ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי חלבוני נפוץ לאחר תרגום (PTM) המעורב בוויסות של מספר מסלולים תאיים, כולל עיבוד RNA, התמרת אותות, תגובת נזק לדנ"א, ביוגנזה של miRNA ותרגום.
בשנים האחרונות, הודות להתפתחויות ביוכימיות ואנליטיות, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות (MS) התגלתה כאסטרטגיה היעילה ביותר לאפיון מתיל פרוטאום תאי ברזולוציה של אתר יחיד. עם זאת, זיהוי ויצירת פרופיל של חלבון in vivo R-methylation על ידי טרשת נפוצה נותר מאתגר ומועד לטעויות, בעיקר בשל האופי הסובסטואיכיומטרי של שינוי זה ונוכחותם של תחליפי חומצות אמינו שונים ומתיל-אסטריפיקציה כימית של שאריות חומציות שהן איזובריות למתילציה. לפיכך, נדרשות שיטות העשרה לשיפור הזיהוי של R-מתיל-פפטידים ואסטרטגיות אימות אורתוגונליות להפחתת שיעורי גילוי כוזב (FDR) במחקרי מתיל-פרוטאומיקה.
כאן מתואר פרוטוקול שתוכנן במיוחד לזיהוי וכמות של R-מתיל-פפטידים בביטחון גבוה מדגימות תאים, אשר משלב תיוג מטבולי של תאים עם מתיונין בקידוד איזוטופים כבד (hmSILAC) ועיכול כפול של פרוטאז בתמיסה של תמצית תאים שלמים, ולאחר מכן פיצול כרומטוגרפיה לא מקוונת של שלב הפוך ב-pH גבוה (HpH-RP) והעשרת זיקה של R-מתיל-פפטידים באמצעות נוגדנים נגד פאן-R-מתיל. לאחר ניתוח טרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה, נתונים גולמיים מעובדים תחילה עם חבילת התוכנה MaxQuant והתוצאות מנותחות לאחר מכן על ידי hmSEEKER, תוכנה המיועדת לחיפוש מעמיק של זוגות שיא MS המתאימים למתיל-פפטיד קל וכבד בתוך קבצי הפלט MaxQuant.
מבוא
ארגינין (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי (PTM) המעטר כ-1% מהפרוטאום של היונקים1. חלבון ארגינין מתיל-טרנספראזות (PRMTs) הם האנזימים המזרזים את תגובת המתילציה של R על ידי תצהיר של קבוצת מתיל אחת או שתיים לאטומי החנקן (N) של חבורת הגואנידינו בשרשרת הצדדית של R באופן סימטרי או אסימטרי. ביונקים, ניתן לקבץ PRMTs לשלוש מחלקות - סוג I, סוג II וסוג III - בהתאם ליכולתם להפקיד הן מונו-מתילציה (MMA) והן די-מתילציה אסימטרית (ADMA), MMA ודי-מתילציה סימטרית (SDMA) או רק MMA,בהתאמה 2,3. PRMT מתמקדים בעיקר בשאריות R הממוקמות באזורים עשירים בגליצין וארגינין, הידועים כמוטיבים של GAR, אך PRMTs מסוימים, כג....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. גידול תאים ומיצוי חלבונים (זמן: 3 - 4 שבועות נדרשים)
- לגדל תאי HeLa במקביל במדיה המסופקת עם מתיונין קל (L) או כבד (H), בהתאמה ( ראה טבלה 1 להרכב מדיה). לאחר לפחות שמונה חלוקות תאים, לאסוף aliquot של תאים מכל ערוץ SILAC ולבצע את בדיקת השילוב.
הערה: כדי לבדוק את יעילות השילוב, בדוק על-ידי ניתוח LC-MS/MS שאחוז המתיונין הכבד (Met-4) בערוץ הכבד קרוב ככל האפשר ל-100%. נתח אליקוט של תאים בעלי תווית כבדה על-ידי LC-MS/MS (לקבלת הגדרות, ראה טבלה 2), ולאחר מכן עבד את נתוני MS באמצעות MaxQuant באמצעות הפרמטרים המצוינים בטבלה 3. כדי לבדוק את שילוב Met-4 סקריפט מפותח פנימי זמין ב- https://bitbucket.org/EMassi/hmseeke....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
המאמר מתאר תהליך עבודה לזיהוי בביטחון גבוה של חלבון R-מתילציה גלובלי, המבוססת על שילוב של העיכול האנזימטי של תמצית החלבון עם שני פרוטאזות נפרדות במקביל, ולאחר מכן פיצול כרומטוגרפיה נוזלית של HpH-RP של פפטידים פרוטאוליטיים והעשרת זיקה חיסונית של פפטידים R-מתיל עם נוגדנים נגד פאן-R-מתיל (איור 1).
התאים גודלו בנוכחות מתיונין, טבעי (קל, L, Met-0) או מסומן איזוטופית (כבד, H, Met-4). לאחר תיוג איזוטופי מלא, אשר נבדק על ידי ניתוח טרשת נפוצה על אליקוט קטן של תמצית Met-4 ב.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה של חלבון in vivo /פפטיד על ידי פרוטאומיקה גלובלית מבוססת MS הוא מאתגר, בשל הסיכון ל-FDR גבוה, כאשר מספר תחליפי חומצות אמינו ומתיל-אסטריפיקציה מתרחשים במהלך הכנת הדגימה שהם איזובריים למתילציה ועלולים לגרום להקצאות שגויות בהיעדר אסטרטגיות אימות MS אורתוגונליות. האופי התת-איצ'יומטרי של PTM זה מסבך עוד יותר את המשימה של מתיל-פרוטאומיקה גלובלית, אך ניתן להתגבר עליה באמצעות העשרה סלקטיבית של פפטידים10 שעברו שינוי.
כאן מוצגת זרימת עבודה .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
MM ו- EM הם תלמידי דוקטורט בבית הספר האירופי לרפואה מולקולרית (SEMM). EM הוא הזוכה של 3 שנים FIRC-AIRC bursary (קוד הפרויקט: 22506). ניתוחים גלובליים של R-מתיל-פרוטאומים בקבוצת השחפת נתמכים על ידי מענק AIRC IG (קוד הפרויקט: 21834).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| אמוניום ביקרבונט (AMBIC) | סיגמא-אולדריץ' | 09830 | |
| אמוניום פרסולפט (APS) | סיגמא-אולדריץ' | 497363 | |
| C18 עמודי ספ-פאק vacc 6 סמ"ק (1 גרם) | מים | WAT036905 | |
| קולואידלי מכתים קומאסי אינסטנט | סיגמא-אולדריץ' | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, ללא EDTA | רוש-סיגמא אולדריץ' | 11836170001 | מעכב פרוטאז |
| סרום בקר עוברי בדיאליזה (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM בינוני | GIBCO ThermoFisher | מבוקש | עם גלוטמין יציב וללא מתיונין |
| מערכת כרומטוגרפיה EASY-nano LC 1200 | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC עמודות | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| תאי HeLa | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| יודואצטמיד (IAA) | סיגמא-אולדריץ' | 144-48-9 | |
| יופיטר C12-RP עמודה | פנומנקס | 00G-4396-E0 | |
| L-מתיונין | סיגמא-אולדריץ' | M5308 | קל (L) מתיונין |
| L-מתיונין-(מתיל-13C,d3) | סיגמא-אולדריץ' | 299154 | כבד (H) מתיונין |
| ליסרג'ינאז | Merck Millipore | EMS0008 | |
| סוניפיקטור משבש תאים מיקרוטיפ 250 | ברנסון | ||
| N,N,N′,N′ -Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| פניצילין-סטרפטומיצין | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | מעכב פוספטאז | 4906837001 |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% חומצה פורמית (v/v) באצטוניטריל, בדרגת | LC-MSThermoFisher | 85175 | LC-MS ממס B |
| פירס 0.1% חומצה פורמית (v/v) במים, LC-MS דרגה | ThermoFisher | 85170 | LC-MS ממס A |
| פירס אצטוניטריל (ACN), LC-MS דרגת | ThermoFisher | 51101 | |
| פירס מים, LC-MS כיתה | ThermoFisher | 51140 | |
| פוליאקרילאמיד | סיגמא-אולדריץ' | 92560 | |
| דיוק פלוס חלבון כל תקני החלבון הצבוע | הכחול Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan נוגדנים וטכנולוגיית | איתות תאי | 13474 | |
| PTMScan נוגדנים וטכנולוגיית איתות תאי אלפא;-MMA | 12235 | ||
| PTMScan נוגדנים α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF היברידי Quadrupole-Orbitrap Mass ספקטרומטר | ThermoFisher | ||
| רצף כיתה שונה Trypsin | Promega | V5113 | |
| חומצה טריפלואורואצטית | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 | HPLC Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| רכז ואקום 5301 | Eppendorf | Speed Vac |
מקורות
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
