גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

Chizu Makino Nakamoto; Masaru Nakamoto

doi:10.3791/62399

מאמר שיטה

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

DOI:

10.3791/62399

⸱

18 במאי 2022

Chizu Makino Nakamoto¹ , Masaru Nakamoto¹

¹Department of Biology, Valparaiso University

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשתית האפרוחים היא כבר מזמן מערכת מודל חשובה בנוירוביולוגיה התפתחותית, עם יתרונות הכוללים את גודלה הגדול, התפתחותה המהירה ונגישותה להדמיה ולמניפולציות ניסיוניות. עם זאת, המגבלה הטכנית העיקרית שלה הייתה היעדר גישות חזקות לאובדן תפקוד עבור ניתוח תפקודי גנים. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה של השתקת גנים ברשתית האפרוחים המתפתחת הכוללת ביטוי מהונדס של מיקרו-רנ"א מלאכותי (miRNAs) באמצעות מערכת טרנספוזון Tol2. בגישה זו, פלסמיד טרנספוזון Tol2 המכיל קלטת ביטוי לסמן EmGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק אמרלד) ורצפי קדם-miRNA מלאכותיים כנגד גן מטרה מוכנס לרשתית האפרוח העוברי עם מבנה ביטוי טרנספוזאז Tol2 על ידי באלקטרופורציה של אובו . בתאי הרשתית הנגועים, הטרנספוזואז מזרז את כריתת קלטת הביטוי מווקטור הטרנספוזון ושילובה בכרומוזומי המאכסן, מה שמוביל לביטוי יציב של miRNA וחלבון EmGFP. במחקר הקודם שלנו, הראינו כי הביטוי של Nel, גליקופרוטאין המפעיל פונקציות מרובות בהתפתחות עצבית, יכול להיות מדוכא באופן משמעותי ברשתית אפרוח מתפתחת באמצעות טכניקה זו. התוצאות שלנו מצביעות על כך שמתודולוגיה זו גורמת לדיכוי יציב וחזק של ביטוי גנים ובכך מספקת גישה יעילה של אובדן תפקוד למחקרים על התפתחות הרשתית.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

רשתית בעלי החוליות היא מערכת מודל חשובה לחקר התפתחות עצבית. למרות מיקומה ההיקפי, הרשתית היא שלוחה אנטומית והתפתחותית של מערכת העצבים המרכזית, ועצב הראייה, המורכב מאקסונים של תאי גנגליון ברשתית, מייצג מערכת בתוך מערכת העצבים המרכזית. לרשתית האפרוחים יתרונות משמעותיים כמערכת מודל לחקר המנגנון המולקולרי של ההתפתחות העצבית: היא גדולה ומתפתחת במהירות; יש לו דמיון מבני ופונקציונלי לרשתית האנושית; הוא נגיש מאוד עבור ויזואליזציה ומניפולציות ניסיוניות. מנגנונים מולקולריים של התרבות תאים והתמיינותם, מורפוגנזה והנחיית אקסונים במהלך ההתפתחות העצבית נחקרו בהרחבה באמצעות רשתית העוף.

בשני העשורים האחרונים נעשה שימוש מוצלח באלקטרופורציה כדי להחדיר גנים חוץ רחמיים לתאים בעובר האפרוח המתפתח. טכניקה זו מאפשרת תיוג של תאים מתפתחים, מעקב אחר גורל התא ומעקב אחר נדידת תאים ודרכי אקסונים, כמו גם ביטוי גנים חוץ רחמי לניתוח in vivo של תפקוד גנים. התנאים של אלקטרופורציה לביטוי גנים חוץ רחמי יעיל בעוברי אפרוחים נקבעו היטב ^1,2,3.

למרות יתרונות אלה, היעדר טכניקת אובדן תפקוד יציבה למחקרים על תפקוד גנים היה מגבלה טכנית משמעותית של עובר האפרוח. בעוד שעוברי אפרוחים שהתחשמלו באמצעות רנ"א מפריע קטן (siRNAs)⁴ או וקטורי ביטוי לרנ"א קצר סיכת שיער (shRNAs)⁵ מראים הפלה של גן המטרה, דיכוי גנים בגישות אלה הוא חולף מכיוון שההשפעות נעלמות ברגע שהתאים מאבדים את הרנ"א או הדנ"א שהוכנסו. דיכוי גנים יציב יותר יכול להיות מושג על ידי העברת siRNA לעוברי אפרוחים על ידי RCAS (Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus (ASLV) long terminal repeat (LTR) with a Splice acceptor) retrovirus^{system 6}. הווקטור הנגיפי משתלב בגנום המארח, והגנים החוץ-רחמיים באים לידי ביטוי יציב. עם זאת, הרטרו-וירוס יכול להשתלב בגנום של תאים מתחלקים רק בשלב המיטוטי (M) של מחזור התא, מה שעשוי להטיל מגבלה על שלבי ההתפתחות ו / או סוגי התאים שעבורם ניתן ליישם גישה זו של אובדן תפקוד. בנוסף, ביטוי טרנסגנים על ידי RCAS נראה איטי יותר ופחות חזק מזה המושרה על ידי אלקטרופורציה⁷.

טרנספוזונים הם אלמנטים גנטיים הנעים ממקום אחד בגנום למשנהו. אלמנט Tol2 הוא חבר במשפחת האלמנטים הניתנים לטרנספוזון hAT ומכיל גן פנימי המקודד טרנספוזאז המזרז את תגובת הטרנספוזון^{של אלמנט} Tol2 8. כאשר וקטור פלסמיד הנושא קלטת ביטוי גנים שמשני צדדיה רצפים של הקצה השמאלי והימני של יסודות Tol2 (200 bp ו-150 bp, בהתאמה) מוכנס לתאי חוליות עם מבנה ביטוי טרנספוזאז Tol2, קלטת הביטוי נכרתת מהפלסמיד ומשולבת בגנום המארח, אשר תומך בביטוי יציב של הגן החוץ רחמי (איור 1). הוכח כי היסוד הטרנספוזי Tol2 יכול לגרום לטרנספוזיציה גנטית ביעילות רבה במינים שונים של בעלי חוליות, כולל דגי זברה^9,10, צפרדעים 11, אפרוחים 12 ועכברים ¹³^, ולכן הוא שיטה שימושית של טרנסגנזה ומוטגנזה החדרתית. מערכת הטרנספוזון Tol2 שימשה בהצלחה להפלה מותנית של גן מטרה על ידי אינטגרציה גנומית של siRNA המעובד מ-RNA דו-גדילי ארוך¹⁴.

פרוטוקול זה מתאר גישת אובדן תפקוד בעובר אפרוח הכוללת החדרת מיקרו-רנ"א מלאכותי (miRNAs) על ידי מערכת טרנספוזון Tol2^15,16. בגישה זו, קלטת ביטוי עבור סמן EmGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק אמרלד) ו- miRNA מלאכותי כנגד גן מטרה משובטת לווקטור טרנספוזון Tol2. לאחר מכן מכניסים את מבנה הטרנספוזון Tol2 לרשתית הגוזל העוברי עם מבנה ביטוי טרנספוזון Tol2 על ידי באלקטרופורציה של אובו. בתאי הרשתית הנגועים, הטרנספוזואז מזרז את כריתת קלטת הביטוי מווקטור הטרנספוזון ושילובה בכרומוזומי המאכסן, מה שמוביל לביטוי יציב של miRNA וחלבון EmGFP. במחקרים הקודמים שלנו, הצלחנו להפיל את הביטוי של Nel, גליקופרוטאין חוץ-תאי המתבטא בעיקר במערכת העצבים, ברשתית האפרוח המתפתחת (ראו תוצאות מייצגות). התוצאות שלנו מצביעות על כך שניתן להשיג דיכוי גנים יציב ויעיל באמצעות טכניקה זו.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. בניית וקטורי ביטוי miRNA

הערה: ההליכים לבניית וקטורי ביטוי miRNA (שלבים 1.1-1.3, 1.5-1.6.) ממוטבים עבור ערכת ביטוי miRNA, ערכת ביטוי miR של Block-iT Pol II miR עם EmGFP, כפי שתואר קודם לכן^15,16. הערכה מספקת את וקטור הביטוי שנועד לאפשר ביטוי miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), וקטור בקרה (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), ריאגנטים נלווים והוראות לייצור וקטורי ביטוי miRNA (ראה טבלת חומרים)¹⁷.

תכנון אוליגוס DNA חד-גדילי המקודד קדם-miRNA כנגד גן המטרה: תכנון אוליגוס DNA חד-גדילי (אוליגוס "גדיל עליון" (אוליגוס "קדם-miRNA מטרה") ואוליגוס "גדיל תחתון" (משלים של אוליגוס גדיל עליון)) באמצעות הכלי המקוון RNAi Designer (ראה טבלת חומרים). ראו איור 2 עבור המאפיינים הנדרשים של אוליגוס חד-גדילי (איור 2A) ודוגמאות של רצפי מטרה (איור 2B).
הערה: מומלץ ליצור 5-10 רצפי קדם-miRNA עבור גן מטרה נתון ולבצע סינון עבור פעילויות knockdown in vitro (שלב 1.4).
חישול האוליגוס העליון והתחתון ליצירת אוליגו דו-גדילי
1. הגדר את תגובת החישול הבאה (טבלה 1) בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 0.5 מ"ל.
2. יש לדגור על תערובת התגובה בטמפרטורה של 95°C למשך 4 דקות. אנאל את האוליגוס הגדיל העליון והתחתון כדי ליצור אוליגו דו-גדילי על ידי מתן אפשרות לתערובת התגובה להתקרר לטמפרטורת החדר (RT) למשך 5-10 דקות. צנטריפוגה את הדגימה בקצרה (~ 5 שניות).
  הערה: ניתן לאחסן את האוליגוס המחושלים בטמפרטורה של -20°C ללא התפרקות למשך שנה לפחות.
שיבוט האוליגוס הדו-גדילי לווקטור ביטוי miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (מסופק בערכת ביטוי miRNA)): שיבוט אוליגוס דו-גדילי בודדים לווקטור ביטוי miRNA ליניארי, על פי מדריך היצרן¹⁷.
הערכה של השפעות דפיקה
הערה: מומלץ לבדוק רצפי miRNA בודדים ליעילות דיכוי גנים במבחנה לפני שהם מיושמים באובו. ניתן לבדוק את יעילות ההדבקה על ידי הדבקת פלסמידים של ביטוי miRNA לקו תאים המבטא את גן המטרה. לחלופין, פלסמידים בודדים של ביטוי miRNA יכולים להיות מועתקים לשורות תאים עם מבנה ביטוי עבור גן המטרה. עבור גני מטרה המקודדים חלבונים שאינם מעוגנים בקרום במצבם הטבעי (למשל, חלבונים מסיסים), חלבון היתוך אלקליין פוספטאז (AP) יכול לשמש לניטור הביטוי של חלבון המטרה. רצף cDNA המקודד את חלבון המטרה יכול להתיך במסגרת לפוספטאז אלקליין שליה אנושי בווקטורים של תגי AP (APtag-1- APtag-5; ראו טבלת חומרים) ולהחדיר אותו לתאים¹⁸. כאשר הוא מבוטא בתאי תרבית (למשל, תאי HEK293T), חלבון המטרה המתויג ב-AP מופרש ברמות גבוהות לאמצעי התרבית, וכך ניתן להעריך את ההשפעות של רצפי miRNA על ידי מדידת הירידה בפעילות AP במצע התרבית של תאים נגועים ב-miRNA (תת-שלבים 1.4.1-1.4.4).
1. תרבית HEK293T תאים בצלחת של 24 בארות (8 x 10⁴ תאים / באר) למשך הלילה. העבר את התאים באופן זמני עם מבני ביטוי miRNA בודדים עם פלסמיד ביטוי של חלבון מטרה המתויג AP. השתמש בפלסמיד הבקרה השלילי pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (המסופק בערכת ביטוי miRNA) כבקרה. (אם נעשה שימוש בקווי תאים המבטאים ביציבות חלבון מטרה המתויג AP, יש להדביק את התאים רק באמצעות מבני ביטוי miRNA בודדים).
  הערה: מגיב lipofection קונבנציונאלי (ראה טבלה של חומרים) משמש transfection.
2. יש לאסוף את התווך המותנה 48-72 שעות לאחר הטרנספקציה ולנטרל בחום את פעילות AP האנדוגנית באמבט מים של 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. פסולת ספין-אאוט במיקרו-צנטריפוגה שולחנית במהירות מרבית למשך 5 דקות.
3. אגרו את הסופרנאטנט עם 10 mM HEPES, pH 7.0 והעבירו אותו דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
4. קח 100 μL (למדידה בקורא לוחות) או 500 μL (עבור ספקטרופוטומטר) של supernatant והוסף כמות שווה של 2x מאגר מצע AP (טבלה 2). בדוק את פעילות נקודת הגישה על-ידי מדידת OD₄₀₅ בקורא לוחות או בספקטרופוטומטר.
  הערה: אם פעילות AP של התווך המותנה גבוהה מדי למדידה מדויקת, דללו אותו עם חיץ HBAH (תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), אלבומין בסרום בקר 0.5 מ"ג/מ"ל, HEPES של 20 מילימטר (pH 7.0)) או חיץ אחר המכיל חלבון נשא. אין להשתמש במאגרים המכילים פוספט (לדוגמה, PBS) מכיוון שפוספט אנאורגני פועל כמעכב תחרותי של AP.
שרשור של רצף miRNA
הערה: ניתן לשפר את אפקט ההפלה על ידי שרשור miRNA שונים כנגד אותו גן מטרה או חזרה על אותו miRNA. וקטור ביטוי miRNA תומך בשרשור של רצפי קדם-miRNA מרובים ובביטוי הקו-ציסטרוני שלהם¹⁷.
1. שרשרו שני רצפי קדם-miRNA שונים (כנגד אותו גן מטרה) המראים את פעילות הפליטה הגבוהה ביותר במבחני מבחנה (שלב 1.4), בהתאם להוראות היצרן¹⁷.
2. להעריך את יעילות דיכוי הגנים של המבנים המשורשרים באמצעות בדיקות חוץ גופיות כמתואר בשלב 1.4. אם שלושה רצפי קדם-miRNA או יותר מראים פעילויות נוק-דאון גבוהות באופן דומה, בדוק שילובים שונים של שני רצפים והשתמש בשילובים המראים את פעילות הדפיקה הגבוהה ביותר (ראה תוצאות מייצגות).
העברת קלטת הביטוי EmGFP-pre-miRNA לווקטור טרנספוזון Tol2
הערה: קלטת הביטוי המכילה את EmGFP cDNA ושני רצפי pre-miRNA מועברת לווקטור טרנספוזון Tol2 (וקטור pT2K-CAGGS, ראה טבלת חומרים). לשם כך, קלטת הביטוי (המקיפה מקצה 3' של מקדם CMV לאתר פריימר הריצוף ההפוך miRNA של וקטור ביטוי miRNA) מוגברת באמצעות פריימרים עם אתר אנזים הגבלה מלאכותי, ומוצר ה- PCR משובט לווקטור טרנספוזון Tol2. וקטור הטרנספוזון Tol2 מכיל את מקדם CAGGS שנמצא בכל מקום, המניע את הביטוי של קלטת הביטוי שהוכנסה. מקדם CAGGS וקלטת הביטוי מוקפים ברצפי Tol2 (איור 1).
1. הגברה PCR של קלטת ביטוי EmGFP-pre-miRNA: עקוב אחר הגדרת התגובה ותנאי התרמו-מחזור המתוארים בטבלה 3.
2. חברו את מוצר ה-PCR המטוהר בג'ל (כ-1.3 קילו-בתים) לווקטור טרנספוזון Tol2 המעוכל באנזים הגבלה. אלקטרופורציה של הפלסמיד לתאי E. coli מתאימים (ראה טבלת חומרים) ובחר את הרקומביננטים (מבני pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA).
3. הכינו את הפלסמיד באמצעות ערכת maxiprep קונבנציונלית (ראו טבלת חומרים). בדוק את המבנה והרצף של הפלסמיד על ידי מיפוי הגבלה ועל ידי שימוש בפריימרים המשמשים ל- PCR, בהתאמה.

2. אחסון ביצים ודגירה

רכשו ביצים מופרות של לגהורן לבן (Gallus gallus) מחוות מקומיות או מספקים מסחריים.
הערה: ביצים ניתן לשמור ב 12-16 ° C או ב 4 ° C עד שבוע לפני הדגירה ללא אובדן משמעותי של כדאיות או עיכוב בפיתוח במהלך הדגירה.
תייגו את הביציות עם תאריך תחילת הדגירה וסמנו את הצד העליון של הביצית (היכן ימוקם העובר). לדגור על ביציות מופרות במצב אופקי ב 38 ° C עד העוברים הגיעו המבורגר והמילטון (HH) שלבים 10 (33-38 שעות) -11 (40-45 שעות)¹⁹.

3. באלקטרופורציה

הכנה לאלקטרופורציה
1. הכנת תמיסה ירוקה מהירה 0.25%: ממיסים 25 מ"ג FCF ירוק מהיר ב-10 מ"ל PBS. סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר. ניתן לאחסן את הפתרון ב- RT.
2. קוקטייל DNA: הכינו את תמיסת ההזרקה על ידי ערבוב פלסמידים בודדים pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA (תת-שלב 1.6.3) עם פלסמיד ביטוי טרנספוזאז Tol2 (וקטור pCAGGS-T2TP; ראו טבלת חומרים) (5 מיקרוגרם/μL כל אחד) ביחס של 2:1. הוסף נפח 1/10 של תמיסה ירוקה מהירה 0.25% כדי להמחיש את האזור המוזרק.
  הערה: ריכוז הדנ"א האופטימלי עשוי להשתנות בהתאם למבנים.
3. הגדרת מנגנון המיקרו-הזרקה (איור 3A,B): מנגנון המיקרו-הזרקה מורכב מהדברים הבאים (ראו טבלת חומרים): מזרק המילטון, מחט 18 גרם (אורך מחט = 2 אינץ'), צינורות PVC (פוליוויניל כלוריד) (אורך 2 ס"מ), מחט מיקרופיפטה (ניתן לבצע על ידי משיכת צינורות נימים עם סיבי אומגה נקודה (1 מ"מ O.D. X 0.75 מ"מ I.D) עם מושך מיקרופיפטה).
  1. ממלאים מזרק המילטון בשמן מינרלי כבד. חבר מחט 18 גרם למזרק ומלא את החלל הפנימי של המחט בשמן על ידי לחיצה על בוכנת המזרק.
  2. חברו חתיכה של צינור PVC באורך 2 ס"מ לקצה המחט ומלאו את הצינור בשמן.
  3. חבר מחט מיקרופיפטה משוכה לצינור. נתקו את קצה מחט המיקרופיפטה לקוטר של 10-20 מיקרומטר על ידי מלקחיים עדינים ליצירת פתח קטן. ממלאים את המחט כולה בשמן.
    הערה: יש להקפיד לא ללכוד בועות אוויר במערכת, מכיוון שהן יעכבו את זרימת תמיסת ה- DNA.
4. שים 5 μL של קוקטייל DNA צבעוני (substep 3.1.2) על צלחת פטרי סטרילי. תחת המיקרוסקופ המנתח, מניחים את קצה מחט המיקרופיפטה בתמיסת הדנ"א על צלחת הפטרי הסטרילית ומושכים לאט את התמיסה לתוך המחט.
5. חכו עד שהלחץ יתאזן בתוך המחט ומחוצה לה (כדי למנוע כניסת אוויר למחט) והוציאו את קצה המחט מתמיסת הדנ"א. שמור את קצה המחט שקוע PBS סטרילי בכד קטן עד הזרקה.
6. הגדרת מכשיר האלקטרופורציה (איור 3A,C):
  1. הגדר זוג אלקטרודות פלטינה עם מחזיק אלקטרודות על מיקרומניפולטור. התאימו את המרווח בין קצה האלקטרודות ל-2 מ"מ (איור 3C,E).
  2. חבר את האלקטרודות למחולל פולסי גל מרובע באמצעות כבלים (ראה טבלת חומרים).
מיקרו-הזרקה של תמיסת דנ"א (איור 3D)
1. מוציאים ביצת תרנגולת מהאינקובטור ומנגבים את פני הביצה בנייר טישו ספוג באתנול 70%.
2. חבר מחט 18 גרם למזרק 10 מ"ל. הכניסו את המחט דרך הקצה הקהה של הביצה, בזווית כלפי מטה (45°) כדי למנוע פגיעה בחלמון.
3. למשוך 2-3 מ"ל של אלבומין מן הביצה. אטמו את החור עם חתיכת סקוטש טייפ. אשרו כי העובר והקרום הוויטליני מנותקים מהקליפה על ידי "קשירת" הביצית באור.
4. מוציאים חתיכת קליפת ביצה (עיגול בקוטר 2-3 ס"מ) מראש הביצה בעזרת מספריים ומלקחיים כדי לחשוף את העובר. אין לשלוח יותר מחמש ביציות בכל זמן נתון כדי למנוע התייבשות של עוברים במהלך התחשמלות.
  הערה: אם קשה לפתוח חלון מבלי לפצח את הביצה, ניתן לכסות את כל החלק העליון של הביצה בסרט סלוטאפה או סקוטש לפני הסרת חתיכת קליפת ביצה.
5. הכניסו את קצה המחט לשלפוחית האופטית מצדה הפרוקסימלי בזווית של 45°, והזריקו את קוקטייל הדנ"א על-ידי לחיצה איטית (או הקשה על) הבוכנה עד שתמיסה בצבע כחול תמלא את הלומן (איור 3D).
  הערה: לחלופין, ניתן להשתמש במערכת מיקרו-הזרקת לחץ (ראה טבלת חומרים) להזרקת תמיסות DNA.
6. משוך את המחט והחזיר את קצהו ל- PBS.
אלקטרופורציה (איור 3E)
1. הגדר פרמטרי פולס של האלקטרופורטור כדלקמן: מתח: 15 V, אורך פולס: 50 מטר/שניה, מרווח פעימה: 950 מטר/שניה, מספר פולס: 5
2. הוסיפו כמה טיפות של HBSS על קרום ויטלין מעל העובר. הורידו את האלקטרודות לתוך HBSS באמצעות המיקרומניפולטור, בניצב לציר הקדמי-אחורי של העובר.
  הערה: לחלופין, הליך זה יכול להיעשות מבלי להוסיף HBSS, שכן אלבומין הוא מוליך חשמלי טוב המאפשר אלקטרופורציה יעילה.
3. מקמו את האלקטרודות משני הצדדים (הצד הקדמי (האף) והצד האחורי (הרקתי) של שלפוחית הראייה (איור 3E). ודא שהאלקטרודות אינן נוגעות בעובר או בכלי הדם. החל שדות חשמליים פועמים.
4. הסר את האלקטרודות ונקה בעדינות את האלקטרודות עם ניצן צמר גפן סטרילי ספוג מים כדי למנוע הצטברות אלבומין.
5. אוטמים את החלון עם סקוטש טייפ ודגורים מחדש על העובר עד לשלב ההתפתחותי הרצוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

בניית מבני טרנספוזון Tol2 לביטוי miRNA מלאכותי כנגד Nel
Nel (Neural Epidermal growth factor (EGF)-Like; ידוע גם בשם Nell2) הוא גליקופרוטאין חוץ-תאי. יש לו דמיון מבני עם thrombospondin-1 והוא בא לידי ביטוי בעיקר במערכת העצבים^20,21. הוכחנו בעבר כי Nel מווסת התמיינות והישרדות של תאי גנגליון רשתית¹⁵ ופועל כרמז מנחה מעכב עבור אקסונים ברשתית^22,23,24

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

פרוטוקול זה מספק מדריך מפורט להשתקת גנים ברשתית האפרוחים המתפתחת על ידי ביטוי מהונדס של miRNA מלאכותי באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2.

הגורמים הבאים הם בעלי חשיבות קריטית בביצוע טכניקה זו בהצלחה. ראשית, קריטי להשתמש ברצפי miRNA שאושרו כבעלי השפעות חזקות של הפלה. לפני החלתם עבור אלקטרופורציה באובו , בדוק רצפי קדם-miRNA בודדים עבור יעילות דיכוי גנים במבחני מבחנה (שלב 1.4) ושרשר שני רצפי קדם-miRNA המראים את פעילויות ההפלה הגבוהות ביותר (שלב 1.5). שנית, חשוב ל...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הווקטורים pT2K-CAGGS ו-pCAGGS-T2TP סופקו באדיבות על ידי יושיקו טקהאשי (אוניברסיטת קיוטו, קיוטו, יפן) וקואיצ'י קוואקאמי (המכון הלאומי לגנטיקה, מישימה, יפן), בהתאמה. אנו מודים למיכאל ברברוגלו על קריאתו המכרעת של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהחברה המלכותית ומועצת המחקר לביוטכנולוגיה ומדעי הביולוגיה (BBSRC) (בריטניה) ל- M.N.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מחט 18 G, ערכת 2 אינץ'	VWR	89219-320
ערכת AP-TAG ערכת A ו-AP-TAG B	GenHunter Corp	Q201 ו-Q202	וקטורי פלסמיד לייצור חלבוני היתוך AP (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)
Block-iT RNAi Designer	Invitrogen		כלי מקוון לבחירת רצפי יעד ותכנון רצפי קדם-miRNA (https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)
BSA 10 מ"ג	כבלי סיגמא-אולדריץ'	A2153
C115CB כבלי	Sonidel	C115CB
	Sonidel	C117
https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼252 צינורות נימיים עם סיבי אומגה נקודות (מחטי מיקרופיפטה)	FHC	30-30-1	1 מ"מ OD 0.75 מ"מ תעודת זהות
CUY21 אלקטרופורטור גל מרובע	Nepa Gene	CUY21
דיאתנולמין (pH 9.8)	Sigma-Aldrich	D8885
ניתוח מיקרוסקופ
ביצית חממה	Kurl	B-Lab-600-110
מחזיק אלקטרודות	https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html Sonidel	CUY580	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼85
אלקטרודות	Nepa Gene	CUY611P3-1	https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼94
Electromax DH10B	Invitrogen	18290-015	תאי E. coli Electrocompetence
FCF	Sigma-Aldrich	F7258
ביצי עוף מופרות (Gallus gallus)	מתקבל מספקים מסחריים (למשל נהר צ'ארלס) או מחקלאים
מקור
FuGene 6 מגיב טרנספקציה	Promega	E2691
מזרק המילטון (50 μ L)	Sigma-Aldrich	20715	Hamilton Cat No 80901
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס	Sigma-Aldrich	H6648
שמן מינרלי כבד	Sigma-Aldrich	330760
HEPES	GIBCO	15630080
L-הומארגינין	Sigma-Aldrich	H10007
MgCl2	Sigma-Aldrich	13112
מיקרומניפולטור	Narishige (יפן)	MM3	http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html
חולץ מיקרופיפטה	מכשיר תריס	P97
p-ניטרופנילפוספט	סיגמא-אולדריץ'	20-106
PBS	סיגמא-אולדריץ'	D8662
pCAGGS-T2TP וקטור			פלסמיד ביטוי טרנספוזאז Tol2. מתנה נדיבה של קואיצ'י קוואקמי (המכון הלאומי לגנטיקה, יפן). זמין גם מ-Addgene.
Pfu	ThermoFisher	F566S
Picospritzer (אופציונלי)	מערכת מיקרו-הזרקת לחץ	פרקר
ערכת מקסי פלסמיד	Qiagen	12163	ערכת מקסיפרפ פלסמיד
pT2K-CAGGS וקטור			טרנספוזון Tol2. מסופק בחביבות על ידי יושיקו טקהאשי (אוניברסיטת קיוטו, יפן)
צינורות PVC	VWR (בריטניה)	228-3830
Spectinomycin	Sigma-Aldrich	S9007-5
T4 DNA ligase	Promega	M1801
ערכת ביטוי ה- RNA BLOCK-iT Pol II miR עם K493600			EmGFP Invitrogenמכיל את וקטור ביטוי ה-miRNA (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), וקטור בקרה (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-פלסמיד בקרה שלילי), ריאגנטים אביזרים והוראות (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)
ציקלר

https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id¼254-C117מקומייםאור סיבי צוואר אווז תרמי

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 230, 376-380 (1997).
Funahashi, J., et al. Role of Pax-5 in the regulation of a mid-hindbrain organizer's activity. Development, Growth & Differentiation. 41 (1), 59-72 (1999).
Harada, H., Omi, M., Nakamura, H. In ovo electroporation methods in chick embryos. Methods in Molecular Biology. 1650, 167-176 (2017).
Hu, W. Y., Myers, C. P., Kilzer, J. M., Pfaff, S. L., Bushman, F. D. Inhibition of retroviral pathogenesis by RNA interference. Current Biology. 12 (15), 1301-1311 (2002).
Katahira, T., Nakamura, H. Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system. Development, Growth & Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).
Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Developmental Biology. 6, 2(2006).
Nakamura, H., Funahashi, J. Introduction of DNA into chick embryos by in ovo electroporation. Methods. 24, 43-48 (2001).
Koga, A., Iida, A., Hori, H., Shimada, A., Shima, A. Vertebrate DNA transposon as a natural mutator: the medaka fish Tol2 element contributes to genetic variation without recognizable traces. Molecular Biology and Evolution. 23 (7), 1414-1419 (2006).
Kawakami, K., Shima, A., Kawakami, N. Identification of a functional transposase of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish, and its transposition in the zebrafish germ lineage. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (21), 11403-11408 (2000).
Kawakami, K., et al. A transposon-mediated gene trap approach identifies developmentally regulated genes in zebrafish. Developmental Cell. 7 (1), 133-144 (2004).
Kawakami, K., Imanaka, K., Itoh, M., Taira, M. Excision of the Tol2 transposable element of the medaka fish Oryzias latipes in Xenopus laevis and Xenopus tropicalis. Gene. 338 (1), 93-98 (2004).
Sato, Y., et al. Stable integration and conditional expression of electroporated transgenes in chicken embryos. Developmental Biology. 2 (2), 616-624 (2007).
Kawakami, K., Noda, T. Transposition of the Tol2 element, an Ac-like element from the Japanese medaka fish Oryzias latipes, in mouse embryonic stem cells. Genetics. 166 (2), 895-899 (2004).
Hou, X., et al. Conditional knockdown of target gene expression by tetracycline regulated transcription of double strand RNA. Development, Growth & Differentiation. 53, 69-75 (2011).
Nakamoto, C., et al. Nel positively regulates the genesis of retinal ganglion cells by promoting their differentiation and survival during development. Molecular Biology of the Cell. 25 (2), 234-244 (2014).
Nakamoto, M., Nakamoto, C. iRetinal Development: Methods and Protocols. Vol. 2092 Methods in Molecular Biology. Mao, C. -A. 8, Springer. 91-108 (2020).
BLOCK-iT PolII miR RNAi Expression Vector Kits, User Manual Pol II miR RNAi Expression Vector Kits. Invitrogen. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/blockit_miRNAexpressionvector_man.pdf&title=BLOCK-iT&trade (2021).
Flanagan, J. G., et al. Alkaline phosphatase fusions of ligands or receptors as in situ probes for staining of cells, tissues, and embryos. Methods in Enzymology. 327, 19-35 (2000).
Hamburger, V., Hamilton, H. I. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a M(r) 93 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 203 (2), 212-222 (1995).
Matsuhashi, S., et al. New gene, nel, encoding a Mr 91 K protein with EGF-like repeats is strongly expressed in neural tissues of early stage chick embryos. Developmental Dynamics. 207 (2), 233-234 (1996).
Jiang, Y., et al. In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel. Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).
Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions. Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).
Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue. Development. 146 (4), (2019).
Yee, J. K., et al. Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

In Ovo MicroRNA

גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

במאמר זה

סיכום

תקציר

מבוא

פרוטוקול

תוצאות

דיון

גילויים

תודות

חומרים

מקורות

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמרים קשורים