ניתן להשתמש במדיום כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) בשילוב עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות כדי לצפות באגרגטים חיידקיים ברזולוציה גבוהה. מאמר זה מפרט שיטות להערכת אוכלוסיות מצטברות במהלך טיפול מיקרוביאלי כפלטפורמה למחקרים עתידיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
כלים להערכה בזמן אמת של מודל זיהום פסאודומונס ארוגינוזה
במאמר זה
סיכום
תקציר
פסאודומונס ארוגינוזה (Pa) הוא אחד הפתוגנים האופורטוניסטיים הנפוצים ביותר הקשורים סיסטיק פיברוזיס (CF). ברגע שהקולוניזציה של הרשות הפלסטינית נקבעת, חלק גדול מהחיידקים הנגועים יוצרים ביופילמים בתוך כיח דרכי הנשימה. Pa biofilms מבודד כיח CF הוכח לגדול אגרגטים קטנים, צפופים של ~ 10-1,000 תאים כי הם מאורגנים מרחבית ולהציג פנוטיפים רלוונטיים קלינית כגון סובלנות מיקרוביאלית. אחד האתגרים הגדולים ביותר בחקר האופן שבו אגרגטים של הרשות הפלסטינית מגיבים לסביבת הכיח המשתנה הוא היעדר מערכות רלוונטיות וחזקות מבחינה תזונתית המקדמות היווצרות מצטברת. באמצעות מדיום כיח CF סינתטי (SCFM2), ניתן לראות את היסטוריית החיים של אגרגטים Pa באמצעות מיקרוסקופיה סריקת לייזר confocal (CLSM) וניתוח תמונה ברזולוציה של תא אחד. מערכת במבחנה זו מאפשרת התבוננות באלפי אגרגטים בגדלים משתנים בזמן אמת, בשלושה ממדים ובקנה מידה מיקרון. ברמות הפרט והאוכלוסייה, היכולת לקבץ אגרגטים לפי פנוטיפ ומיקום מאפשרת תצפית של אגרגטים בשלבים התפתחותיים שונים ותגובתם לשינויים במיקרו-סביבה, כגון טיפול אנטיביוטי, יובדלו בדיוק.
מבוא
פסאודומונס ארוגינוזה (Pa) הוא פתוגן אופורטוניסטי המבסס זיהומים כרוניים אצל אנשים שנפגעו ממערכת החיסון. עבור אלה עם המחלה הגנטית סיסטיק פיברוזיס (CF), זיהומים אלה יכולים להתפרש במהלך החיים. CF גורם להצטברות של כיח צמיג, עשיר בחומרים מזינים בדרכי הנשימה, אשר הופך קולוניאלי על ידי מגוון רחב של פתוגנים מיקרוביאליים לאורך זמן. Pa הוא אחד הפתוגנים הנפוצים ביותר CF, ליישב את דרכי הנשימה בגיל הרך ולהקים זיהומים קשים לטיפול1. הרשות הפלסטינית נותרהבעיהקלינית משמעותית ונחשבת לסיבה מובילה לתמותה אצל בעלי CF, למרות משטרי טיפול משופרים בשנים האחרונות 2,3. פנוטיפ התמדה זה וסובלנות אנטיביוטית גוברת זיכו את אבא במקום בקבוצת פתוגנים שזוהו הן על ידי המרכז לבקרת מחלות (CDC) והן על ידי ארגון הבריאות העולמי (WHO) כסדרי עדיפויות מחקריים לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות - פתוגנים ESKAPE4.
כמו פתוגנים אחרים ESKAPE, עמידות לאנטיביוטיקה נרכשת נפוצה ברשות הפלסטינית, אבל יש גם תכונות מהותיות רבות התורמות Pa סובלנות מיקרוביאלית. בין אלה היא היכולת של הרשות הפלסטינית ליצור אשכולות צפופים מאוד של ~ 10-1,000 תאים, אשר ניתן לראות בזיהומים מרובים, כולל כיח חולה CF5,6. בדומה ל-Pa שנחקרה במערכות ביופילם אחרות, אגרגטים של הרשות מציגים פנוטיפים רלוונטיים קלינית כגון עמידות מוגברת לאנטיביוטיקה והפעלה של תקשורת תאית (חישת מניין (QS)). לדוגמה, אגרגטים של Pa הוכחו להשתמש בהתנהגויות מוסדר QS כדי להילחם חיידקים אחרים, כמו גם לסבול טיפולים מיקרוביאלית כגון הייצור של פיוצינין7. היכולת לחקור התנהגויות כאלה מציעה תובנה מרגשת על מערכות אקולוגיות חיידקיות בסביבה דומה לזו שבה הן קיימות בגוף האדם.
אחד האתגרים הגדולים ביותר בחקר האופן שבו אגרגטים של הרשות הפלסטינית מגיבים לסביבת הכיח המשתנה הוא היעדר מערכות רלוונטיות וחזקות מבחינה תזונתית המקדמות היווצרות מצטברת. הרבה ממה שידוע על אבא התגלה באמצעות מערכות במבחנה שבהן תאים גדלים פלנקטונית או בארכיטקטורה אופיינית המחוברת לפני השטח, "פטריות" שלא נצפתה ב- vivo8. בעוד שמודלים קלאסיים לצמיחה של ביופילם, כגון תאי זרימה או אגר מוצק, הניבו ידע נרחב ויקר ערך על התנהגויות חיידקים ומנגנונים של סובלנות אנטיביוטית, ממצאים אלה לא תמיד מתורגמים ב- vivo. מודלים במבחנה רבים יש יכולת מוגבלת לחקות את סביבת הצמיחה של אתר הזיהום האנושי, המחייב יקר במחקרים vivo. בתורו, דגמים רבים ב- vivo חסרים את הגמישות והרזולוציה המוענקות על ידי טכניקות במבחנה.
כיח סיסטיק פיברוזיס סינתטי (SCFM2) נועד לספק סביבה לצמיחת Pa דומה לזו שחוו במהלך זיהום כרוני בריאת CF. SCFM2 כולל מקורות תזונתיים שזוהו CF סייחה צפויה בנוסף mucin, שומנים, ו- DNA. צמיחת הרשות הפלסטינית ב- SCFM2 דורשת גן כמעט זהה לזה הנדרש לצמיחה בליחה בפועל ותומכת במבנה טבעי של הרשות הפלסטינית 9,10. לאחר החיסון, תאים פלנקטוניים יוצרים אגרגטים הגדלים בגודלם באמצעות התרחבות. תאים בודדים (המכונים מהגרים) משתחררים מצבירה, נודדים לאזורים לא נוסעים ויוצרים אגרגטים חדשים10. ניתן לצפות בהיסטוריית חיים זו באמצעות CLSM וניתוח תמונה ברזולוציה של תא בודד. אגרגטים של Pa שנוצר ב- SCFM2 הם בגדלים דומים לאלה שנצפו בריאת CF10. מודל זה מאפשר תצפית של אגרגטים מרובים בגודל משתנה בזמן אמת ובשלושה ממדים בקנה המידה המיקרוני. מיקרוסקופיה של זמן-לשגות מאפשרת מעקב אחר אלפי אגרגטים (כ-50,000) בניסוי אחד. השימוש בתוכנת ניתוח תמונה מאפשר כימות של פנוטיפים מצטברים ממיקרוגרפים, כולל נפח מצטבר, שטח פנים ומיקום בשלושה ממדים ל- 0.1 מיקרומטר הקרוב ביותר, הן במצטבר האישי והן ברמת האוכלוסייה. לאחר היכולת לקבץ אגרגטים לפי פנוטיפ ומיקום מאפשרת הבחנה של אגרגטים בשלבים התפתחותיים שונים עם דיוק, כמו גם את תגובתם microenvironment משתנה6,11.
היישום של SCFM2 ללמוד אגרגטים Pa בנפח נמוך ובוחות תפוקה גבוהה להפוך אותו מודל גמיש, חסכוני. כמדיום מוגדר, SCFM2 מציע אחידות ושחזור על פני פלטפורמות מרובות, מתן שיטה רלוונטית מבחינה תזונתית ופיזית ללמוד אגרגטים Pa במבחנה9. היישומים כוללים את השימוש בו בשילוב עם CLSM כדי לבחון ארגון מרחבי וסובלנות אנטיביוטית ברזולוציה גבוהה (כמתואר בנייר שיטות זה). היכולת לבצע ניסויים המספקים נתונים בקנה מידה מיקרוני בזמן אמת מאפשרת לחקור אינטראקציות בין מינים ובין מינים כפי שהם עשויים להתרחש ב vivo. לדוגמה, SCFM2 שימש בעבר כדי ללמוד את הדינמיקה המרחבית של תקשורת תא-תאים באוכלוסיות צבירה באמצעות רשת של מערכות המשמשות את הרשות הפלסטינית כדי לווסת גנים מרובים התורמים virulence ופתוגנזה6.
איור 1: תיאור גרפי של השלבים הניסיוניים העיקריים. (A)SCFM2 מחוסן בתאי Pa ומותר ליצור אגרגטים בצלחת תרבות עם תחתית זכוכית. (B)אגרגטים מועברים למיקרוסקופ הקונפוקלי, ומתווסף אנטיביוטיקה. מתוארים שלושה העתקים טכניים (תאים 1-3) ובאר שליטה (4) של SCFM2 מחוסן ללא טיפול אנטיביוטי. אגרגטים מצולם באמצעות CLSM במהלך 18 שעות. (C) לאחר ההדמיה הראשונית של 18 שעות, אגרגטים מטופלים עם פרופיל יודיד כדי לדמיין תאים מתים ותמונה באמצעות CLSM (D)אגרגטים עם פנוטיפ הרצוי מופרדים SCFM2 באמצעות FACS. קיצורים: SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סינתטי כיח בינוני; Pa = פסאודומונס ארוגינוזה; CLSM = מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית; FACS = מיון תאים המופעל על-ידי פלואורסצנטיות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
כאן, השירות של SCFM2 כדי לחקור את ההשפעה של טיפול אנטיביוטי על אגרגטים Pa בזמן אמת מוכח, ואחריו שימוש בגישה של מיון תאים כדי לבודד אוכלוסיות של אגרגטים עם פנוטיפים ברורים לניתוח במורד הזרם (איור 1).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכן סיסטיק פיברוזיס סינטטי בינוני (SCFM2)
הערה: הכנת SCFM2 כוללת שלושה שלבים עיקריים המפורטים להלן (איור 2). לפרטים מלאים והאזכורים, ראה9,10,12.
איור 2: הכנה וחיסון של SCFM2 בינוני. (A)בסיס חוצץ מוכן באמצעות מלחים וחומצות אמינו המפורטים בטבלה 1 ושולחן 2. בסיס חוצץ יכול להיות מאוחסן ב 4 °C (5 °F) עד 30 ימים, אבל חייב להיות מוגן מפני חשיפה לאור. (B)Mucin ו- DNA מתווספים ל- aliquot של בסיס חוצץ ומומסים לפתרון בן לילה ב 4 °C. (C)שומנים ומלאי נוסף מתווספים לפתרון הלילה ודגרו ב 37 °C עם תסיסה ב 250 סל"ד במשך 20 דקות. SFCM2 מחוסן לאחר מכן עם תאים שטופים, שלב יומן ב OD600 = 0.05. קיצורים: SCFM2 = סיסטיק פיברוזיס סיחום בינוני סינתטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
- עיקור של מוצין חזירי
- הכן מוצין סטרילי בריכוז סופי של 5 מ"ג /מ"ל ב- SCFM2. לדוגמה, עבור נפח 5 מ"ל של SCFM2, לשקול 25 מ"ג של mucin סוג II בצלחת פטרי סטרילית, ולהניח לתוך עיקור אולטרה סגול (UV) במשך 4 שעות, בעדינות נסער כל שעה.
- לאחר 4 שעות, להעביר את mucin שטופלו UV לתוך autoclaved 1.7 mL צינורות בתנאים סטריליים, ולאחסן ב -20 °C (50 °F).
- כדי לאשר עיקור מלא, להמיס מדגם של mucin בנוזל סטרילי, כגון מים או לוריא ברטאני (LB) מרק, ולהתבונן תחת מיקרוסקופ.
הערה: mucin מעוקר ניתן לאחסן ב -20 °C (70 °F) עד 6 חודשים.
- הכנת בסיס במאגר
- הכן מלח וחומצות אמינו פתרונות מלאי על ידי הוספת הכמויות המתאימות לפי משקל למים deionized כמפורט בטבלה 1. מסנן לעקר את כל פתרונות המלאי באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, לעטוף בנייר כסף כדי להגן מפני השפלת אור, ולאחסן ב 4 °C (70 °F) עד חודש אחד.
- הכן בסיס חוצץ על ידי שילוב של 190 מ"ל של מים דהיוניים עם חומצות אמינו ופתרונות מלאי מלח לפי נפחים המפורטים בטבלה 1. התאם את הפתרון ל- pH 6.8 והגדל לנפח סופי של 250 מ"ל. מסנן לעקר באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר, ולאחסן ב 4 °C (50 °F) עד 30 ימים.
- בערב שלפני הניסוי, aliquot את הכמות הרצויה של בסיס חוצץ לתוך בקבוקון תרבות זכוכית, ולהוסיף mucin (5 מ"ג / מ"ל כמתואר בשלב 1.1.1) ו DNA זרע סלמון מטוהר (0.6 מ"ג / מ"ל). להתסיס בעדינות, לעטוף בנייר כסף, ולהשאיר ב 4 °C (4 °F) לילה כדי לאפשר mucin ו- DNA להתמוסס לתוך פתרון.
הערה: עליקוטים DNA זרע סלמון צריך להיות מופשר על קרח, מערבולת, והוסיף לבסיס חוצץ mucin. פתרונות מלאי טריפטופן, אספרגין וטיורוסין חייבים להיות מוכנים בפתרונות של NaOH (ראה טבלה 1 לריכוזים) במקום מים דה-יוניים. שמור על בסיס חוצץ ואת כל פתרונות המלאי עטופים בנייר כסף כדי להגן מפני חשיפה לאור. רוב המניות יהיו יציבות עד חודש. אין להשתמש במניות שהופכות דהויות ויש להחליףן לפני השימוש.
- תוספת מניות משלימות
- ביום הניסוי, הוסף את המניות הרשומות בטבלה 2 לבסיס המאגר המכיל מוצין ודנ"א.
הערה: הכן פתרון FeSO4 טרי ביום הניסוי, אך כל שאר המניות יכולות להתבצע מראש ומאוחסנות למשך 30 יום ב-4 °C .1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) מכיל כלורופורם. יש לטפל בזהירות, ואין להשתמש ליד להבות פתוחות. לאחר התוספת של DOPC, דגירה SCFM2 ב 37 °C (37 °F) עם רועד (250 סל"ד) לפחות 20 דקות (עבור תרבות 5 מ"ל). תקופת דגירה זו מאפשרת לכלורופורם ב- DOPC להתאדות. הבקבוקון לא צריך להיות אטום; במקום זאת, לכסות את הבקבוק נפתח באופן רופף עם נייר כסף.
- ביום הניסוי, הוסף את המניות הרשומות בטבלה 2 לבסיס המאגר המכיל מוצין ודנ"א.
2. הערכה בזמן אמת של סובלנות מיקרוביאלית במצרפים חיידקיים
- הכנת תרבויות לילה
- בערב שלפני הניסוי, לחסן 5 מ"ל של מרק LB עם כמה מושבות של Pa PAO1-pMRP9-113 מצלחת אגר LB המכילה אנטיביוטיקה (קרבניצילין 300 מיקרוגרם / מ"ל). לגדול לילה ב 37 °C (55 °F) עם עצבנות ב 250 סל"ד.
הערה: לגדול תרביות לילה עם תוספת של אנטיביוטיקה הנדרשת לבחירת plasmids הנדרש (כאן, חלבון פלורסנט ירוק (GFP) ביטוי plasmid, pMRP9-1). שים לב שיש לשטוף תאי Pa לפני פיקוח SCFM2. LB עשוי להיות מוחלף מדיה מעבדה עשירה אחרת עבור תרבויות לילה. כל בידוד חיידקים צריך להיות מטופל באמצעות הנחיות BSL-2 מתאימות לאורך פרוטוקול זה.
- בערב שלפני הניסוי, לחסן 5 מ"ל של מרק LB עם כמה מושבות של Pa PAO1-pMRP9-113 מצלחת אגר LB המכילה אנטיביוטיקה (קרבניצילין 300 מיקרוגרם / מ"ל). לגדול לילה ב 37 °C (55 °F) עם עצבנות ב 250 סל"ד.
- SCFM2 לחסן
- ביום הניסוי, לדלל בחזרה תרבויות לילה של Pa 1:10 (תרבות: מדיה נוזלית) על ידי חנק 500 μL לתוך 5 מ"ל של מרק LB טרי. לגדל תאים עד שלב יומן (60-90 דקות) ב 37 °C עם תסיסה ב 250 סל"ד.
- תרבויות שלב יומן צנטריפוגות ב 10,000 × גרם במשך 5 דקות. לשטוף את התאים על ידי הסרת supernatant ו resuspending ב 3 מ"ל של תמיסת מלח פוספט מעוקרת מסנן (PBS, pH 7.0). חזור פעמיים, ו resuspend הכדור בנפח הסופי של 1 מ"ל של PBS.
- למדוד את הספיגה של התאים שטף באמצעות ספקטרופוטומטר ב 600 ננומטר (OD600), ולחשב את נפח התרבות הנדרש עבור OD600 מתחיל של 0.05 ב 5 מ"ל של SCFM2. לחסן את Pa לתוך SCFM2, ומערבולת בעדינות כדי להפיץ תאים ברחבי. Pipette 1 מ"ל של SCFM2 מחוסן לתוך כל תא של 4-טוב, תחתית זכוכית, צלחת אופטית, ודגרה עבור 4 שעות סטטי ב 37 °C (50 °F).
הערה: זמן ההכפלה של תרביות הרשות הפלסטינית תלוי במתח ובזמינות החמצן. ב- SCFM2, בתנאים המתוארים כאן, זמן ההכפלה של הרשות הפלסטינית הוא ~ 1.4 שעות10.
3. הדמיית אגרגטים במהלך טיפול אנטיביוטי עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקלית (CLSM)
הערה: סעיף זה מתאר את השימוש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית ותוכנת לכידת תמונה להדמיה של אגרגטים Pa ב- SCFM2. המטרה היא להתבונן ולאפיין את הביומסה החיידקית הנותרת (סובלנית) לאחר הטיפול באנטיביוטיקה. השלבים המתוארים יכולים להתבצע בהצלחה במיקרוסקופים קונפוקליים אחרים, אם כי יש להפנות את מדריך ההפעלה של המכשיר לקבלת הדרכה ספציפית.
- תמונה Pa תרביות באמצעות תא מחומם או מיקרו-לוח מחומם מצויד על בימת המיקרוסקופ כדי לשמור על טמפרטורת הסביבה של 37 °C (50 °F). התחל את מודול הדגירה לפחות 2 שעות לפני תחילת הניסוי כדי לאפשר לכל המנגנונים להגיע לטמפרטורה הרצויה, ולהפחית התרחבות ותנועה נוספות במהלך איסוף הנתונים.
- לאחר 4 שעות, העבר תרביות SCFM2 המכילות תאי Pa לשלב המיקרוסקופ המחומם. ייעדו 3 מתוך 4 בארות כשכפולים טכניים לטיפול אנטיביוטי, וחשבו את ה-4 גם כבקרה ללא טיפול, המכילה רק תאי Pa ב-SCFM2, ללא אנטיביוטיקה. זהה אגרגטים באמצעות מיקרוסקופיה של Brightfield בתוך הכרטיסיה איתור לפני כל עירור של כתבים פלואורסצנטיים. הגדר אזור להדמיה בתוך כל באר, ואחסן את מיקומו (קואורדינטות x-y-z) באמצעות מודול מיקומים בתוכנת ההדמיה.
- השתמש במטרה טבילת שמן 63x לדמיין תרבויות Pa המכילות את ביטוי GFP pMRP9-1 ב- SCFM2 עם אורך גל עירור של 488 ננומטר ואורך גל פליטה של 509 ננומטר. צצו תמונות באמצעות האפשרות z-stack בתוך מודול הרכישה במרווחי זמן של 1 מיקרומטר (סה"כ 60 פרוסות). השתמש במודול ממוצע קו כדי להפחית פלואורסצנטיות ברקע בערוץ GFP בתוך הנפח הכולל של תמונות 60 מיקרומטר z-stack (1,093.5 מ"מ3). קח תמונות שליטה של SCFM2 לא מנוקול באמצעות הגדרות זהות כדי לקבוע את פלואורסצנטיות הרקע לניתוח תמונה.
הערה: תמונות נרכשות על-ידי הפקת 512 פיקסלים x 512 פיקסלים (0.26 מיקרומטר x 0.26 מיקרומטר פיקסלים) תמונות z-stack של 8 סיביות שנמצאות במרחק של 60 מיקרומטר מבסיס כיסוי הכיסוי. - השתמש באפשרות סידרת זמן בתוכנת ההדמיה כדי ללכוד 60 פרוסות בכל מיקום (טוב) במרווחי זמן של 15 דקות על פני תקופה של 18 שעות. השתמש באסטרטגיית המיקוד המובהק בתוך התוכנה כדי לאחסן מישור מוקד לכל עמדה, שאליה מוחזר בכל נקודת זמן לאורך הניסוי.
- לאחר סך של 4.5 שעות של דגירה, תמונה כל מיקום באמצעות ההגדרות לעיל כדי לקבוע את הביומסה המצרפית בתוך כל אחת מארבע הבארות לפני תוספת של אנטיביוטיקה.
- לאחר 6 שעות של דגירה כוללת, להוסיף אנטיביוטיקה ב 2x מתחת לריכוז מעכבי מינימלי (MIC) לכל לשכפל. פיפטה ישירות ובעדינות לאמצע הבאר, ממש מתחת לאינטרפאזה נוזלית האוויר. שמרו על כל התרבויות בחדר הקונפוקלי המחומם.
הערה: כאן, קוליסטין גופרתי בריכוז של 140 מיקרוגרם / מ"ל שימש. - התחל הדמיה טיפול לאחר אנטיביוטיקה על ידי לחיצה על האפשרות התחל ניסוי בתוך תוכנית ההדמיה.
הערה: ריכוז אנטיביוטיקה בשימוש תלוי באנטיביוטיקה, הרשות הפלסטינית לבודד, והאם המשתמש רוצה לבחון הרג או סובלנות אפקטים. ניסוי זה משתמש במנה אחת. ניתן להוסיף מינונים נוספים מבלי לשבש תרבויות במידת הצורך.
4. הכתמת יודיד פרופידיום של אגרגטים של הרשות הפלסטינית
הערה: פרופיליום יודיד (PI) משמש בדרך כלל כמו ריאגנט מכתים לזהות תאים חיידקיים שאינם קיימא (מת) בתרבית. כאן, הוא משמש לזיהוי אגרגטים רגישים לטיפול אנטיביוטי החל בסעיף 3. לאורך פרוטוקול זה, הביטוי והזיהוי של GFP בתאי Pa משמש כ- Proxy העיקרי עבור הכדאיות של התא. שלב סופי זה מאפשר שימוש נוסף בהדמיה קונפוקלית כדי לזהות את המיקום המרחבי של אגרגטים חיים/מתים ביחס זה לזה. בנוסף, אגרגטים מזוהים כחי/מתים למיון תאים במורד הזרם בסעיף 5.
- לאחר 18 שעות, הוסף PI לכל באר של צלחת תחתונה אופטית ארבעה תאים המכיל תרביות SCFM2. בצע את הוראות היצרן עבור נפח PI וזמן הדגירה (למשל., ~ 2 μL לכל mL של תרבות, ~ 20-30 דקות).
5. בידוד תאים חיים מצברים באמצעות גישת FACS
הערה: FACS מציג פלטפורמה רבת עוצמה כדי למיין ולבודד קבוצות של תאים על פי פנוטיפ מתויג פלואורסצנטית. כאן, FACS משמש כדי לבודד אגרגטים חיים (עמידים לאנטיביוטיקה) מן אגרגטים שאינם קיימא.
- לאחר הכתמה עם יוד propidium, להסיר את התרבויות מדגירה, ולהעביר למכשיר FACS במיכל מבודד כדי לשמור על 37 °C (50 °F).
- הפעל 1 mL aliquots של SCFM2 המכיל אגרגטים Pa בקצב הזרימה הנמוך ביותר.
הערה: כל aliquot יכיל ~ 15,000 אגרגטים. - כדי לזהות GFP, להאיר את התאים עם לייזר 488 ננומטר, ולתעד את גובה האות פלואורסצנטי ב 530/30 ננומטר. דמיינו את הכתמת PI על ידי עירור בלייזר 561 ננומטר, ותעדו את גובה האות הפלואורסצנטי ב- 610/20 ננומטר. בצע מיון באמצעות זרבובית 70 u.
הערה: ניתן לאגד אגרגטים ממוינים במספר דרכים בהתאם ליישום המשתמש. במקרה זה, FACS שימש למיון אגרגטים של Pa בר קיימא עבור ריצוף RNA במורד הזרם. יישומים חלופיים נדונים להלן.
6. ניתוח תמונה
הערה: מיקרוסקופיה של זמן-לשגות יוצרת כמויות גדולות של נתונים. ניסוי של 18 שעות לתצפית על אגרגטים של Pa ב- SCFM2 מזהה כ - 50,000 אגרגטים לאורך זמן, אשר יש להם פוטנציאל להיות מאופיין עבור נפח ומיצוב מרחבי. השתמש בתוכנת ניתוח תמונה כדי לכמת דינמיקה מצטברת ב- SCFM2:
- עבור מחקרים מצטברים ב- SCFM2, לכמת את הפלואורסצנטיות של GFP ברקע על ידי יצירת היסטוגרמה של ספירות בערוץ GFP המיוצר עבור SCFM2 ו- SCFM2 לא מחוסנים עם זן Pa PAO1 הנושא pMRP9-1. כדי להבטיח ש-voxels GFP שזוהו מתואמים לביומסה של Pa, הגדר ווקסל GFP+ כערך ספירת רקע של GFP ≥1.5x.
הערה: פלואורסצנטיות הרקע מוגדרת כערך הווקסל הגבוה ביותר של שלוש עמדות שנבחרו באקראי, בממוצע. ספירת הרקעים, כמדד סטנדרטי, מופחתת מכל הפיקסלים בתמונות ניסיוניות על ידי תוכנת ניתוח התמונות. - לאחר חיסור רקע במודול ה-Surpass, יש לייצר isosurfaces עבור כל ה-voxels הנותרים.
- כדי לזהות צבירים בודדים, הפוך את האפשרות Split Objects לזמינה והגדר צבירה כאובייקטים עם אמצעי אחסון של ≥5 מיקרומטר3. השתמש במודול Vantage בתוכנת ניתוח התמונה כדי לחשב את אמצעי האחסון, x-y-z והסכום של voxels GFP עבור כל אובייקט בודד. יצא נתונים אלה לפלטפורמה סטטיסטית חיצונית.
הערה: כמה תוכנה לניתוח תמונה לאפשר ייצוא של phentoypes כמותי מרובים בבת אחת, המאפשר מתאם להיות מחושב. - מסנן נתונים שיוצאו ממודול Vantage לפי גודל כדי להבטיח שלא יישארו אובייקטים של <0.5 מיקרומטר3 (ביומסה מפוזרת). עבור כל אובייקט בודד בתוך התמונה, חשב את המרחק מעצמו ביחס לאובייקטים אחרים (אגרגטים) באמצעות מודול Vantage של תוכנת ניתוח התמונה או באופן ידני עם המשוואה הבאה.
d = sqrt((x2− x1)2 + (y2− y1)2 + (z2− z1)2) (1) - השתמש בחישובי SUM ו- AVERAGE כדי למצוא את הביומסה הכוללת ואת נפח הצבירה הממוצע. לחלופין, לייצא נתונים לפלטפורמות סטטיסטיות אחרות או סקריפטים אחרים, למשל. . התפלגות של אגרגטים על פני ביומסה כפי שנדון בתוצאות הייצוגיות (סקריפט שלא פורסם בשיתוף עם המעבדה Whiteley, המכון הטכנולוגי של ג'ורג'יה).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עבודה זו מפרטת שיטות להתבונן אגרגטים Pa ברזולוציה גבוהה ובסביבה דומה לזו של זיהום כרוני של CFריאה 9,10,12. SCFM2 מספק מערכת במבחנה המקדמת צבירה טבעית של תאי Pa בגדלים דומים לאלה שנצפו במהלך זיהום בפועל10. ניתן למנף את יכולת ההסתגלות של SCFM2 כאמצעי מוגדר כדי להתקרב לאפיקי מחקר רבים. מטרת עבודה זו היא להדגיש זרימת עבודה הכוללת שילוב של מיקרוסקופיה ו- FACS, מתוך כוונה לעודד את השי...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
עבודה זו הציגה מתודולוגיות שניתן לשלב כדי לחקור אוכלוסיות צבירה חיידקיות בנוכחות ובהיעדר טיפול אנטיביוטי. CLSM ברזולוציה גבוהה מאפשר הדמיה של שינויים ביומסה מצטברת ואת הכיוון המבני של אגרגטים על פני זמן אמת כאשר נחשף לאנטיביוטיקה. בנוסף, ניתן לכמת תכונות פיזיות ומבניות של הביומסה שנותרו לאחר הטיפול באנטיביוטיקה, במטרה לתאם תצפיות אלה עם מחקרי ביטוי גנים עתידיים המשתמשים ב- RNA-seq. בעוד שהשימוש בתאים המביעים GFP מאפשר הדמיה של ההתנהגות הקולקטיבית והאינדיבידואלית של תאים עמידים לאנטיביוטיקה, הוא מספק רק חלק מהתמונה הכוללת...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי אינטרסים.
תודות
S.E.D נתמך על ידי קרנות סטארט-אפ המסופקות על ידי המחלקה לרפואה מולקולרית, אוניברסיטת דרום פלורידה, כמו גם מענק מחקר CFF (DARCH19G0) N.I.H (5R21AI147654 - 02 (PI, חן)) ומכון USF על מיקרוביום. אנו מודים למעבדת ויטלי על שיתוף הפעולה המתמשך הכולל ערכות נתונים הקשורות לכתב יד זה. אנו מודים לד"ר צ'ארלס סקרס על שטיפל במיון של FACS. דמויות נוצרו על ידי A.D.G וS.E.D. באמצעות Biorender.com.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| חומצות | |||
| Alanine | Acros Organics | 56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acros Organics | 56-84-8 | מוכן ב-0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| חומצה גלוטמית HCl | Acros Organics | 138-15-8 | |
| Glycine | Acros Organics | 56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa | Aesar A17627 | |
| Isoleucine | Acros Organics | 73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acros Organics | 63-68-3 | |
| אורניתין הידרוכלוריד | אלפא Aesar | A12111 | |
| פנילאלנין | אקרוס אורגניקס | 63-91-2 | |
| פרולין | אלפא Aesar | A10199 | |
| סרין | אלפא Aesar | A11179 | |
| תראונין | אקרוס אורגניקס | 72-19-5 | |
| טריפטופן | אקרוס אורגניקס | 73-22-3 | מוכן ב 0.2 מ ' NaOH |
| טירוזין | אלפא | Aesar A11141 | מוכן ב-1.0 מ' NaOH |
| Valine Acros Organics | 72-18-4 | ||
| אנטיביוטיקה | |||
| קרבניצילין | אלפא Aesar | J6194903 | |
| יום המלאי | |||
| CaCl2 * 2H2 | O Fisher Chemical | C79-500 | |
| דקסטרוז (D-גלוקוז) | פישר כימיקל | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | פישר (אוונטי ליפידים קוטביים) | 4235-95-4 | שייק 15-20 דקות ב-37 מעלות; C לאידוי כלורופורם |
| FeSO4 * 7H2 | O Acros Organics | 7782-63-0 | מלאי זה שווה ל-1 מ"ג/מ"ל, חייב להכין |
| חומצה L-לקטית | Alfa Aesar | L13242 | מלאי pH ל-7 עם NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| מוצקים | |||
| מוצין חזיר | Sigma | M1778-100G | עיקור UV |
| זרע סלמון DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| כתם | |||
| פרופידיום יודיד | אלפא Aesar | J66764MC | |
| מלחים | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | הוסף מוצק ישירות לבסיס חוצץ |
| KNO3 | Acros Organics | 7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | הוסף מוצק ישירות לבסיס חוצץ |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | הוסף מוצק ישירות לבסיס חוצץ |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acros Organics | 12125-02-9 | מוסיפים מוצק ישירות לחומרים |
| מתכלים בסיסיים מאוחסניםצינורות חרוטיים (15 מ"ל) | פלסטיק אולימפוס | 28-101 | |
| צינורות חרוטיים (50 מ"ל) | פלסטיק אולימפוס | 28-106 | |
| צינורות תרבית עם מכסה זרימת אוויר | פלסטיק אולימפוס | 21-129 | |
| 35 מ"מ צלחת תחתית זכוכית עם ארבעה תאים | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) מרק | Genessee Scientific | 11-118 | |
| תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS) | פישר ביוריאגנטים | BP2944100 | |
| קצות פיפט (p200) | פלסטיק אולימפוס | 23-150RL | |
| קצות פיפט (p1000) | פלסטיק אולימפוס | 23-165RL | |
| צנרת סרולוגית (5 מ"ל) | פלסטיק אולימפוס | 12-102 | |
| פיפט סרולוגי (25 מ"ל) | פלסטיק אולימפוס | 12-106 | |
| צינורות סרולוגיים (50 מ"ל) | פלסטיק אולימפוס | 12-107 | |
| מים טהורים במיוחד (ללא RNase/DNase); מים ננו-טהורים | Genessee Scientific | 18-194 | מים ננו-טהורים המשמשים להכנת תמיסות בטבלה 1 |
| מזרקים (10 מ"ל) | מזרקי BD | 794412 | |
| (50 מ"ל) | BD | 309653 | |
| 0.22 מ"מ מסנן מזרק PES | אולימפוס | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | להכנת הדמויות | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | גרסה 9.6 | |
| Zen Black | |||
| ציוד | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, סן חוזה, קליפורניה | ||
| LSM 880 מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי | Zeiss |
מקורות
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
- Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
- O'Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573(2019).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913(2019).
- Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240(2017).
- Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
