מאמר שיטה

תרבית משותפת של מיקרוגליה ונוירונים בקליפת המוח התבדלו מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם

3.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62480

⸱

21 בספטמבר 2021

 ,  ,  , 
1Center for Genomic Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Chemical Biology Program, Broad Institute of MIT & Harvard, 3Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 4Schizophrenia and Bipolar Disorder Program, McLean Hospital, 5Program in Neuroscience, Harvard University, 6Program in Chemical Biology, Harvard University, 7Harvard Stem Cell Institute

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה להבדיל בין מיקרוגליה ל-iPSCs אנושיים ולשמור אותם בתרבית משותפת עם נוירונים קליפת המוח שמקורם ב-iPSC על מנת לחקור את היסודות המכאניסטיים של אינטראקציות נוירו-אימוניות באמצעות נוירונים אנושיים ומיקרוגליה.

תקציר

היכולת לייצר מיקרוגליה מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים אנושיים (iPSCs) מספקת כלים ודרכים חדשים לחקירת תפקיד המיקרוגליה בבריאות ובמחלות. יתר על כן, ניתן לשמור על מיקרוגליה שמקורה ב-iPSC בתרבית משותפת עם נוירונים קליפת המוח שמקורם ב-iPSC, המאפשרים חקירה של אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים המשוערות כלא מווסתות במספר הפרעות נוירו-פסיכיאטריות. iPSCs אנושיים התמיינו ליצירת מיקרוגליה באמצעות גרסה מותאמת של פרוטוקול שפותח על ידי קבוצת Fossati, והמיקרוגליה שמקורה ב-iPSC אומתה באמצעות ניתוח סמנים ו-PCR בזמן אמת. מיקרוגליה אנושית שנוצרה באמצעות פרוטוקול זה הייתה חיובית לסמנים CD11C, IBA1, P2RY12 ו-TMEM119, וביטאה את הגנים הקשורים למיקרוגליה AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 ו-TMEM119. נוירונים אנושיים בקליפת המוח שמקורם ב-iPSC שהיו מובחנים במשך 30 יום צופו במיקרוגליה ונשמרו בתרבית משותפת עד היום ה-60, אז נערכו ניסויים. צפיפות הקוצים הדנדריטיים בתאי עצב בקליפת המוח בתרבית משותפת עם מיקרוגליה כומתה בתנאי בסיס ובנוכחות ציטוקינים פרו-דלקתיים. על מנת לבחון כיצד מיקרוגליה מווסתת את תפקוד העצבים, נערכו ניסויי הדמיית סידן של תאי העצב בקליפת המוח באמצעות אינדיקטור הסידן Fluo-4 AM. פעילות סידן חיה של נוירונים בקליפת המוח הושגה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, ועוצמת הקרינה כומתה באמצעות ImageJ. דוח זה מתאר כיצד תרבית משותפת של מיקרוגליה ותאי עצב בקליפת המוח שמקורם ב-iPSC מספקים גישות חדשות לחקירת ההשפעות של מיקרוגליה על נוירונים בקליפת המוח.

מבוא

במוח האנושי, מיקרוגליה הם תאי החיסון המולדים העיקריים1. התפתחות המוח מווסתת על ידי מיקרוגליה בשני מסלולים: שחרור גורמים דיפוזיים ופגוציטוזיס1. גורמים מפוזרים שמקורם במיקרוגליה מסייעים בתמיכה במיאלינציה, נוירוגנזה, היווצרות סינפטית, התבגרות, מוות תאים והישרדות תאים1. מיקרוגליה גם פוגוציטים אלמנטים שונים בסינפסות המוח, באקסונים ובתאים חיים ומתיםכאחד 2,3,4,5,6,7,8. קולטנים על מיקרוגליה מזהים תגים כגון קלרטיקולין, ATP וחומצה סיאלית ומווסתים את הפגוציטוזיס התאי 9,10. בהיפוקמפוס, מיקרוגליה שומרת על ההומאוסטזיס של נוירוגנזה באמצעות תפקידה הפגוציטי11.

הוכח כי פגוציטוזיס סינפטי בגרעין הגניקולט האחורי (dLGN) של מוח המכרסם מווסת על ידי מיקרוגליה1. במכרסמים הוכח כי ישנן שתי תקופות במהלך ההתפתחות בהן נצפתה פגוציטוזיס סינפטי אינטנסיבי של מיקרוגליה. התקופה הראשונה מתרחשת במהלך היווצרות הסינפסות הראשונית והתקופה השנייה מתרחשת כאשר החיבורים מכווננים וגוזמים12. גורמים נוספים המעורבים בגיזום סינפטי הם חלבונים דלקתיים וקומפלקס התאימות ההיסטולוגית העיקרי Class I (MHC1, H2-Kb ו-Db)13,14. הוצע כי C1q (רכיב משלים 1q) על המיקרוגליה משתלב עם MHC1, מה שמפעיל גיזום סינפטי15. יתר על כן, מחקרים בעכברים מראים כי אינטרלוקין-33 (IL-33) המופרש על ידי אסטרוציטים מווסת הומאוסטזיס סינפסה בתלמוס ובחוט השדרה באמצעות השפעותיו על מיקרוגליה, אם כי זה עדיין לא נחקר בבני אדם13. מיקרוגליה מפרישה מגוון ציטוקינים המסייעים בשמירה על בריאות העצבים, כגון גורם נמק גידול α (TNFα), IL-1β, IL-6, IL-10 ואינטרפרון-γ (IFN-γ) וציטוקינים אלה יכולים לווסת את עמוד השדרה הדנדריטי ואת היווצרות הסינפסות 16,17,18. ישנם פערים משמעותיים בידע שלנו על אינטראקציות עצב-מיקרוגליה במהלך התפתחות המוח האנושי. רוב הידע שלנו מגיע ממחקרים ממודלים של מכרסמים, בעוד שיש מחסור במידע על ההיבטים הטמפורליים והמכניסטיים של גיזום סינפטי בקליפת המוח האנושית. מיקרוגליה תומכת בהישרדות עצבית בניאו-קורטקס, וסוגי תאים אחרים תורמים גם הם1. לא ברור כיצד מיקרוגליה תורמת לשימור זה ומה יחסי הגומלין בין מיקרוגליה לסוגי התאים האחרים. מיקרוגליה משחררת מספר ציטוקינים המשפיעים על התפתחות עצבית וסינפטית, אך הבסיס המכניסטי של השפעותיהם של ציטוקינים אלה בתאי עצב אינו ידוע ברובו19,20. על מנת לפתח הבנה מלאה יותר של תפקוד המיקרוגליה במוח האנושי, חיוני לחקור את האינטראקציות שלה עם סוגי תאים שונים שנמצאים במוח האנושי. דוח זה מתאר שיטה לתרבית משותפת של נוירונים אנושיים שמקורם ב-iPSC ומיקרוגליה שנוצרו מאותו אדם. ביסוס מתודולוגיה זו יאפשר חקירות מוגדרות היטב לחקור את אופי האינטראקציות בין מיקרוגליה-עצב ולפתח מודלים תאיים חזקים במבחנה לחקר תפקוד נוירו-אימוני בהקשר של הפרעות נוירו-התפתחותיות ונוירו-פסיכיאטריות שונות.

תפקיד המיקרוגליה בסכיזופרניה
גיזום סינפטי הוא תהליך נוירו-התפתחותי מרכזי המתרחש במוח המתבגר21,22. קווי ראיות מרובים מצביעים על כך שגיזום סינפטי בתקופה קריטית זו אינו תקין בסכיזופרניה (SCZ)23,24,25,26. SCZ היא הפרעה פסיכיאטרית כרונית ומתישה המאופיינת בהזיות, אשליות, תהליכי חשיבה מופרעים וליקויים קוגניטיביים23,24. מיקרוגליה, המקרופאגים השוכנים במוח, ממלאים תפקיד מרכזי בגיזום סינפטי25,26. מחקרי טומוגרפיה לאחר המוות ופליטת פוזיטרונים (PET) מראים עדויות לפעילות מיקרוגליאלית לא מתפקדת ב-SCZ 25,26,27,28,29,30,31,32. מוחות SCZ לאחר המוות מראים הבדלים משוכפלים היטב אך עדינים במוח - נוירונים פירמידליים בשכבה הקורטיקלית III מראים ירידה בצפיפות עמוד השדרה הדנדריטית ופחות סינפסות 33,34,35. גיזום סינפטי הוא תהליך שבו קשרים סינפטיים מעוררים מיותרים מסולקים על ידי מיקרוגליה במהלך גיל ההתבגרות, כאשר חולי SCZ בדרך כלל חווים את ההפסקה הפסיכוטית הראשונה שלהם22,36. מחקרים שלאחר המוות מראים קשר בין SCZ להפעלת מיקרוגליה, עם צפיפות מוגברת של מיקרוגליה במוח SCZ, כמו גם ביטוי מוגבר של גנים פרו-דלקתיים27. בנוסף, מחקרי PET של מוחות אנושיים המשתמשים ברדיוליגנדים להפעלת מיקרוגליה מראים רמות מוגברות של מיקרוגליה מופעלת בקליפת המוח 25,26,27,28. מחקרי אסוציאציה כלל-גנומיים אחרונים (GWAS) מראים כי הקשר הגנטי החזק ביותר ל-SCZ שוכן בלוקוס קומפלקס התאימות ההיסטולוגית העיקרי (MHC), וקשר זה נובע מאללים של הגנים המשלימים מרכיב 4 (C4) המעורבים בתיווך גיזום סינפטי לאחר הלידה במכרסמים37. קשר זה סיפק תמיכה נוספת להשערה כי גיזום חריג על ידי מיקרוגליה עלול לגרום לירידה בצפיפות עמוד השדרה הדנדריטית הנראית במוח SCZ לאחר המוות. חקירות של מעורבות מיקרוגליה בגיזום סינפטי ב-SCZ הוגבלו עד כה למחקרים עקיפים עם הדמיית PET או מסקנות מחקירות של מוחות לאחר המוות.

יצירת מיקרוגליה אנושית במעבדה
מיקרוגליה ראשונית של עכבר מתורבת שימשה לעתים קרובות בחקר מיקרוגליה, אם כי ישנן מספר אינדיקציות לכך שמיקרוגליה של מכרסמים עשויה שלא לייצג את האנטומיה של המיקרוגליה האנושית ואת ביטוי הגנים (טבלה 1)38. מספר מחקרים גם הבדילו בין מיקרוגליה ישירות למונוציטים בדם באמצעות טרנסדיפרנציאציה 39,40,41,42. תאים דמויי מיקרוגליה שמקורם במונוציטים בדם מציגים הבדלים גדולים ממיקרוגליה אנושית בפרופיל ביטוי גנים וחלבונים בתגובות פרו-דלקתיות, ונראה שהם דומים יותר למקרופאגים בביולוגיה שלהם43. ההתקדמות המתודולוגית האחרונה מאפשרת כעת יצירת מיקרוגליה מ-iPSCs אנושיים, המספקים הזדמנויות לחקור מיקרוגליה חיה הדומה יותר לביולוגיה של מיקרוגליה הנמצאת במוח האנושי (טבלה 2). תאי מיקרוגליה אלה שמקורם ב-iPSC הוכחו כמסכמים את הפנוטיפ, פרופילי ביטוי הגנים והתכונות התפקודיות של מיקרוגליה אנושית ראשונית 44,45,46,47,48. מאמר זה מספק שיטה לתרבית משותפת של נוירונים אנושיים שמקורם ב-iPSC ומיקרוגליה שנוצרו מאותו אדם על מנת לפתח מודלים מותאמים אישית במבחנה של אינטראקציות עצב-מיקרוגליה. עבור מודל זה של תרבית משותפת במבחנה, הותאם פרוטוקול התמיינות מיקרוגליאלית מקבוצת פוסאטי (טבלה 3) ושולב עם גרסה מותאמת של פרוטוקול יצירת עצבים בקליפת המוח מקבוצת ליבסי (טבלה 4)49,50.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

תאי ה-iPSC האנושיים ששימשו במחקר זה תוכנתו מחדש מפיברובלסטים שהושגו באמצעות הסכמה מדעת של נבדקי ביקורת בריאים, באישור מועצת הביקורת המוסדית (IRB). התכנות מחדש והאפיון של iPSCs ששימשו במחקר זה (ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292) תוארו במחקר קודם51.

1. תחזוקה של iPSCs

  1. הכן דילול של 1:50 של מטריצת ממברנת הבסיס ללא גורם גדילה מופחת ללא LDEV ב-DMEM/F12 ללא פנול אדום וציפוי מראש של צלחת בת 6 בארות עם 1 מ"ל של התמיסה המדוללת למשך שעתיים לפחות ב-37 מעלות צלזיוס לפני הפשרת מלאי התאים.
  2. הפשירו את מלאי iPSC השמור בהקפאה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. הוסף את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל של DMEM/F12. סובב את התאים כלפי מטה ב -300 x גרם למשך 5 דקות.
  3. הסר את תמיסת הציפוי מלוח מטריצת ממברנת הבסיס ללא LDEV מצופה מראש והוסף 1 מ"ל של מדיום תאי גזע (SCM) עם מעכב סלע של 10 מיקרומטר (Y-27632).
  4. השעו מחדש את גלולת התא ב-SCM עם 10 מיקרומטר Y-27632 והוסיפו לצלחת המצופה מראש לנפח סופי של 2 מ"ל של SCM בתוספת Y-27632. שמור על תרביות תאי iPSC במדיום זה למשך 24 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
  5. החלף את המדיום ב-2 מ"ל של SCM טרי ללא Y-27632 24 שעות לאחר ההפשרה.
  6. לאחר ש-iPSCs מגיעים למפגש של 80-90%, העבירו אותם על צלוחיות של 75 מ"ל המצופות במטריצת ממברנת בסיס ללא LDEV.
    1. תאי מעבר על ידי שטיפה ראשונה של תאים עם HBSS והסרתם לאחר שהניחו לשבת במשך 30 שניות. הוסף 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים ודגירה למשך 4 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. הכן את הצלחת עם SCM המכיל 10 מיקרומטר Y-27632.
    2. שאפו מגיב דיסוציאציה של תאים לא אנזימטיים והוסיפו 1 מ"ל של SCM + 10 מיקרומטר Y-27632 לכל באר. מגרדים בעדינות את הבאר בעזרת מרים תאים ומשיגים תאים עם פיפטה של 1000 מיקרוליטר.
    3. הפקדת תאים על מקדם גדילה מופחת ללא LDEV ממברנת מרתף מצופה מטריצת בקבוק 75 מ"מ בנפח כולל של 8 מ"ל SCM + Y-27632.

2. התמיינות מיקרוגליה

הערה: סכמטית המתארת את פרוטוקול התמיינות המיקרוגליה מתוארת באיור 1A. המדיה חוממה לטמפרטורת החדר לפני השימוש.

  1. יום 0: בצעו שינוי מדיום מלא עם מדיום SCM בתוספת 80 ננוגרם/מ"ל BMP-4. בצעו החלפת מדיום יומית עם אותו מדיום במהלך הימים 1-3, ללא כל שטיפה בין החלפות בינוניות.
  2. יום 4: הכינו יום 4-5 בינוני: מדיום המטופויאטי (HM), בתוספת 25 ננוגרם/מ"ל FGF, 100 ננוגרם/מ"ל SCF ו-80 ננוגרם/מ"ל VEGF. הסר את המדיום והחלף במדיום יום 4-5 המכיל 5 מיקרומטר Y-27632.
    הערה: תאים מתחילים לצוף בשלב זה - כמחצית מהתאים צפים, ומחציתם נצמדים.
  3. יום 6: הכינו יום 6-13 בינוני: HM בתוספת 50 ננוגרם/מ"ל SCF, 50 ננוגרם/מ"ל IL-3, 5 ננוגרם/מ"ל TPO, 50 ננוגרם/מ"ל מ"ל מ-CSF ו-50 ננוגרם/מ"ל Flt3-L. אספו את הסופרנטנט, הוסיפו לצינור חרוטי של 15 מ"ל וסובבו במשך 8 דקות ב-300 x גרם. יש להשעות את הגלולה בבקבוק עם 8 מ"ל של מדיום יום 6-13 בתוספת 5 מיקרומטר Y-27632.
  4. יום 10: הוסף 8 מ"ל של יום 6-13 בינוני על גבי המדיום הקיים.
  5. יום 14: הכנה ליום 14+ בינוני: HM בתוספת 50 ננוגרם/מ"ל m-CSF, 50 ננוגרם/מ"ל Flt3-L, 50 ננוגרם/מ"ל GM-CSF. אוספים את הסופרנטנט, מוסיפים לצינור חרוטי של 50 מ"ל וסובבים במשך 8 דקות ב-300 x גרם. יש להשעות את הגלולה ב-8 מ"ל של מדיום יום 14+ המכיל 5 מיקרומטר Y-27632 ולהמשיך לתרבית במדיום זה.
  6. יום 18: הוסיפו 8 מ"ל של מדיום Day14+.
  7. יום 22: הוסיפו 8 מ"ל של מדיום Day14+ טרי מבלי להסיר את המדיום הקיים.
  8. יום 25: העבר תאים לשלב 2.9 או המשך לשמור במדיום Day14+ עד היום ה-50 של ההתמיינות.
  9. לאחר היום ה-25, אספו את הסופרנטנט בצינור חרוטי של 50 מ"ל וסובבו במשך 8 דקות בטמפרטורה של 300 x גרם.
    1. הכן מדיום דבק: RPMI בתוספת של 1% מ-200 מ"מ L-alanyl-L-גלוטמין דיפפטיד בתמיסת NaCl של 0.85%, 25 ננוגרם/מ"ל GM-SCF ו-100 ננוגרם/מ"ל IL-34.
    2. השהה מחדש את הגלולה בתווך הדבק המכיל 5 מיקרומטר Y-27632.
    3. תאי צלחת בצפיפות של 50,000 תאיםלסמ "ר על צלחות של 24 בארות לניסויים שונים: צלחות מצופות מטריצת קרום בסיסי ללא LDEV למונוקולטורה מיקרואלית, 10 מיקרוגרם/מ"ל פולי-L-אורניתין ו-10 מיקרוגרם/מ"ל לוחות הדמיה מזכוכית מצופים למינין לניסויי הדמיה.
    4. לדלל פולי-L-אורניתין ולמינין ב-DPBS ולהוסיף 250 מיקרוליטר לבאר עבור צלחת הדמיה של 24 בארות.
      הערה: תאים בתרבית נדבקים כעת בטבע (איור 1C).
  10. שמור על תאים בתרבית למשך 14 יום לפחות, עם שינויים בינוניים דו-שבועיים. לאחר היום ה-14 לאחר ההדבקה, התאים הגיעו לבגרות וניתן להשתמש בהם לניסויים.

3. התמיינות נוירונים בקליפת המוח

הערה: סכמטי המתאר את פרוטוקול התמיינות הנוירונים בקליפת המוח מתואר באיור 1G.

  1. יום 0:
    1. ברגע ש-iPSCs מתכנסים על לוחות מצופים מטריצת ממברנת מרתף ללא LDEV, עברו מ-SCM לתערובת של 50/50 של מדיום N2/B27 בתוספת 10 מיקרומטר SB431542, 1 מיקרומטר דורסומורפין, 100 ננומטר LDN193189.
      הערה: מדיום N2 מורכב ממדיום בסיסי בתוספת תוסף N-2% 1%, 1% 200 מ"מ L-alanyl-L-גלוטמין דיפפטיד בתמיסת NaCl של 0.85%, 1% עט/סטרפטוקוק. מדיום B27 מורכב מ-DMEM/F12 בתוספת 2% תוסף B-27, 1% 200 מ"מ L-alanyl-L-גלוטמין דיפפטיד בתמיסת NaCl 0.85%, 1% עט/סטרפטוקוק.
    2. החלף את המדיום עם התוספים הנ"ל שנוספו מדי יום למשך 7 ימים.
  2. יום 7:
    1. ציפוי מראש של צלחות במטריצת ממברנת הבסיס ללא LDEV למשך שעתיים לפחות.
    2. מעבר תאי 1:1 על גבי לוחות מצופים מראש. שטפו תאים עם 1 מ"ל/באר HBSS והסירו לאחר שנתנו לו לשבת במשך 30 שניות. יש להוסיף 1 מ"ל/באר של מדיום ניתוק תאים (למשל, Accutase) ולדגור במשך 4-5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בזמן הדגירה, הכינו צינורות חרוטיים של 15 מ"ל עם 5 מ"ל DMEM.
    3. פיפטה בעדינות חומר דיסוציאציה אנזימטי להסרת תאים מהצלחת בעזרת פיפטור P1000. אסוף חומר דיסוציאציה אנזימטי ותערובת תאים בצינור החרוטי של 15 מ"ל המכיל 5 מ"ל DMEM.
    4. צנטריפוגה את הצינורות למשך 5 דקות בטמפרטורה של 300 x גרם. השעו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של מדיום N2/B27 המכיל 10 מיקרומטר Y-27632. המשיכו להאכיל מדי יום עם מדיום N2/B27 ללא תוספי מזון.
  3. יום 12: מעבר תאי 1:1 בשיטות המתוארות ב-3.2.2. המשיכו בהאכלה יומית עם מדיום N2/B27.
  4. יום 15/16: מעבר תאי 1:2 בשיטות המתוארות ב-3.2.2. המשיכו בהאכלה יומית עם מדיום N2/B27.
  5. יום 18/19: מעבר תאי 1:3 בשיטות המתוארות ב-3.2.2. המשיכו בהאכלה יומית עם N2/B27 בינוני עד היום ה-25.
  6. יום 25: הזנת תאי עם מדיום N2/B27 בתוספת 10 מיקרומטר של DAPT.
  7. יום 28: האכילו תאים במדיום N2/B27 טרי ולא מטופל.
  8. יום 30: מעבר תאים בשיטות המתוארות ב-3.2 על צלחות תרבית מיקרוגליה ושמירה במדיום BrainPhys בתוספת תוסף B-27 1%.

4. תרבויות משותפות של מיקרוגליה/נוירונים

  1. יום צלחת 30 נוירונים בקליפת המוח על גבי תרביות מיקרוגליה בצפיפות של 50,000 תאיםלסמ"ק. תוסף מדיום עם למינין 1 מיקרוגרם/מ"ל לשיפור היצמדות התאים.
  2. יש לשמור על תרביות בתערובת של 50% מדיום דבק ו-50% מדיום Brainohys בתוספת תוסף B-27 1%. בצע שינוי חצי בינוני פעמיים בשבועיים עד להתנסות.
  3. בצעו ניסויים אחרי שתאי עצב מגיעים ליום ה-60.

5. טיפול באינטרפרון-γ

  1. הכן מדיום טרי בתוספת 100 ננוגרם/מ"ל IFN-γ. מוסיפים את המדיום ונותנים לו לדגור במשך 24 שעות. הסר את המדיום והמשך להתנסות.

6. אימונוציטוכימיה

  1. תקן תאים בצלחת התרבות עם 100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  2. שוטפים תאים ב -1 מ"ל PBS שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחד.
  3. הוסף 1 מ"ל PBST (PBS + 0.1% Triton X) למשך 10 דקות.
  4. הוסף חוצץ חוסם: 1 מ"ל PBS בתוספת 5% סרום עיזים למשך שעה.
  5. יש להוסיף נוגדן ראשוני מדולל ב-100 מיקרוליטר PBS + 1% סרום עיזים - למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. בצע אופטימיזציה של כל הנוגדנים העיקריים בהתאם.
  6. שוטפים תאים ב -1 מ"ל PBS שלוש פעמים למשך 5 דקות כל אחד.
  7. הוסף נוגדן משני, מדולל ב -100 מיקרוליטר PBS בתוספת סרום עיזים 1% - למשך שעה בטמפרטורת החדר.

7. ניתוח עמוד שדרה

  1. השג תמונות במיקרוסקופ קונפוקלי בהגדלה של פי 60.
  2. השתמש בפונקציית ImageJ NeuronJ52 כדי לנתח תמונות.
  3. השג מדידות עבור אורך נויריט, אורך עמוד השדרה וספירת עמוד השדרה באמצעות NeuronJ.

8. הדמיית סידן

  1. הכן מדיום טרי עם צבע Fluo-4AM 3 מיקרומטר. דגירה של תרבויות משותפות במדיום זה למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן שטפו את התאים עם PBS, הוסיפו תמיסת הדמיה של תאים חיים לתאים והמשיכו להדמיה.
  2. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד להדמיית תאים חיים, קבל תמונות זמן-lapse ב-40x למשך 2 דקות. ניתן לרשום פעילות בנקודת ההתחלה, עם חשיפה ל-15 מ"מ גלוטמט, או במצב של דה-פולריזציה עם 5 מ"מ אשלגן כלורי.
  3. באמצעות ImageJ, מדוד את עוצמת הקרינה לאורך זמן עבור גופי תאים בודדים. בעזרת כלי הבחירה, בחר אזור עניין בודד (ROI) המקיף כל גוף תא. פתח את מנהל ההחזר על ההשקעה ולחץ על הוסף כדי לבחור. המשך להוסיף בחירות חדשות למנהל ההחזר על ההשקעה.
  4. השתמשו בכלי Set Measurements למדידת שטח אפור ממוצע. כאשר מספר גופי התאים הרצויים נוסף למנהל ההחזר על ההשקעה, בחר את כולם ולאחר מכן השתמש בכלי Multi-Measure . פעולה זו תספק קריאה של האזור האפור הממוצע עבור כל אחד מהם במהלך הזמן של קובץ הווידאו. הנתונים המיוצאים יתנו את עוצמת הקרינה הממוצעת עבור אזור העניין עבור כל מסגרת.
  5. קבע את יחס עוצמת הקרינה, F/F0, כאשר F היא עוצמת הקרינה בזמן נתון ו-F0 היא עוצמת הקרינה הראשונית. ניתן לשרטט את F/F0 לאורך זמן כדי לבחון פעילות ספונטנית בתאי עצב או לבחון בעוצמה הפלואורסצנטית המקסימלית במסגרת הגירוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

אימות פרוטוקול
המיקרוגליה שמקורה ב-iPSC נוצרה משבעה קווי iPSC בשלושה סבבים שונים של התמיינות. נעשה שימוש בקווי iPSC בקרה ML27, ML56, ML292 ו-ML364 וסכיזופרניה קווי iPSC ML40, ML141 ו-ML250. אפיון קווי iPSC אלה תואר בעבר51. מיקרוגליה זו שמקורה ב-iPSC אומתה באמצעות ICC ו-qPCR. מיקרוגליה שנוצרה מהפרוטוקול המותאם הציגה מורפולוגיה מסועפת טיפוסית של מיקרוגליה (איור 1C), וביטא סמני מיקרוגליה CD11c, TMEM119 ו-IBA1, כפי שנבדק על ידי אימונוציטוכימיה (

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

הפיתוח של שיטות התמיינות לאורך מסלולים שונים לתאי גזע פלוריפוטנטיים פתח אפיקים רבים לחקר תפקוד המוח ותהליכי מחלה 53,54,55. מחקרים ראשוניים התמקדו בהתפתחות של סוגי תאים עצביים ספציפיים המשוערים כחשובים בהפרעות מוח ספציפיות56,57. לאחרונה, אורגנואידים במוח סיפקו גם דרכים חדשות לחקור ביולוגיה של מחלות באמצעות מודלים תלת מימדיים ספציפיים למטו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי פרס המכון הלאומי למחקר ביו-התנהגותי לבריאות הנפש למדענים חדשים חדשים (BRAINS) R01MH113858 (ל-R.K.), פרס פיתוח מדענים קליניים של המכון הלאומי לבריאות הנפש K08MH086846 (ל-R.K.), פרס פיתוח המדענים הקליניים של קרן הצדקה דוריס דיוק (ל-R.K.), הקרן הדו-קוטבית של ריאן ליכט סאנג (ל-R.K.), קרן משפחת ז'אן מארי לי-אוסטרהאוס ופרס החוקר הצעיר של NARSAD מהקרן לחקר המוח וההתנהגות (ל-A.K.), קרן פיליס וג'רום לייל רפפורט (ל-R.K.), מכון תאי הגזע של הרווארד (ל-R.K.) ועל ידי סטיב וויליס ואליסה פרויד (ל-R.K). אנו רוצים להודות לד"ר ברוס מ. כהן ולד"ר דונה מקפי מבית הספר לרפואה של הרווארד ובית החולים מקלין על שסיפקו לנו את הפיברובלסטים ששימשו במחקר.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
AccutaseSigma-AldrichA6964
B-27 תוסףGibco17504044
b-FGFPeprotech100-18B
BMP-4Peprotech120-05ET
BrainphysStemCell Technologies5790
CD11C נוגדן Biolegend337207דילול 1:200
צלחות תרבית תאים תחתונות שטוחות של Costarקורנינג07-200-83
נוגדן Ctip2Abcamab18465
CUTL1 נוגדן חד שבטיAbnovaH00001523-M01
DMEM/F-12, ללא פנול אדוםGibco21041025
dorsomorphinSigma-AldrichP5499
DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיוםGibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Sigma-AldrichD6421
EasYFlask צלוחיות תרבית תאיםNunc156499
Fisherbrand Cell LiftersFisher Scientific08-100-240
Flt3-LigandPeprotech300-19
Fluo4-AMLife TechnologiesF-14201
Geltrex LDEV ללא RGF BME 1 מ"לThermoFisher ScientificA1413201
GlutamaxThermoFisher Scientific35050061
GM-CSFPeprotech300-03
עיזים אנטי עוף- IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150169דילול 1:1000
עיזים נגד עכבר- IgG H& L (Alexa Fluor 568)InvitrogenA-11004דילול 1:1000
עז נגד חולדות- IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175670דילול 1:1000
חזיר עז נגד גינאה IgG H& L (Alexa Fluor 405)Abcamab175678דילול 1:1000
סרום עיזיםSigma-AldrichG9023
HBSSInvitrogen14170120
IBA1 נוגדן Abcamab5076דילול 1:500
IL-34Peprotech200-34
INF-yPeprotech300-02
KiCqStart SYBR Green PrimersSigma-AldrichKSPQ12012
LamininSigma-AldrichL2020
LDN193189Sigma-AldrichSML0599
תמיסת הדמיה של תאים חייםInvitrogenA14291DJ
MAP2 מערכותסינפטיות188 004
M-CSFPeprotech300-25
תוסף N-2Gibco17502001
NeurobasalMedium Life Technologies21103049
NutriStem hPSC XF MediumBiological Industries01-0005
P2RY12 נוגדןBiolegend848002
Paraformaldehyde 16%Fisher Scientific50-980-488
פניצילין-סטרפטומיציןGibco15140122
Poly-L-OrthinineSigma-AldrichP3655
SATB2 נוגדןAbcamAB51502
SB431542Sigma-AldrichS4317
SCFStemcell Technologies78062
SensoPlate 24 בארות צלחת זכוכית תחתונהGreiner-Bio662892
StemPro-34 SFM (1X)Gibco10639011
נוגדן TMEM119Abcamab185333דילול 1:1000
TPOPeprotech300-18
Triton-XSigma-Aldrich9002-93-1
VEGFPeprotech100-20
VerseneThermoFisher Scientific15040066
Y-27632 דיהידרוכלוריד (מעכב ROCK)טוקריס1254

מקורות

  1. Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and beyond: Innate immune cells as regulators of brain development and behavioral function. Frontiers in Immunology. 9, 698(2018).
  2. Hoshiko, M., Arnoux, I., Avignone, E., Yamamoto, N., Audinat, E. Deficiency of the microglial receptor CX3CR1 impairs postnatal functional development of thalamocortical synapses in the barrel cortex. Journal of Neuroscience. 32 (43), 15106-15111 (2012).
  3. Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
  4. Hagemeyer, N., et al. Microglia contribute to normal myelinogenesis and to oligodendrocyte progenitor maintenance during adulthood. Acta Neuropathologica. 134 (3), 441-458 (2017).
  5. Lenz, K. M., Nugent, B. M., Haliyur, R., McCarthy, M. M. Microglia are essential to masculinization of brain and behavior. Journal of Neuroscience. 33 (7), 2761-2772 (2013).
  6. Miyamoto, A., et al. Microglia contact induces synapse formation in developing somatosensory cortex. Nature Communications. 7 (1), 1-12 (2016).
  7. Pont-Lezica, L., et al. Microglia shape corpus callosum axon tract fasciculation: Functional impact of prenatal inflammation. European Journal of Neuroscience. 39 (10), 1551-1557 (2014).
  8. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent. Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).
  9. Hornik, T. C., Vilalta, A., Brown, G. C. Activated microglia cause reversible apoptosis of pheochromocytoma cells, inducing their cell death by phagocytosis. Journal of Cell Science. 129 (1), 65-79 (2016).
  10. Brown, G. C., Neher, J. J. Microglial phagocytosis of live neurons. Nature Reviews Neuroscience. 15 (4), 209-216 (2014).
  11. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7 (4), 483-495 (2010).
  12. Schafer, D. P., et al. Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression. Elife. 5, 15224(2016).
  13. Vainchtein, I. D., et al. Astrocyte-derived interleukin-33 promotes microglial synapse engulfment and neural circuit development. Science. 359 (6381), 1269-1273 (2018).
  14. Datwani, A., et al. Classical MHCI molecules regulate retinogeniculate refinement and limit ocular dominance plasticity. Neuron. 64 (4), 463-470 (2009).
  15. Färber, K., et al. C1q, the recognition subcomponent of the classical pathway of complement, drives microglial activation. Journal of Neuroscience Research. 87 (3), 644-652 (2009).
  16. Wlodarczyk, A., et al. A novel microglial subset plays a key role in myelinogenesis in developing brain. The EMBO Journal. 36 (22), 3292-3308 (2017).
  17. Lim, S. -H., et al. Neuronal synapse formation induced by microglia and interleukin 10. PloS One. 8 (11), 81218(2013).
  18. Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
  19. Shin, W. H., et al. Microglia expressing interleukin-13 undergo cell death and contribute to neuronal survival in vivo. Glia. 46 (2), 142-152 (2004).
  20. Giulian, D., Li, J., Leara, B., Keenen, C. Phagocytic microglia release cytokines and cytotoxins that regulate the survival of astrocytes and neurons in culture. Neurochemistry International. 25 (3), 227-233 (1994).
  21. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  22. Giedd, J. N., et al. Brain development during childhood and adolescence: A longitudinal MRI study. Nature Neuroscience. 2 (10), 861-863 (1999).
  23. Lewis, D. A., Lieberman, J. A. Catching up on schizophrenia: Natural history and neurobiology. Neuron. 28 (2), 325-334 (2000).
  24. Jablensky, A. Epidemiology of schizophrenia: The global burden of disease and disability. European Archives of Psychiatry and Clinical Neuroscience. 250 (6), 274-285 (2000).
  25. Van Berckel, B. N., et al. Microglia activation in recent-onset schizophrenia: A quantitative (R)-[11C] PK11195 positron emission tomography study. Biological Psychiatry. 64 (9), 820-822 (2008).
  26. Doorduin, J., et al. Neuroinflammation in schizophrenia-related psychosis: a PET study. Journal of Nuclear Medicine. 50 (11), 1801-1807 (2009).
  27. Van Kesteren, C., et al. Immune involvement in the pathogenesis of schizophrenia: a meta-analysis on postmortem brain studies. Translational Psychiatry. 7 (3), 1075(2017).
  28. Bloomfield, P. S., et al. Microglial activity in people at ultra high risk of psychosis and in schizophrenia: An [11C] PBR28 PET brain imaging study. American Journal of Psychiatry. 173 (1), 44-52 (2016).
  29. Fillman, S., et al. Increased inflammatory markers identified in the dorsolateral prefrontal cortex of individuals with schizophrenia. Molecular Psychiatry. 18 (2), 206-214 (2013).
  30. Radewicz, K., Garey, L. J., Gentleman, S. M., Reynolds, R. Increase in HLA-DR immunoreactive microglia in frontal and temporal cortex of chronic schizophrenics. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 59 (2), 137-150 (2000).
  31. Steiner, J., et al. Distribution of HLA-DR-positive microglia in schizophrenia reflects impaired cerebral lateralization. Acta Neuropathologica. 112 (3), 305-316 (2006).
  32. De Picker, L. J., Morrens, M., Chance, S. A., Boche, D. Microglia and brain plasticity in acute psychosis and schizophrenia illness course: a meta-review. Frontiers in Psychiatry. 8, 238(2017).
  33. Garey, L., et al. Reduced dendritic spine density on cerebral cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. 65 (4), 446-453 (1998).
  34. Glantz, L. A., Lewis, D. A. Decreased dendritic spine density on prefrontal cortical pyramidal neurons in schizophrenia. Archives of General Psychiatry. 57 (1), 65-73 (2000).
  35. Konopaske, G. T., Lange, N., Coyle, J. T., Benes, F. M. Prefrontal cortical dendritic spine pathology in schizophrenia and bipolar disorder. JAMA Psychiatry. 71 (12), 1323-1331 (2014).
  36. Petanjek, Z., et al. Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 108 (32), 13281-13286 (2011).
  37. Sekar, A., et al. Schizophrenia risk from complex variation of complement component 4. Nature. 530 (7589), 177-183 (2016).
  38. Landry, R. P., Jacobs, V. L., Romero-Sandoval, E. A., DeLeo, J. A. Propentofylline, a CNS glial modulator does not decrease pain in post-herpetic neuralgia patients: In vitro evidence for differential responses in human and rodent microglia and macrophages. Experimental Neurology. 234 (2), 340-350 (2012).
  39. Sievers, J., Parwaresch, R., Wottge, H. U. Blood monocytes and spleen macrophages differentiate into microglia-like cells on monolayers of astrocytes: morphology. Glia. 12 (4), 245-258 (1994).
  40. Simard, A. R., Rivest, S. Bone marrow stem cells have the ability to populate the entire central nervous system into fully differentiated parenchymal microglia. The FASEB Journal. 18 (9), 998-1000 (2004).
  41. Asheuer, M., et al. Human CD34+ cells differentiate into microglia and express recombinant therapeutic protein. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 101 (10), 3557-3562 (2004).
  42. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: Dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Scientific Reports. 4 (1), 1-7 (2014).
  43. Melief, J., et al. Characterizing primary human microglia: A comparative study with myeloid subsets and culture models: Characterizing primary human microglia. Glia. 64 (11), 1857-1868 (2016).
  44. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nature Medicine. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  45. Abud, E. M., et al. iPSC-derived human microglia-like cells to study neurological diseases. Neuron. 94 (2), 278-293 (2017).
  46. Pandya, H., et al. Differentiation of human and murine induced pluripotent stem cells to microglia-like cells. Nature Neuroscience. 20 (5), 753-759 (2017).
  47. Pocock, J. M., Piers, T. M. Modelling microglial function with induced pluripotent stem cells: an update. Nature Reviews Neuroscience. 19 (8), 445-452 (2018).
  48. Haenseler, W., et al. A highly efficient human pluripotent stem cell microglia model displays a neuronal-co-culture-specific expression profile and inflammatory response. Stem Cell Reports. 8 (6), 1727-1742 (2017).
  49. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Reports. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  50. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
  51. Kathuria, A., et al. Transcriptomic landscape and functional characterization of induced pluripotent stem cell-derived cerebral organoids in schizophrenia. JAMA Psychiatry. 77 (7), 745-754 (2020).
  52. Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry Part A: The journal of the International Society for Analytical Cytology. 58 (2), 167-176 (2004).
  53. Watmuff, B., et al. Disease signatures for schizophrenia and bipolar disorder using patient-derived induced pluripotent stem cells. Molecular and Cellular Neuroscience. 73, 96-103 (2016).
  54. Karmacharya, R., Haggarty, S. J. Stem cell models of neuropsychiatric disorders. Molecular and Cellular Neurosciences. 73, 1(2016).
  55. Karmacharya, R., Kieling, C., Mondelli, V. Integrating stem cell-based experiments in clinical research. European Psychiatry. 63 (1), (2020).
  56. Kathuria, A., et al. Synaptic deficits in iPSC-derived cortical interneurons in schizophrenia are mediated by NLGN2 and rescued by N-acetylcysteine. Translational Psychiatry. 9 (1), 1-13 (2019).
  57. Watmuff, B., Liu, B., Karmacharya, R. Stem cell-derived neurons in the development of targeted treatment for schizophrenia and bipolar disorder. Pharmacogenomics. 18 (5), 471-479 (2017).
  58. Kathuria, A., et al. Transcriptome analysis and functional characterization of cerebral organoids in bipolar disorder. Genome Medicine. 12, 1-16 (2020).
  59. Kathuria, A., Lopez-Lengowski, K., Watmuff, B., Karmacharya, R. Comparative transcriptomic analysis of cerebral organoids and cortical neuron cultures derived from human induced pluripotent stem cells. Stem Cells and Development. 29 (21), 1370-1381 (2020).
  60. Pong, S., Lizano, P., Karmacharya, R. Derivation, expansion, cryopreservation and characterization of brain microvascular endothelial cells from human induced pluripotent stem Cells. Journal of Visualized Experiments: Jove. (165), e61629(2020).
  61. Pong, S., Karmacharya, R., Sofman, M., Bishop, J. R., Lizano, P. The Role of Brain Microvascular Endothelial Cell and Blood-Brain Barrier Dysfunction in Schizophrenia. Complex Psychiatry. 6 (1-2), 30-46 (2020).
  62. Goshi, N., Morgan, R. K., Lein, P. J., Seker, E. A primary neural cell culture model to study neuron, astrocyte, and microglia interactions in neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 155(2020).
  63. Roqué, P. J., Costa, L. G. Co-Culture of Neurons and Microglia. Current Protocols in Toxicology. 74 (1), 11-17 (2017).
  64. Warre-Cornish, K., et al. Interferon-γ signaling in human iPSC-derived neurons recapitulates neurodevelopmental disorder phenotypes. Science Advances. 6 (34), (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

iPSCReal Time PCR
הסרטון יגיע בקרוב

מאמרים קשורים