת 1 μL / mL של DMSO, 150 ng / mL של פורבול 12-myristate 13-אצטט (PMA), ו 1 מיקרומול / L של ionomycin.
      הערה: מינון גבוה של DMSO יחסום את הפרשת ציטוקינים של תאי T (המשמעותי ביותר עבור TNF-α). מינון של DMSO גבוה מ 5 μL / mL אינו מומלץ. בדרך כלל, המינון של DMSO בניסוי שלנו אינו עולה על 1 μL / mL.
    3. דגירה ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2 עבור 6 שעות.
    4. לאחר שעה אחת של דגירה, להוסיף Monensin (1.37 מיקרוגרם / מ"ל) לתרבות.
  2. ציטומטריית זרימה
    1. אחרי 6 שעות של דגירה. הסר supernatant לאחר צנטריפוגה (550 ×, 3 דקות), לשטוף תאים פעם אחת עם 200 μL של DPBS (550 × גרם, 3 דקות), סמני משטח כתם (CD3, CD4, ו- CD8) וסמן קיימא (באמצעות צבע קיימא תיקון) במקרר 4 °C למשך 30 דקות.
    2. לשטוף פעם אחת עם 200 μL של DPBS (550 × גרם, 3 דקות). לתאים מקובעים ומחלחלים, ולהכתים ציטוקינים תאיים (TNF-α ו-IFN-γ) במקרר של 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
    3. לאחר השטיפה הסופית בהכתמה תאית, תאים resuspend ב 150 μL של חוצץ cytometry זרימה (DPBS + 0.5% BSA).
    4. השג נתוני ציטומטריית זרימה על ציטומטר זרימה.
  3. ניתוח תוצאות ציטומטריית הזרימה
    1. הגדרה של טוב חיובי: שקול גם כמו חיובי אם יש לו תדירות של ציטוקינים הפרשת תאי T לפחות פעמיים של בקרת הרקע היטב (איור 1).
    2. על פי הנוסחה הבאה, חשב את שיעור התגובה עבור כל ציטוקין שנותח (איור 2):
      figure-protocol-1
      הערה: מאגר הפפטיד בשורה ובריכות הפפטיד בעמודה במטריצה מייצגות 2 תצורות נפרדות של אנטיגן ליבה HBV, כך שקצב התגובה הסופי צריך להיות מחולק ב- 2.

5. זיהוי אפיטופים מוגבלים של תאי T HLA-DR HLA-DR

  1. להפשיר ולשמור על קווי תאים לימפובלסטואידים B אלוגניים (BLCLs) בבקבוקון T-75 (5-20 ×106 תאים, 20 מ"ל של מדיום תרבית מלאה).
    הערה: כדי להבטיח את המצב הטוב של BLCLs, שלב זה צריך להיות יזם 2 שבועות לפני הפשרת PBMCs של חולים. BLCLs חייב להיות הומוזיגוס ב אליל HLA-DRB1. על פי התוצאה genotyping, חולים צריכים לחלוק את אותו אלל HLA-DRB1 כמו BLCLs.
  2. הקרנת פפטידים מועמדים לזיהוי (איור 3)
    1. על פי תוצאות שיעור התגובה לתאי T ביום 10, לסנן 2 בריכות פפטיד עם שיעור התגובה הגבוה ביותר (בריכת פפטיד שורה 1 ובריכת פפטיד 1 עמודה).
    2. הגדר את הפפטיד ב 2 בריכות אלה כמו פפטיד מועמד אם מאגר פפטיד האחר המכיל פפטיד זה גם מראה תוצאה חיובית בניתוח תגובת תא T. השתמש PBMCs מורחב עם מאגר פפטיד אחרים לזיהוי epitope מאוחר יותר.
  3. BLCLs פועם עם פפטיד
    1. ביום 12, לספור את מספר BLCLs קיימא, להעביר תאים צינורות צנטריפוגות 15 מ"ל, צנטריפוגה (350 × גרם, 10 דקות) ולהסיר את supernatant. resuspend את גלולה התא במדיום תרבות מלאה, ו aliquot BLCLs לצלחת 96-well (תחתית עגולה) ב 4×104 תאים / גם במדיום תרבות מלאה 80 μL.
    2. הוסף פפטיד יחיד (10 מיקרוגרם / מ"ל), דגירה ב 37 °C (5% CO2 עבור 2 שעות. הגדר 2 בקרת רקע: פפטיד פועם עם חסימת HLA-DR (טיפול מקדים עם אנטי HLA-DR (10 מיקרוגרם / מ"ל) עבור 1 שעה); DMSO (1 μL/mL) פועם. הנפח הסופי של מדיום תרבות שלמה בכל באר הוא 100 μL.
    3. הוסף mitomycin C (100 מיקרוגרם / מ"ל), דגירה ב 37 °C ו 5% CO2 עבור 1 שעה.
    4. לשטוף 3 פעמים עם 200 μL של RPMI 1640 (550 × גרם, 3 דקות) בצלחת כדי להסיר פפטיד לא פעמו mitomycin C. עבור לשטוף הראשון, להשלים את תרבות הדגירה עם 100 μL של RPMI 1640.
    5. תאים resuspend ב 120 μL של מדיום תרבות מלאה.
  4. PBMCs מגרה עם BLCLs פעום פפטיד.
    1. ביום 12, להעביר PBMCs לצלחת 96 באר (תחתית עגולה).
    2. הסר את supernatant לאחר צנטריפוגה (550 × גרם, 3 דקות) בצלחת, לשטוף פעמיים עם 200 μL של RPMI 1640 (550 × גרם, 3 דקות) בצלחת.
      הערה: הסרת שאריות ציטוקינים ופפטידים בתרבות על ידי כביסה חוזרת היא הצעד העיקרי להקטנת הרקע בניתוח ציטומטריית זרימה תאית. במיוחד עבור פפטידים שיורית, זה יהיה להיקשר BLCLs ולהגדיל באופן משמעותי את הרקע.
    3. מחשבי PBMd resuspend בכל באר עם 210 μL של מדיום תרבות מלאה.
    4. עבור הבאר של PBMCs שנבחרו לזיהוי epitope, לערבב את aliquot (70 μL כל אחד) עם BLCLs פעימה פפטיד (3 בארות, כולל 2 פקדי רקע).
      הערה: ביום 12, מספר בריכות הפפטידים המורחבות PBMCs יגיע בדרך כלל מעל 5-7×105 לבאר, כך היחס של PBMCs / BLCLs הוא על 6/1 עד 4/1.
    5. דגירה ב 37 °C (5° C) ו 5% CO2 עבור 6 שעות.
    6. לאחר שעה אחת של דגירה, להוסיף Monensin (1.37 מיקרוגרם / מ"ל) לתרבות. הנפח הסופי של מדיום תרבות שלמה בכל באר הוא 200 μL.
  5. ציטומטריית זרימה
    1. חזור על אותן פעולות כמו בשלב 4.2.
  6. ניתוח תוצאות ציטומטריית הזרימה
    1. אמת פפטיד כאפיטופה מוגבלת של תאי T CD4 מוגבלים של HLA-DR אם מחשבי PBMCs דוגרים עם BLCLs פפטידי זה פעמו להראות תדירות של ציטוקינים מפרישים תאי CD4 T לפחות פעמיים של PBMCs דגירה עם פקדי רקע (פפטיד פועם עם HLA-DR מראש חסימה; DMSO פועם) (איור 4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

התדירות של תאי CD4 T מפרישים ציטוקינים מחושבת כסכום של מפיקים בודדים ומפיקים כפולים. כפי שהודגם באיור 1, התדירות של תאי CD4 T4 T מפרישים α ותדירות תאי ה-CD4 T מפרישים Γ IFN בבקרת רקע (DMSO) הם 0.154% ו-0.013% בהתאמה. התדירות של תאי CD4 T4 מפרישים α TNF והתדירות של IFN-γ מפריש תאי CD4 T ספציפיים למאגר פפטיד Core11 הם 0.206 ו- 0.017 בהתאמה, כך שגם TNF-α הפרשת תגובת תאי T של CD4 וגם תגובת תאי T של Γ IFN-γ להפרישת CD4 T-cell עבור מאגר פפטיד זה נחשבים שליליים. התדירות של תאי CD4 T4 T4 מפרישים α ו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול זה מפורטים באופן הבא: 1) מספיק מחשבי PBMCs בעלי כדאיות גבוהה כדי להתחיל הרחבת מחשבים אישיים; 2) סביבה מתאימה להרחבת מחשבים אישיים; ו -3) הסרה מלאה של שאריות בריכות פפטיד בתרבות PBMCs לפני זיהוי אפיטופ.

כל הניתוח בפרוטוקול זה תלוי בשגשוג החזק של תאי CD4 T. באופן כללי, מספר מחשבי PBMCs לאחר הרחבה של 10 ימים יהיה פי 2-3 מהמספר ההתחלתי. מספר התא והיכולת של מחשבים אישיים הם 2 גורמי מפתח בהרחבת מחשבים אישיים. אם המטרה היא רק לנתח תאי CD4 T ספציפיים ל- HBV ללא זיהוי אפ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81930061), הקרן למדעי הטבע צ'ונגצ'ינג (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) ומפתח סיני
פרויקט מתמחה במחלות זיהומיות (2018ZX10723203).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
אלבומין בקר V (BSA)BeyotimeST023
מצומד APC אנטי אנושי TNF-& אלפא;eBioscience17-7349-82שמור מוגן מפני אור
בנזונאז נוקלאזסיגמא-אולדריץ'E1014הגבל
קווי תאים לימפובלסטואידים B גושים (BLCs)מרכז פרד האצ'ינסון לחקר הסרטןHLA-DRB1*0803
קווי תאים לימפובלסטואידים מסוג B הומוזיגוט B (BLCLs)המרכז לחקר הסרטן פרד האצ'ינסוןHLA-DRB1*1202 הומוזיגוט
בקבוק תרבית תאים (T75)קורנינג
(96 בארות, תחתית שטוחה)קורנינג3599תחתונה שטוחה
(96 בארות, תחתית עגולה)קורנינג3799תחתונה עגולה
קורנינגCLS431751גודל נקבוביות 70  μ m, לבן,
צינור צנטריפוגה סטרילי (15 מ"ל)KIRGENKG2611
צינור צנטריפוגה סטרילי (50 מ"ל)סטרילית 430829 קורנינג
Eppendorf5804R
ThermoST16Rמקוררת
, קירורThermoLegend Micro 21R
ערכת ציטופיקס/ציטופרם (סט מאגר גורמי שעתוק)BD Biosciences562574הכן תמיסה לפני השימוש
דימתיל סולפוקסיד (DMSO)Sigma-AldrichD2650שמור בטמפרטורת החדר כדי למנוע התגבשות
Dulbecco' s תמיסתמכינים ddH2O (1000 מ"ל) המכילים NaCl (8000 מ"ג), KCl (200 מ"ג), KH2PO4 (200 מ"ג) ו-Na2HPO4.7H2O (2160  מ"ג). התאם את ה-PH ל-7.4. לעקר באמצעות חיטוי.
Ficoll-Paque PremiumGE Healthcare17-5442-03
טיפים לסינון (0.5-10)KirgenKG5131
טיפים לסנן סטרילי (100-1000)KirgenKG5333
טיפים לסנן סטרילי (1-200)KirgenKG5233
סטרילי מצומד FITC אנטי אנושי CD4BioLegend300506שמור מוגן מפני אור
צבע כדאיות ניתן לתיקון eFluor780eBioscience65-0865-14שמור מוגן מפני
אור מעכב הובלת חלבון GolgiStop (המכיל מוננסין)BD Biosciences554724מעכב הובלת חלבון
המוציטומטרמותג718620
HBV ליבת אנטיגןפפטידים סיןפפטידים
HEPESGibco15630080100 מ"ל
סרום אנושי ABGemini Bio-Products100-51100 מ"ל
יונומיציןסיגמא-אולדריץ'I0634
KClסנגון ביוטקA100395-0500
KH2PO4סנגון ביוטקA100781-0500
LSRציטומטר
L-גלוטמיןGibco25030081שפופרת
מיקרוצנטריפוגה 100 מ"ל (1.5 מ"ל)קורנינגMCT-150-Cעיקור חיטוי לפני השימוש
ב-MicroplateShakers ScientificIndustries MicroPlate Genie
Mitomycin CRoche10107409001
Na2HPO4.7H2OSangon BiotechA100348-0500
NaClSangon Biotechצינורות A100241-0500
PCR (0.2 מ"ל)KirgenKG2331
מצומד PE/Cy7 אנטי אנושי CD8BioLegend300914שמור מוגן מפני אור
מצומד PE IFN-&גמא אנטי אנושי;eBioscience12-7319-42שמור מוגן מפני אור
פניצילין סטרפטומיציןGibco15140122100 מ"ל
מצומד PerCP-Cy5.5 אנטי אנושי CD3eBioscience45-0037-42שמור מוגן מפני אור
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)Sigma-AldrichP1585
רקומביננטי אנושי IL-2PeproTech200-02
רקומביננטי אנושי IL-7PeproTech200-07
RPMI בינוני 1640GibcoC11875500BT500 מ"ל
נתרן פירובט, 100 מ"מGibco15360070
טריפן כתם כחול (0.4%)Gibco15250-061
Ultra-LEAF מטוהר אנטי אנושי HLA-DRBioLegend307648
Wizard DNA גנומי ערכת טיהורPromegaA1125
IHW09126 IHW09121 צלחת תרבית תאים 430641 צלחת תרבית תאים מסננת תאים צנטריפוגה , צנטריפוגה מקוררת , צנטריפוגה מלח חוצצת פוספט זרימה BD

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
  2. Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, Baltimore, Md. 5863-5871 (2004).
  3. Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
  4. Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998(2017).
  5. Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
  6. Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
  7. Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
  8. Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
  9. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
  10. Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
  11. Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
  12. Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
  13. Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
  14. de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
  15. Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
  16. Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
  17. Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
  18. Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

CD4 T HBVHLA DRPBMCsFicollB

מאמרים קשורים