הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

זיהוי RNA המעורבים באינטראקציה ישירה של RNA-RNA עם RNA ארוך שאינו מקודד

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62475

⸱

9 ביולי 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculté des Sciences Médicales et Paramédicales, Aix Marseille Univ, CNRS, INP

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול RNA נפתח קל לשימוש מיועד לזיהוי RNAs המעורבים באינטראקציה ישירה של RNA/RNA עם RNA ארוך שאינו מקודד. הפרוטוקול משתמש בפסורלן כמקבע לקישור צולב של אינטראקציות RNA/RNA בלבד ומספק את כל אינטראקטום ה-RNA הישיר של RNA ארוך שאינו מקודד בשילוב עם ריצוף RNA.

תקציר

התפקיד ההולך וגדל המיוחס כיום ל-RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNA) בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה הופך את זה לקריטי לאפיין את האינטראקטום שלהם על ידי זיהוי השותפים המולקולריים שלהם, DNA, חלבונים ו/או RNAs. האחרונים יכולים לקיים אינטראקציה עם lncRNA באמצעות רשתות הכוללות חלבונים, אך הם יכולים להיות מעורבים גם באינטראקציות ישירות של RNA/RNA. לכן פיתחנו הליך משיכה קל לשימוש של RNA שאיפשר זיהוי של RNA המעורבים באינטראקציה ישירה של RNA/RNA עם lncRNA באמצעות פסורלן, מולקולה המקשרת רק אינטראקציות RNA/RNA. מידול ביואינפורמטי של המבנה המשני של lncRNA איפשר בחירה של מספר בדיקות ספציפיות של אוליגונוקלאוטידים של DNA אנטי-סנס עם זיקה חזקה לאזורים המציגים סבירות נמוכה לזיווג בסיסים פנימיים. מכיוון שהבדיקות הספציפיות שתוכננו התמקדו באזורים נגישים לכל אורך ה-lncRNA, ניתן היה לתאר את אזורי האינטראקציה של RNA ברצף ה-lncRNA. בשילוב עם ריצוף RNA בתפוקה גבוהה, ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לכל מחקרי האינטראקטום הישירים של RNA של lncRNA מעניין.

מבוא

RNA ארוכים שאינם מקודדים (lncRNAs) הם תעתיקים שאינם מקודדים לחלבון באורך של יותר מ-200 נוקלאוטידים. מספרם גדל בהתמדה, יותר מ-58,000 בבני אדם. יתר על כן, תפקידם המכריע בפיזיולוגיה ובפתופיזיולוגיה מחייב לאפיין את השותפים המולקולריים שלהם המאפשרים להם ליישם את הפונקציות הרגולטוריות שלהם. למעשה, גישה אחת להבנת הפונקציות של lncRNAs היא זיהוי השותפים המולקולריים האינטראקטיביים של כל lncRNA.

המטרות המולקולריות של lncRNAs יכולות להיות DNA, חלבונים או RNAs, ופותחו טכניקות שונות לזיהויים. בהקשר זה, זיהוי חלבונים המקיימים אינטראקציה עם lncRNAs הוא המטרה של פרוטוקולים שונים, כולל הליכים שונים של RNA-immunoprecipitation (RIP) שבהם נעשה שימוש בנוגדנים כנגד החלבון המעניין כדי למשוך באופן ספציפי את lncRNAs (לסקירה1). טכניקות אחרות כגון ניתוח היברידיזציה של לכידה של מטרות RNA2 (CHART) או בידוד כרומטין על ידי טיהור RNA3 (ChIRP) מאפשרות למשוך למטה lncRNAs יחד עם קומפלקסי החלבון הנלווים. בטכניקות האחרונות הללו, ה-lncRNA משמש כפיתיון. CHART ו-ChIRP הן גם טכניקות עוצמתיות לזיהוי מפות גנומיות המציגות תפוסת lncRNA 2,3. בנוסף, שיטות משיכת RNA אלה מאפשרות לזהות את שותפי ה-RNA של lncRNA. תואר הליך המאפשר לכידת RNA הממוקדים על ידי lncRNA. בדיקות אוליגונוקלאוטידים ביוטיניליות של DNA אנטיסנס מתוכננות כנגד אזורים בעלי סבירות נמוכה לזיווג בסיסים פנימיים כפי שנקבע על ידי מודלים ביואינפורמטיים של המבנה המשני של lncRNA4. עם זאת, הליך זה אינו מבחין אם שותפי ה-RNA מקיימים אינטראקציה עקיפה באמצעות רשת חלבונים או ישירות באמצעות אינטראקציות RNA/RNA ישירות עם ה-lncRNA. הוכח כי קישור צולב עם נגזרות פסורלן הוא שיטת הבחירה לבחירת אינטראקציות RNA/RNA ישירות המתווכות על ידי זיווג בסיסים5. נגזרות של פסורלן אכן מסוגלות להשתלב ל-DNA או RNA דו-גדילי ולקשר קוולנטית בין פירימידינים לאחר הקרנה לאור UV (365 ננומטר)6. צימוד משיכת ה-RNA באמצעות בדיקות אוליגונוקלאוטידים ביוטיניליות עם הקישור הצולב עם פסורלן הוא הליך קל לשימוש המוצע כאן לזיהוי ה-RNA המעורבים באינטראקציות RNA/RNA ישירות עם lncRNA. יתר על כן, הליך זה יכול לאפשר תיחום אזורי האינטראקציה של RNA ברצף ה-lncRNA אם נעשה שימוש בבדיקות אוליגונוקלאוטידים שונות שתוכננו לאורך ה-lncRNA.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. עיצוב בדיקה

  1. צור את המבנה המשני של lncRNA באמצעות תוכנת שרת אינטרנט חינמית מיוחדת: תוכנת RNAstructure7 או Vienna RNA web suite8. בחר אזורים המציגים הסתברות נמוכה לזיווג בסיסים פנימי ותכנן 25 בסיסים בדיקות אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס ארוכות עבור אזורים שונים של lncRNA זה.
  2. בדוק את כל האוליגונוקלאוטידים שתוכננו בתוכנה האקדמית החינמית, AmplifX (https://inp.univ-amu.fr/en/amplifx-manage-test-and-design-your-primers-for-pcr), על מנת לקבל מידע שונה על בדיקות אלה ולבחור את אלה עם הפרמטרים הטובים ביותר.
    הערה: בדוק את הפרמטרים האופטימליים בתוכנה כדלקמן. אחוז GC: בין 40 ל-60%, יציבות 3', מורכבות, דימר עצמי: "טוב". טמפרטורת ההיתוך (TM) אינה חשובה מכיוון שהזיקה מתבצעת בטמפרטורת החדר.
  3. באמצעות כלי חיפוש יישור (כלומר, Blast וכו'), ודא שבדיקות האוליגונוקלאוטידים האנטיסנס שנבחרו אינן מזהות רצפי נוקלאוטידים בשום RNA אחר המתבטא בתאים הנבחרים.
    1. תכנן בדיקת אוליגונוקלאוטיד DNA לא ספציפית באורך 25 בסיסים. ודא שבדיקה זו אינה מראה זיקה ל-lncRNA המעניין או לרצפי RNA אחרים בגנום המעניין.
  4. הזמינו את כל הבדיקות עם שינוי ביוטין שנוסף לקצה ה-3 שלהן יחד עם ספייסר טריאתילן גליצרול (TEG). מרווח זה מגדיל את מרחק האוליגו-ביוטין על מנת למנוע הפרעה סטרית.
    הערה: כדי להשיג תוצאה אופטימלית ולהעריך את הספציפיות של תוצאות המשיכה, תכנן מינימום של שני בדיקות אוליגונוקלאוטידים אנטי-סנס שונות באותו אזור ולאחר מכן השווה את יעילותן בניסוי.

2. קישור צולב

  1. לגדל תאים (למשל, תאי GH4C1 ששימשו בניסוי זה) עד למפגש בכלי תרביתתאים בגודל 78.5 ס"מ. לאחר הסרת מדיום תרבית התאים, שטפו את שכבת התא ב-5 מ"ל של מי מלח קרים עם חוצץ פוספט מועשר ב-Ca2+ ו-Mg2+ (PBS+) והוסיפו 3 מ"ל של תמיסת מולקולה שמקורה בפסורלן (4′Aminomethyltrioxsalen hydrochloride) שהוכנה ב-PBS+ בריכוז של 0.1 מ"ג/מ"ל.
  2. מניחים את צלחת התרבות למשך 30 דקות בחממת תרבית תאי יונקים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2. לאחר 30 דקות, הסר את המכסה, הניח כלי תרבית על קרח במרחק של 2.5 ס"מ מצינורות UV של 365 ננומטר בקישור UV למשך 10 דקות. מערבבים את הכלים בעדינות ומחזירים את החשיפה ל-UV לתקופה נוספת של 10 דקות.
  3. השליכו מדיה על ידי שאיפה, הוסיפו 1 מ"ל PBS+ כדי לאסוף תאים עם מגרד תאים, והעבירו למיקרו-צינור. צנטריפוגה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, 400 x גרם למשך 5 דקות. הסר כמה שיותר סופרנטנט ואחסן כדורים ב-80 מעלות צלזיוס.

3. ליזה של תאים

  1. הכן מאגר Proteinase K על ידי הוספת 100 מ"מ NaCl, 10 מ"מ Tris-HCl, pH 7.0, 1 מ"מ EDTA, 0.5% SDS ומעכב 5 μL/mL RNase.
  2. השעו מחדש את כדורי התא במאגר זה (כ-200 מיקרוליטר לכל 1 x 107 תאים). הוסף פרוטאינאז K לריכוז סופי של 0.1 מיקרוגרם/מיקרוליטר ודגירה למשך 45 דקות ב-50 מעלות צלזיוס. לאחר מכן דגרו במשך 10 דקות בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס, כדי לנטרל את הפרוטאינאז K.

4. סוניקציה

  1. יש להפיץ 100 מיקרוליטר של ליזאט זה (המתאים ל-5.106 תאים) בשני מיקרו-צינורות ולהוסיף 200 מיקרוליטר של מאגר הכלאה (700 מ"מ NaCl, 70 מ"מ Tris-HCl, pH 7.0, 1 מ"מ EDTA, 1.25% SDS, 5 μL/mL תמיסת מעכב RNase ו-15% פורממיד) בכל צינור.
  2. הנח את הצינורות באמבט המים של 4 מעלות צלזיוס של סוניקטור והתחל את הסוניקציה עם 2 סדרות של פולסים של 30 שניות (עוצמה גבוהה) המופרדות על ידי 30 שניות כבוי.
  3. אסוף 20 מיקרוליטר של דגימות שישמשו כדגימות בקרת קלט ואחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
    הערה: הליך סוניקציה זה עבר אופטימיזציה בעבר עבור קו התאים GH4C1 על מנת להשיג שברי RNA הנעים ב -2,000 נוקלאוטידים9. עבור קווי תאים אחרים, יש לייעל את הליך הסוניקציה. כאשר טכניקה זו מבוצעת כדי לחקור את שותפי ה-RNA של RNA ארוך מאוד שאינו מקודד, שלב הסוניקציה מתגלה כהכרחי להשגת התאוששות נאותה של ה-lncRNA. במקרה זה, לכן יש צורך לתכנן מספר בדיקות עם אתר קשירה הממוקם כל 4,000 נוקלאוטידים לכל היותר לאורך ה-lncRNA. כדי לשחזר את האורך המלא של ה-lncRNA, השתמש במאגר של מספר בדיקות ספציפיות. עם זאת, אם המטרה היא לזהות את אזורי ה-lncRNA המעורבים בקשירת RNA-RNA, יש להשתמש בבדיקות הספציפיות בנפרד. יתר על כן, אם חוקרים שותפי RNA של lncRNA קטן יותר, יש לבצע ניסויים כדי לקבוע אם נדרש שלב הסוניקציה.

5. RNA נפתח

  1. יום 1 - שלב הכלאה
    1. הוסף 150 pmol (1.5 מיקרוליטר של תמיסת מלאי של 100 מיקרומטר) של בדיקה ספציפית או לא ספציפית ביוטינילית לכל צינור דגימה. דגירה למשך 4 שעות תחת תסיסה על מסובב צינור בטמפרטורת החדר (RT) (כ-30 סל"ד).
    2. קח את הנפח הדרוש של חרוזים מגנטיים (כלומר, 40 מיקרוליטר חרוזים לכל 150 pmol של תגובת הכלאה של בדיקות). השתמש בתמיכת מגנט כדי להפריד חרוזים ממדיה מסחרית. השליכו את הסופרנטנט ושטפו את החרוזים עם 900 מיקרוליטר של מאגר ההיברידיזציה. לאחר שתסיים, השהה מחדש את החרוזים המגנטיים באותו נפח של מאגר ההכלאה.
    3. הוסף חרוזים מגנטיים בכל צינור דגימה (40 מיקרוליטר חרוזים לכל 150 pmol של תגובת הכלאה של בדיקות). דגירה למשך הלילה תחת תסיסה על מסובב צינור ב-RT (כ-30 סל"ד).
  2. יום 2 - שלב בידוד RNA
    1. הפרד חרוזים מליזאט התא באמצעות תמיכת מגנט (2-3 דקות). השליכו את הסופרנטנט ושטפו את החרוזים עם 900 מיקרוליטר של מאגר הכביסה (0.5% SDS, 2x SSC) עם דגירה של 5 דקות תחת תסיסה על המסובב ב-RT. חזור על כביסה זו 5 פעמים.
    2. לאחר הסרת הכביסה האחרונה, הוסף 95 מיקרוליטר של מאגר פרוטאינאז K על החרוזים. הפשירו את דגימות הקלט והוסיפו 75 מיקרוליטר של מאגר Proteinase K. הוסף 5 מיקרוליטר של פרוטאינאז K לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/מיקרוליטר בכל הצינורות (דגימות ודגימות קלט). דגירה בטמפרטורה של 45 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות ולאחר מכן בטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. שמור את הדגימה על קרח. השתמש בתמיכה מגנטית כדי להפריד חרוזים מ-RNA הנמצאים בסופרנטנט. טהר RNA עם ערכת טיהור RNA הכוללת שלב עיכול DNase. אחסן RNA מטוהר ב-80 מעלות צלזיוס.
      הערה: ניתן לעבור RNA מועשר ל-RT-qPCR או לריצוף RNA בתפוקה גבוהה כדי לזהות תעתיקים מועשרים. עבור ניתוח ריצוף RNA, ניתן ליישר את הקריאות לגנום המעניין באמצעות תוכנה חופשית, כגון STAR10 או HISAT211, וניתן לבצע את הכימות באמצעות FeatureCounts12 או HTSeqcount 13.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הבהרת אינטראקטום ה-lncRNA, כלומר הרכיבים התאיים המקיימים אינטראקציה עם lncRNAs, חלבונים, RNA ו-DNA, היא בעלת חשיבות מרכזית להבנת הפונקציות של lncRNAs. פותחו טכניקות שונות לאפיון אינטראקטום ה-lncRNA, כולל RIP, CHART, ChIRP ו-RNA נפתח. בעוד שהאחרון הוכח כחזק בזיהוי מטרות RNA של lncRNAs, הליכים אלה אינם מציינים אם שותפי ה-RNA מקיימים אינטראקציה עקיפה באמצעות רשת חלבונים או ישירות באמצעות אינטראקציות RNA/RNA ישירות. עם זאת, כיום מאמינים כי המנגנונים שדרכם lncRNA רבים מפעילים את תפקידם מסתמכים על אינטראקציות RNA/RNA עם RNA אח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

lncRNAs רבים מבצעים את תפקידם באמצעות זיווג בסיסים משלים ל-mRNAs. לכן, חשוב לפתח נהלים המאפשרים לאפיין את אינטראקטום ה-RNA הישיר של ה-lncRNAs. לכן, פותח הליך המשלב שימוש בפסורלן כמגיב צולב עם טכניקת משיכה של RNA.

בפרוטוקול הנפתח של RNA המתואר, התכנון והבחירה של בדיקות האוליגונוקלאוטידים הביוטיניים של ה-DNA מבוססים על מודלים ביואינפורמטיים של מבנה משני של lncRNA ובחירה לאחר מכן של בדיקות ההכלאה כנגד אזורים של ה-lncRNA הרצוי המציגים סבירות נמוכה לזיווג בסיסים פנ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי אוניברסיטת אקס-מרסיי והמרכז הלאומי למחקר מדעי ומומנה על ידי מענק ממעבדות סנדוז.

מימון דמי גישה פתוחה: אוניברסיטת אקס-מרסיי והמרכז הלאומי למחקר מדעי

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
4′-Aminomethyltrioxsalen hydrochlorideSigmaA4330Crosslinker reagent
Bioruptor PlusDiagenodeB01020001 Sonicator
בדיקות ביוטיניותIDTבדיקות אוליגונוקלאוטידים
CFX96 מערכת בזמן אמתBioRad4351107qPCR מכשיר
DNA אוליגנוקלאוטידיםIDTפריימרים ל-qPCR
Dynabeads MyOne Thermo-Fisher65001חרוזי סטרפטווידין מגנטיים
פורממידתרמו-פישר15515-026פורממיד
iTaq אוניברסלי SYBR Green SupermixBioRad1725124מגיב qPCR
Proteinase KSigmaP2308Proteinase K
RNA ל-DNAThermo-Fisher4387405ערכת שעתוק הפוך
ערכת טיהור RNA XSMacherey-Nagel740902ערכת טיהור RNA
RNAseOUTThermo-Fisher10777-019מעכב RNAse
מסובב צינורסטיוארטSB2Eppendorf מסובב צינור
UV Stratalinker 1800Stratagene#400072UV crosslinker

מקורות

  1. Chen, L. -L., Zhao, J. C. functional analysis of long non-coding RNAs in development and disease. Systems Biology of RNA Binding Proteins. 825, 129-158 (2014).
  2. Simon, M. D. capture hybridization analysis of rna targets (CHART). Current Protocols in Molecular Biology. 101 (1), 2125(2013).
  3. Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP). Journal of Visualized Experiments. (61), e3912(2012).
  4. Torres, M., et al. RNA pull-down procedure to identify RNA targets of a long non-coding RNA. Journal of Visualized Experiments. (134), e57379(2018).
  5. Engreitz, J. M., et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of non-coding RNAs to nascent pre-mRNAs and chromatin sites. Cell. 159 (1), 188-199 (2014).
  6. Cimino, G. D., Gamper, H. B., Isaacs, S. T., Hearst, J. E. Psoralens as photoactive probes of nucleic acid structure and function: Organic chemistry, photochemistry, and biochemistry. Annual Review of Biochemistry. 54 (1), 1151-1193 (1985).
  7. Reuter, J. S., Mathews, D. H. RNAstructure: Software for RNA secondary structure prediction and analysis. BMC Bioinformatics. 11 (1), 129(2010).
  8. Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neuböck, R., Hofacker, I. L. The Vienna RNA websuite. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 70-74 (2008).
  9. Jacq, A., et al. Direct RNA-RNA interaction between Neat1 and RNA targets, as a mechanism for RNAs paraspeckle retention. RNA Biology. , 1-12 (2021).
  10. Dobin, A., et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  11. Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).
  12. Liao, Y., Smyth, G. K., Shi, W. FeatureCounts: An efficient general-purpose program for assigning sequence reads to genomic features. Bioinformatics. 30 (7), 923-930 (2014).
  13. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), Oxford, England. 166-169 (2015).
  14. Fox, A. H., et al. Paraspeckles: a novel nuclear domain. Current Biology. 12 (1), 13-25 (2002).
  15. Torres, M., et al. Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements. eLife. 5, 14837(2016).
  16. Jacq, A., et al. Direct RNA-RNA interaction between Neat1 and RNA targets, as a mechanism for RNAs paraspeckle retention. BioRxiv. , 354712(2020).
  17. Lu, Z., et al. Psoralen Analysis of RNA Interactions and Structures with High Throughput and Resolution. Methods in Molecular Biology. 1649, 59-84 (2018).
  18. Aw, J. G. A., Shen, Y., Nagarajan, N., Wan, Y. Mapping RNA-RNA interactions globally using biotinylated psoralen. Journal of Visualized Experiments. (123), e55255(2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

RNA RNA Pull DownRNARNADNARNA
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.