הכנת רקמות אנושיות משובצות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לניתוח ספקטרומטריית מסה

סיכום

ספינגוליפידים הם מטבוליטים ביו-אקטיביים בעלי תפקידים מבוססים היטב במחלות אנושיות. אפיון שינויים ברקמות עם ספקטרומטריית מסה יכול לחשוף תפקידים באטיולוגיה של מחלות או לזהות מטרות טיפוליות. עם זאת, תרכובת ה-OCT המשמשת לשימור בהקפאה בביו-רפוזיטורים מפריעה לספקטרומטריית מסה. אנו מתארים שיטות לניתוח ספינגוליפידים ברקמות אנושיות המוטמעות ב-OCT עם LC-ESI-MS/MS.

תקציר

ספינגוליפידים הם מרכיבים תאיים שיש להם תפקידים מבוססים היטב בחילוף החומרים ובמחלות אנושיות. ניתן להשתמש בספקטרומטריית מסות כדי לקבוע אם ספינגוליפידים משתנים במחלה ולחקור אם ספינגוליפידים יכולים להיות ממוקדים קלינית. עם זאת, מחקרים פרוספקטיביים המופעלים כראוי הרוכשים רקמות ישירות מחדר הניתוח עשויים לגזול זמן רב, ומאתגרים מבחינה טכנית, לוגיסטית ומנהלית. לעומת זאת, מחקרים רטרוספקטיביים יכולים לנצל דגימות אנושיות בהקפאה שכבר זמינות, בדרך כלל במספרים גדולים, בביו-רפוזיטוריות של רקמות. יתרונות נוספים של רכישת רקמות מביו-רפוזיטוריות כוללים גישה למידע הקשור לדגימות הרקמות, כולל היסטולוגיה, פתולוגיה, ובמקרים מסוימים משתנים קליניים-פתולוגיים, שכולם יכולים לשמש לבחינת קורלציות עם נתוני ליפידומיקה. עם זאת, מגבלות טכניות הקשורות לחוסר תאימות של תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) המשמשת בהקפאה ובספקטרומטריית מסה היא מחסום טכני לניתוח שומנים. עם זאת, הראינו בעבר כי OCT ניתן להסיר בקלות מדגימות biorepository אנושי באמצעות מחזורים של שטיפות וצנטריפוגות מבלי לשנות את התוכן sphingolipid שלהם. כמו כן, קבענו בעבר כי ספינגוליפידים ברקמות אנושיות המוקפאים ב-OCT יציבים עד 16 שנים. בדו"ח זה, אנו מתארים את השלבים ואת זרימת העבודה לניתוח sphingolipids בדגימות רקמות אנושיות המוטמעות ב- OCT, כולל רקמות שטיפה, שקילת רקמות לנורמליזציה של נתונים, מיצוי שומנים, הכנת דגימות לניתוח על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אלקטרוספריי יינון טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-MS/MS), אינטגרציה של נתוני ספקטרומטריית מסה, נורמליזציה של נתונים וניתוח נתונים.

מבוא

ספינגוליפידים הם מטבוליטים ביו-אקטיביים הידועים בתפקידם בחילוף החומרים האנושי ובמחלות ^1,2. הם מווסתים תהליכים תאיים מורכבים כגון נדידת תאים, הישרדות תאים ומוות, תנועת תאים, סחר בשלפוחית, פלישה תאית וגרורות, אנגיוגנזה וייצור ציטוקינים 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . פגמים בוויסות חילוף החומרים של ספינגוליפידים תורמים לייזום והתקדמות של סרטן, קובעים עד כמה סוגי סרטן אגרסיביים, וכיצד סוגי סרטן מגיבים ומפתחים עמידות לטיפול ^3,10. לכן, בגלל ההשפעות הרחבות הללו על האטיולוגיה של המחלה, שיטות אנליטיות שיכולות לקבוע במדויק שינויים sphingolipid ספציפיים למחלה הם כלים חשובים. ספקטרומטריית מסות (MS) היא השיטה המדויקת והאמינה ביותר לניתוח שינויים ספינגוליפידים.

דגימות אנושיות שניתן להשתמש בהן לניתוח של שינויים sphingolipid ניתן להשיג באופן פרוספקטיבי מן הסוויטה כירורגית או בדיעבד מן biorepositories רקמות. רקמות טריות מניתוח הן יתרון מכיוון שניתן לנתח אותן ישירות על ידי טרשת נפוצה או שיטות אנליטיות אחרות. עם זאת, רכישת רקמות באופן פרוספקטיבי כוללת מכשולים אדמיניסטרטיביים, טכניים ולוגיסטיים, ואיסוף דגימות מספיקות כדי להגיע לעוצמה סטטיסטית יכול להיות מאתגר. קבלת רקמות מביו-רפוזיטורים היא יתרון מכיוון שניתן לרכוש אותן בדיעבד, במספרים גדולים, וביו-רפוזיטורים מאשרים היסטולוגיה ופתולוגיה, משתמשים בהליכי הפעלה סטנדרטיים כדי לשמר ולאחסן רקמות באופן קריוגני, ויכולים לספק נתונים קליניים-פתולוגיים שיכולים לשמש לניתוחי קורלציה. עם זאת, כדי לשמר תכונות מולקולריות ומבניות, ביו-רפוזיטורים עשויים להקפיא רקמות על ידי הטמעתן בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT), אשר הראינו מפריעה למבחני נורמליזציה של נתונים ולכימות של ספינגוליפידים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אלקטרוספריי יינון טנדם ספקטרומטריית מסה (LC-ESI-MS/MS⁾¹¹ . כמו כן, הוכח כי אלכוהול פוליוויניל ופוליאתילן גליקול, המרכיבים העיקריים בתרכובת OCT, גורמים לדיכוי יונים בפלטפורמות ניתוח אחרות של טרשת נפוצה^12,13,14,15. לכן, יש להסיר תרכובת OCT מהרקמות לפני ניתוח ספינגוליפידומי על ידי טרשת נפוצה.

בדו"ח קודם, אימתנו פרוטוקול להסרת תרכובת OCT מדגימות אנושיות לניתוח LC-ESI-MS/^{MS 11} ואת המתודולוגיה המשמשת לשקילת רקמות לנורמליזציה של נתונים¹¹. כאן, אנו מפרטים את השלבים של פרוטוקול הסרת תרכובת OCT sphingolipidomic (sOCTrP) ומראים נתונים מייצגים מגידולי אדנוקרצינומה של ריאה אנושית ורקמות לא מעורבות סמוכות רגילות.

פרוטוקול

רקמות ריאה אנושיות שעברו דה-זיהוי התקבלו מליבת האיסוף והניתוח של רקמות ונתונים של אוניברסיטת וירג'יניה (VCU) תחת פרוטוקול מאושר (#HM2471) של ועדת בדיקה פנימית (IRB). השימוש בעכברים למחקר וקציר רקמות עכברים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של VCU (IACUC).

1. הכנת חומרים

הערה: יש לבצע שלבים אלה יום לפני שטיפת הרקמות.

1. לתייג מראש ולשקול צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן 1.5 מ"ל עם קודי זיהוי תמציתיים אך ברורים עבור כל דגימה שתעובד למחרת. השתמש בסמן קבוע עמיד מבחינה כימית (ראה טבלת חומרים) שלא ידהה תחת הטיפול החוזר בצינור.
2. פתח גיליון אלקטרוני ותייג עמודות עוקבות עם כותרות העמודות הבאות: מזהה צינור (ID), שפופרת בלבד, צינור עם רקמה ורקמה כוללת. הזן את מזהי הצינור שיעובדו לעמודה שכותרתה מזהה צינור.
3. כיול מראש ואפס סולם אנליטי. מניחים בקבוק Erlenmeyer נקי 10 מ"ל במרכז צלחת האיזון (הבקבוקון ישמש כמחזיק צינור). סגרו את דלת תא השקילה וטרפדו את המאזניים עם הבקבוקון.
4. שוקלים 1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה. מניחים בזהירות את הצינור בבקבוקון וסוגרים את דלת תא השקילה. אפשרו למשקל להתייצב ורשמו את המשקל בעמודה המסומנת כצינור בלבד.
   הערה: הימנע מהזזת בקבוק Erlenmeyer 10 מ"ל בעת שקילת צינורות. אם הבקבוקון מוזז, מרכזו מחדש את הבקבוקון והגדירו מחדש את האיזון. מניחים את הצינורות הסגורים במדף ומאחסנים עד הצורך.
5. תווית מראש 13 x 100 מ"מ צינורות זכוכית בורג העליון וכובעים עם קודי המזהה ולמלא אותם עם 2 מ"ל של מתנול כיתה LC-MS. מניחים אותם במדף צינורות, מכסים את הצינורות ומאחסנים אותם במקרר (4 מעלות צלזיוס) עד לשימוש.
   הערה: השתמש במתקן ממס עליון לבקבוקים (ראה טבלת חומרים). אם אחד מהם אינו זמין, השתמש בפיפטות זכוכית כדי למנוע שימוש בפלסטיק בעת חלוקת ממיסים אורגניים.
6. תווית מראש 13 x 100 מ"מ זכוכית מבחנות. יש לכסות ולאחסן את המבחנות בטמפרטורת החדר.
7. בקבוקוני autoinjector עם תווית מראש עם קודי זיהוי. כסו ואחסנו את בקבוקוני האוטואינג'קטור בטמפרטורת החדר עד לשימוש.
8. הכינו פתילות לייבוש רקמות.
   1. התחילו בניקוי מספריים כירורגיים על ידי טבילתם במתנול בדרגה LC-MS למשך 5 דקות, ולאחר מכן נגבו אותם עם רקמה נקייה ברמת מעבדה.
   2. בעזרת כפפות נטולות אבקה, סובבו את קצה הרקמה בדרגה מעבדתית (ראו טבלת חומרים) עד שנוצר פתיל מחודד דק בקוטר 30-40 מ"מ.
   3. בעזרת מספריים מנוקים מתנול, חותכים את הפתיל בקצה העבה. מניחים פתילות בקופסת קרטון נקייה. הכפילו את מספר הפתילות מהנדרש כדי לעבד את כל הדגימות.
9. הכינו טיפים מקוצרים של 1 מ"ל פיפטה. בעזרת מספריים כירורגיים המנוקים מתנול, חותכים 4-5 מ"מ מקצה קצה פיפטה של 1 מ"ל, ומניחים את הקצה בחזרה במחזיק הקצה. הכינו פי שניים יותר טיפים מדוגמאות לעיבוד.
   הערה: אלה ישמשו לשליפת רקמות שטופות מצינורות. אין לגעת בקצה הקצה.
10. קדם-צינון ביולוגי מולקולרי כיתה פוספט חצץ מלוחים (PBS) ל 4 °C (0.5 L מספיק). פעולה זו תשמש לאחזור דגימות. עבור כל דגימה שתעובד, לפני צינה (4 מעלות צלזיוס) 60 מ"ל של מים דה-יוניים טהורים במיוחד.
11. הכן תקנים פנימיים של ספקטרומטריית מסה. ממיסים את השומנים הבאים באתנול:מתנול:מים (7:2:1; v/v/v) בריכוז של 25 ננומול/מ"ל: d17:1-ספינגוזין, (2S,3R,4E)-2-אמינוהפטדק-4-ene-1,3-דיול; d17:1-sphingosine-1-פוספט, heptadecasphing-4-enine-1-פוספט; C12-סרמיד (d18:1/C12:0), N-(דודקנויל)-sphing-4-enine; C12-sphingomyelin (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine; C12-גלוקוזילצרמיד (d18:1/C12:0), N-(דודקניל)-1-β-גלוקוזיל-sphing-4-eine; C12-לקטוסילצרמיד (d18:1/C12:0), N-(דודקניל)-1-ß-לקטוזיל-sphing-4-ene.

2. שטיפת רקמות

הערה: השלמת כל השלבים בסעיף 1 יום אחד לפני כן מאפשרת לחוקר מיומן לעבד עד 40 דגימות ביום, ומתחילים ~ 10-15 דגימות ביום. יש להתחיל מוקדם בבוקר ולא להפסיק עד להשלמת כל השלבים בסעיפים 2.1-3.8.

1. ביום שבו הרקמות יעובדו, הכינו את אזור העבודה של ארון הבטיחות הביולוגית על ידי הצטיידות במערבולת, פיפטור סרולוגי טעון במלואו ומגש קרח. עבור כל השלבים בסעיף זה, יש ללבוש PPE מתאים, כולל מעיל מעבדה, שכבה כפולה של כפפות ומשקפי מגן. אזהרה: יש להתייחס לרקמות ונוזלים אנושיים ולהתייחס אליהם כאל חומרים ביו-האזרדיים.
2. לפני צינה (4 מעלות צלזיוס) צנטריפוגת דלי מתנדנדת, כל המתאמים הדרושים להחזקת צינורות צנטריפוגה חרוטיים של 15 מ"ל, ומכסי ביו-בידור של צנטריפוגות. Pre-Chill (4 °C) צנטריפוגה בזווית קבועה המסוגלת להכיל צינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
3. אם רקמות אינן מתמקמות בצינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל פוליפרופילן, השתמש במרית מנוקה מתנול (נקייה עבור כל דגימת רקמה חדשה) כדי להעביר אותן לצינורות פוליפרופילן מסומנים מראש של 15 מ"ל. תייג גם את הכובעים של 15 מ"ל.
   1. הניחו מתלה צינורות המסוגל להכיל צינורות צנטריפוגה של 15 מ"ל במגש קרח ומלאו את המגש בקרח. הפשרת רקמות שיעובדו באותו יום על ידי הנחתן במדף על קרח.
      הערה: יש לבקש לפחות 3-4 מ"ג רקמה מהביו-רפוזיטוריה לעיבוד, שכן הוכח בעבר כי פרוטוקולי שטיפת רקמות ושקילה מדויקים ואמינים במשקלים אלה¹¹.
4. העבירו את מגש הקרח עם הדגימות לארון הבטיחות הביולוגית.
5. בצע שלושה מחזורי sOCTrP¹¹ כמפורט להלן (כלומר, בצע שלבים 2.5.1-2.5.5 שלוש פעמים).
   1. יש להוסיף 10 מ"ל של מים דה-יוניים קרים כקרח וטהורים במיוחד לכל צינור ולכסות אותם היטב. אפשר לצינורות לדגור במשך 10 דקות.
   2. מערבל במרץ כל צינור במשך 10-20 שניות או עד שכל הרקמה שהופקדה על קירות הצינור, או גלולת רקמה, מתחדשת לחלוטין.
      הערה: במחזורי sOCTrP 2-3, חיוני לבצע החייאה של הכדור כך שכל OCT בגלולה ידלל לתמיסת הכביסה.
   3. מעבירים את הצינורות לצנטריפוגת הדלי המתנדנדת המצוננת מראש (4 מעלות צלזיוס). דגימות צנטריפוגות ב 4,000-5,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
      הערה: הימנע מייצור וחשיפה לאירוסולים ביו-האזרדיים הנוצרים במהלך הצנטריפוגה על-ידי איטום נושאי הצנטריפוגות באמצעות מכסה ביו-בידור (ראה טבלת חומרים).
   4. שלפו דגימות מהצנטריפוגה והעבירו למגש הקרח. הניחו את המגש בארון בטיחות ביולוגית ופתחו את הצינורות. שמור את הכובעים.
   5. שאפו בזהירות את תמיסת הכביסה. הימנע משאיפת חומר הרקמה בכדור על ידי השארת ~ 0.5 מ"ל של הסופרנטנט בצינור. כסו את הצינורות והימנעו מזיהום צולב על ידי התאמת כובעים מסומנים לצינורות.
      הערה: תמיסת הכביסה (הסופר-נטנט) בשלב 2.5.5 היא חומר ביו-האזרדי; לטפל ולהשליך אותו בהתאם להנחיות בטיחות ביולוגית המתאימות לדגימות ממקור אנושי.

3. שקילת רקמות (לנורמליזציה של נתונים)

1. לאחר מחזור השטיפה האחרון של sOCTrP, שאפו בזהירות את רוב תמיסת הכביסה אך הימנעו מלהפריע לכדור. השאר ~ 0.5 מ"ל של תמיסת הכביסה בצינור.
2. באמצעות קצוות פיפטה מקוצרים (מוכן בשלב 1.9), לקחת 500 μL של PBS קר כקרח ולהוסיף אותו לצינור.
   1. באמצעות אותו קצה, בעדינות לתלות את הכדור ולשלוף את כל הרקמות. הימנע pipetting סוער כדי להפחית את אובדן הרקמה על ידי דבקותו בצינורות וקירות קצה פיפטה.
3. הוסף את הרקמה המחודשת לצינור הצנטריפוגה המקביל שלה המסומן מראש ומשקלו מראש 1.5 מ"ל והנח את הצינור על קרח. חזור על הפעולה עבור כל הרקמות בערכת הנתונים.
4. מניחים את צינורות 1.5 מ"ל לתוך צנטריפוגה מקוררת מראש ופולטים את הרקמות ב 7,000 x גרם במשך 5-7 דקות ו 4 מעלות צלזיוס.
   1. שלוף צינורות ושאף בזהירות כמה שיותר מה- PBS מבלי להפריע לכדור. החזירו את הצינור לקרח.
5. צינורות צנטריפוגה למשך 3 דקות נוספות ב 7,000 x גרם כדי להבטיח שהרקמות יהיו גלולות היטב. מעבירים את הצינורות לקרח.
   הערה: שלב הצנטריפוגה הנוסף חשוב למניעת אובדן רקמות בעת הסרת כל תמיסת הכביסה והפתילות. אם אתם מעבדים יותר מחמש דגימות, חזרו על שלב הצנטריפוגה של 3 דקות, 7,000 x גרם לאחר שכל דגימה חמישית מעובדת כדי להבטיח שהרקמות יישארו כדוריות.
6. בעזרת הפתילות שהוכנו בשלב 1.8, יש להסיר בעדינות את תמיסת הכביסה שנותרה. השתמשו בפתיל נקי לכל דגימה. מקובל לטפוח בעדינות את הרקמה עם הפתילה, מה שיעזור להסיר את רוב תמיסת הכביסה אך ימנע מאובדן רקמות כלשהן על ידי היצמדות לפתילה. סגור את הצינור והנח אותו על קרח.
7. שקלו כל שפופרת במאזן האנליטי המכויל, המאופס והאפסי שצויר לאחרונה.
   1. מניחים כל צינור בבקבוק הזכוכית של ארלנמאייר וסוגרים את דלת התא. כאשר המשקל התייצב, רשום אותו בעמודת הגיליון האלקטרוני שכותרתה צינור w/tissue.
   2. לאחר השקילה, החזירו את הצינור לקרח.
8. הוסיפו 300 מיקרון של PBS קר כקרח. באמצעות קצה פיפטה מקוצר (שלב 1.9), יש לאחזר בזהירות את כל הרקמות ולהפקיד בצינור זכוכית עם תווית בורגית מראש (מוכן בשלב 1.5) המכיל 2 מ"ל של מתנול קר כקרח בדרגה LC-MS (הוסף את הרקמה למתנול, לא לצד הצינור).
9. חשב את כמות הרקמה שנשטפה על ידי חיסור הצינור לבדו מהצינור עם ערך הרקמה. רשום מספר זה בעמודת הרקמות הכוללת. ערך הרקמה הכולל ישמש לנרמול נתוני ספקטרומטריית מסות בשלב 6.12.
10. אחסן את הדוגמאות בטמפרטורה של -80°C עד שתהיה מוכנה לביצוע שלבים 4.1-4.15.
    הערה: זוהי נקודת עצירה טובה, וניתן לאחסן את הדגימות בבטחה במשך כמה שבועות ב -80 מעלות צלזיוס. לשיטות אחרות לנורמליזציה של רקמות, כגון ריכוז חלבונים או תכולת פוספט שומנים, עיין ב- Rohrbach et ^al.11.

4. מיצוי שומנים

הערה: חשוב להתחיל בשלבים אלה בבוקר, במיוחד כאשר דגימות רבות יעובדו. לפני שמתחילים, מחממים מראש אמבט מים או אינקובטור ל 48 מעלות צלזיוס.

1. אחזר את הדגימות שהוכנו בשלב 3.8 ואת תקני השומנים של MS (שהוכנו בשלב 1.11) מהמקפיא. אפשרו להם להתאזן לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
2. מערבלים וטובלים את התמיסה הסטנדרטית הפנימית באמבט מים על-קולי (ראו טבלת חומרים) למשך 2-3 דקות או עד שתקני השומנים של MS מומסים במלואם לפני החלוקה לדגימות. פעולה זו תמנע שגיאות בנורמליזציה של נתונים.
3. באמצעות פיפטה חוזרת, יש להוסיף 250 pmol (10 μL מתמיסת 25 nmol/mL שהוכנה בשלב 1.11) של תקני ספקטרומטריית מסה פנימית לכל צינור. כסו מחדש את הצינורות קלות.
4. כדי להקל על הומוגניזציה, התאם את נפח המתנול ל -2 מ"ל. יש להשתמש רק במתנול בדרגה LC-MS/MS.
5. עובדים על צינור אחד בכל פעם, להשתמש homogenizer כדי triturate את הרקמה עד לא נראים גושים (בדרך כלל 5-20 שניות). הזיזו את קצה ההומוגנייזר בתנועה מעגלית ולחצו בעדינות על דופן הצינור כדי לסייע לטריטורציה. כסו מחדש את הצינור.
   הערה: הקפדה על כך שכל הרקמות עוברות טריטורציה עדינה תמקסם את מיצוי השומנים. אין להוסיף כלורופורם לדגימות לפני ההומוגניזציה, שכן קצוות ההומוגנייזר החד פעמיים עשויים מפלסטיק שיתמוסס בתמיסות המכילות כלורופורם.
6. לטבול את הצינור בזווית של 45 מעלות באמבט מים קולי למשך 5-10 שניות.
   1. אם לא נוצרים גושי רקמה עם טבילה באמבטיה הקולית, מכסים אותה ועוברים לצינור הבא.
   2. אם גושי רקמות נוצרים כאשר הצינור שקוע באמבטיה קולית, הומוגניות מחדש, ולמקד את הגושים.
   3. חזור על תהליך זה (הומוגניזציה/טבילה באמבטיה אולטראסונית) באופן איטרטיבי עד לפירוק כל גושי הרקמות הגדולות.
7. במכסה אדים, יש להוסיף כלורופורם ומתנול בדרגה LC-MS לכל צינור (השתמשו במתקן עליון לבקבוק) כדי להשיג יחס של 2:1:0.1 מתנול:כלורופורם:מים. בעזרת מכסים נקיים, אוטמים את הצינורות היטב ומשאירים על הספסל עד סוף היום.
   1. עבור רקמות במשקל 50 מ"ג או פחות, השתמש בנפח מיצוי כולל של 4 מ"ל, והתאם באמצעות יחס זה (תמיסת מיצוי של 50 מ"ג:4 מ"ל) לדגימות גדולות יותר.
8. לפני היציאה באותו ערב, הניחו את הצינורות הסגורים היטב באמבט מים או אינקובטור בטמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס ודגרו אותם למשך הלילה.
   הערה: חשוב מאוד שהצינורות יהיו סגורים היטב כך שיחסי הממס לא ישתנו עקב אידוי.
9. למחרת בבוקר, אחזו את הדגימות מאמבט המים בטמפרטורה של 48 מעלות צלזיוס וגלגלו כל פסולת בלתי מסיסה בממס על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 4,000-5,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
10. הוא עובד בתוך מכסה אדים, ומכניס בזהירות את הסופר-נאטנט לתוך מבחנות הזכוכית הבורוסיליקטיות בגודל 13 x 100 מ"מ המסומנות מראש. הטה את הצינור בגודל 13 x 100 מ"מ בזווית של 30-45° כדי להקל על ההדחה.
    הערה: אם מעבדים יותר מ-12 דגימות, אין לאפשר לצינורות הצנטריפוגה לשבת לפרקי זמן ממושכים, שכן הכדורים יתרככו ופסולת בלתי מסיסה תועבר בעת ביצוע שלב 4.10. כדי להימנע מכך, הוציאו רק 12 צינורות מהצנטריפוגה בכל פעם והמשיכו בצנטריפוגה של הצינורות האחרים עד שתהיו מוכנים לנטרל אותם.
11. העבירו את הצינורות לרכז ואקום המסוגל להכיל צינורות בגודל 13 x 100 מ"מ. מאדים את כל הממס עם שלב חימום ראשוני של שעה אחת (40 מעלות צלזיוס) ופועלים תחת הוואקום המרבי.
12. הסר שפופרות מרכז הוואקום והוסף 500 μL של מתנול בדרגה LC-MS (השתמש במתקן עליון לבקבוק) לכל שפופרת.
13. יש להשעות את תמציות השומנים המיובשות על ידי מערבולת במשך 5-10 שניות, ולאחר מכן לטבול צינורות בזווית של 45° באמבט מים על-קולי למשך 2 דקות תוך כדי סיבוב הצינור. מערבל מחדש במשך 5 שניות וטבול באמבט מים קולי למשך דקה נוספת.
    הערה: זהו צעד קריטי כדי להבטיח התאוששות מקסימלית של שומנים שחולצו. אין להתקדם עד שכל החומר המיובש שעל דופן הצינור עבר החייאה.
14. הניחו את הצינורות בגודל 13 x 100 מ"מ בצנטריפוגה מקוררת מראש (4 מעלות צלזיוס) והסירו כל פסולת בלתי מסיסה על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 4,000-5,000 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות.
15. הבהירו בזהירות את הסופרנאטנט המובהר לתוך בקבוקון autoinjector מסומן מראש. הטיית בקבוקון ה-autoinjector בזווית של 30-45° תקל על ההדחה. ודא כי כל התוכן של צינור 13 x 100 מ"מ הם decanted לתוך בקבוקון autoloader.
16. יש לסגור את הצינורות בחוזקה ולאחסן את הצינורות בטמפרטורה של -80°C עד לניתוח על ידי LC-ESI-MS/MS.

5. ניתוח LC-ESI-MS/MS

הערה: ההליך הבא משתמש במערכת משאבות בינארית המוצמדת למערכת autoinjector, degaser ו- LC-MS/MS הפועלת במצב משולש-מרובע. טמפרטורת העמודה נשמרה באמצעות תנור עמודים. ראה טבלת חומרים לקבלת פרטים על הציוד שבו נעשה שימוש.

1. הכן את השלב הנייד A1 (CH 3OH:_{H 2}O:HCOOH, 58:41:1, v:v:v, עם פורמט אמוניום של 5 mM) ואת השלב הנייד B1 (CH₃OH:HCOOH, 99:1, v:v, עם פורמט אמוניום של 5 mM). יש להשתמש רק בממסים, מים וריאגנטים בדרגה LC-MS.
2. עבור כל קבוצה של דוגמאות, הכינו ארבעה בקבוקוני מטען אוטומטי ריקים המכילים 500 μL של מתנול בדרגה LC-MS.
3. עבור כל קבוצת דוגמאות, הכינו שני בקבוקוני מטען אוטומטי של תקן פנימי (תווית כ-IS) על ידי דילול 10 μL (250 pmol סה"כ כל תקן) של התמיסה הסטנדרטית הפנימית שהוכנה בשלב 1.11 ב-500 μL של מתנול בדרגה LC-MS.
4. הגדר את טמפרטורת תנור העמודים ל- 60°C, ואת טמפרטורת מקור היונים ל- 500 °C.
5. לצורך ניתוח MS/MS, השתמש במצב המשולש-מרובע של הספקטרומטר. הגדר את המרובע הראשון (Q1) כדי להעביר יונים מקדימים, תוך הגדרת המרובע השלישי (Q3) כך שיעבור יוני מכפלה ייחודיים מבחינה מולקולרית (או סריקה על פני מספר m/z ב-Q1 או Q3) תוך שימוש ב-N2 כדי לגרום לדיסוציאציות התנגשות ב-quadrupole 2 (Q2), אשר מוסט מ-Q1 ב-30-120 eV.
6. הגדר את חלון הזיהוי של זוגות ניטור תגובות מרובות (MRM) ל-120 שניות עם זמן סריקת יעד של 1.0 שניות. עיין בטבלה 1 לקבלת רשימה של זוגות MRM, אנרגיות יינון ואנרגיות התנגשות.
7. השתמש בפרמטרים הבאים כדי לפתור sphingolipids בשלב LC: באמצעות קצב זרימה של 0.7 מ"ל/דקה, שיווי משקל 2.1 (i.d) x 50 מ"מ C18 עמוד פאזה הפוכה למשך 0.5 דקות עם תערובת ממס של 95% שלב נייד A1 ו 5% שלב נייד B1.
   1. לאחר הזרקת הדגימה, שמרו על יחס פאזה ניידת A1/B1 ב-95/5 למשך 2.25 דקות, ולאחר מכן על שיפוע ליניארי ל-100% B1 במשך 1.5 דקות, ולאחר מכן מוחזק ב-100% B1 למשך 5.5 דקות, ולאחר מכן חזרה הדרגתית של 0.5 דקות ל-95/5 A1/B1.
   2. לאחר הריצה, שיווי משקל מחדש של העמודה עם תערובת של 95/5 A1/B1 למשך 0.5 דקות.
8. השתמש בהגדרות הבאות עבור המטען האוטומטי לדוגמה: נפח שטיפה, 500 μL; שבץ מחט, 52 מ"מ (זה צריך להיות מותאם בהתאם לגודל בקבוקון ונפח בכל בקבוקון); מהירות שטיפה, 35 μL / s; מהירות דגימה, 5.0 μL/s; זמן טבילה שטיפה, 2 שניות; מצב שטיפה, לפני ואחרי השאיפה; זמן שטיפה,2 שניות.
9. הנח דוגמאות שהוכנו בשלב 4.15 על מגש טעינה אוטומטית בסדר הבא: ריק; הוא; ריק; דוגמאות שהוכנו בשלב 4.15; ריק, הוא, ריק.
10. נתח 5-10 μL מכל דגימה על-ידי LC-ESI-MS/MS. נתח את אותו אמצעי אחסון עבור כל הדגימות בערכת הנתונים.

6. עיבוד נתונים, אינטגרציה ונורמליזציה

הערה: למרות שהשלבים הבאים מתארים הליך עבור תוכנה ספציפית (ראה טבלת חומרים), ניתן להשתמש בהליכים דומים במכשירים ובתוכנות מקבילים של LC-MS כדי לשלב זוגות MRM עבור מחלקות השומנים שנותחו והתקנים הפנימיים המתאימים.

1. פתח את תוכנת הכמות. בכרטיסייה כמותית לחץ פעמיים על אשף הכמות. בחלון המוקפץ, בסביבת העבודה השמאלית ביותר, נווט אל ערכת הנתונים הנכונה ולחץ עליה שמאלה. הדוגמאות הזמינות יוצגו בסביבת העבודה האמצעית.
2. סמן את הדוגמאות לניתוח ולאחר מכן לחץ על החץ הימני כדי להוסיף דוגמאות לסביבת העבודה ' דוגמאות נבחרות' . לחץ על הבא כדי לנווט אל מסך ההגדרות והשאילתה שבו נעשה שימוש בדרך כלל בהגדרות ברירת המחדל.
3. מכה הבא כדי לנווט למסך בחירת שיטת האינטגרציה. בחר שיטת אינטגרציה מתאימה המכילה זוגות מעבר MRM לניתוח שומנים. עיין בטבלה 1 עבור זוגות מעבר MRM. הכה סיום.
   הערה: זמני השמירה משתנים בהתאם למכשור ולהגדרות הנפרדות, ולכן יש לאמת אותם עבור כל הגדרה בנפרד.
4. בסרגל הניווט, לחץ על החלונית סקירת שיא כדי שניתן יהיה לבדוק זוגות MRM. כדי להקל על הסקירה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על החלונית סקירת שיא, שנה את ההגדלה האוטומטית ל- 100% מהשיא הגדול ביותר וחלון שינוי גודל תצוגה של 1.00 - 2.00 דקות.
5. לחץ לחיצה ימנית על חלון תצוגת הכמות ובחר Analyte ואת sphingolipid הרצוי להיבדק. ודא שאין שיאים בדגימות הריקות ושהשיא הנכון שולב בדגימות IS.
6. התחל לשלב דוגמאות לא ידועות. עבודה בכיתה ספינגוליפית אחת בכל פעם, בדוק את זמן השמירה עבור זוג MRM של התקן הפנימי (כלומר, C12:0 ceramide) ולוודא שהתוכנה שילבה את השיא הנכון.
7. המשך אל האנליטים באותה מחלקת שומנים (כלומר, C14:0 סרמיד, C16:0-סרמיד וכו'), החל מהשומנים באורך השרשרת הקצר ביותר בכיתה. ודא עבור כל ליפידים באורך שרשרת ששגרת התוכנה שילבה את שיא זוג ה-MRM הנכון.
8. כאשר כל האנליטים שולבו, צור גיליון אלקטרוני עבור כל מין sphingolipid שנותח (למשל, סרמידים, sphingomyelins, וכו '). כותרות עמודות תוויות התואמות לסדר האנליטים ואורכי השרשרת בתוכנת הכמות LC-MS/MS. כלול גם כותרת עמודה עבור מזהה לדוגמה ומשקלי נורמליזציה לדוגמה שנקבעו בשלב 3.9.
   הערה: כפי שתואר קודם^{לכן 11}, אמצעי נורמליזציה נפוצים אחרים כוללים תכולת פוספט שומנים כוללת או כמות חלבון.
9. ייצא או העתק את אזורי השיא עבור כל האנליטים והתקנים הפנימיים לגיליון האלקטרוני האלקטרוני.
10. נרמל את הנתונים על-ידי חלוקת שטח השיא המשולב של כל מין באורך שרשרת עבור מחלקה Sphingolipid נתונה באזור השיא של התקן הפנימי המקביל לו. לדוגמה, C14:0 סרמיד, C16:0 סרמיד, סרמיד C18:1 וכו', יש לחלק כל אחד מהם ב-C12:0 אזור שיא סטנדרטי פנימי של סרמיד.
11. המרת שטח השיא לשומות של שומנים שהתאוששו על ידי הכפלת שטח השיא המנורמל (מחושב בשלב 6.10) עם כמות התקן הפנימי, בפיקומולים, שנוספה לדגימה בשלב 4.3. בפרוטוקול זה, כמות זו היא 250 pmol.
12. כדי לקבל את כמות השומנים היחסית בכל דגימה, חלקו את הפיקומולים של כל אורך שרשרת שומנים במשקל הרקמה שנקבע בשלב 3.9. זה ייתן יחידות של picomoles של שומנים לכל מ"ג של רקמה.

תוצאות

בפרוטוקול זה אנו מתארים בפירוט שיטה להסרת OCT מרקמות אנושיות שהשתמרו בקריו ושוקלים את הרקמות לניתוח על ידי LC-ESI-MS/MS. החומרים הנדרשים להליך זה מפורטים בטבלת החומרים. מוצגות באיור 1 תוצאות של ניסוי טיפוסי שבו 10 גידולי אדנוקרצינומה של ריאות אנושיות ו-10 רקמות סמוכות נורמליות נשטפו כדי להסיר OCT ונותחו על-ידי LC-ESI-MS/MS. חשוב לציין שכפי שהראינו בעבר¹¹, ישנם מינים שונים של סרמידים באורך שרשרת (איור 1A) ומונוהקסוזיל-סרמידים (איור...

דיון

OCT הוא חומר שימור קריו נפוץ לטווח ארוך המשמש בביו-ריפוזיטורים. עם זאת, OCT יכול לגרום לדיכוי יונים כאשר רקמות מנותחות על ידי פלטפורמות ספקטרומטריית מסה^{שונות 12,13,14,15,} או לגרום לאובדן אות כאשר דגימות מנותחות על ידי LC-ESI-MS/^{MS 11}. OCT ברקמות בהקפאה יכול גם להפריע לשיטות נורמליזציה של רקמות כגון שקילה ומבחני כימות חלבונים כגון ברדפורד ו- BCA¹¹....

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
1 מ"ל קצות פיפטה מפוליפרופילן	NA		NA משמש לאחזור דגימות
1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה מפוליפרופילן	NA
NA 10 מ"ל בקבוק Erlenmeyer	VWR	89091-116	משמש לשקילת צינורות ורקמות
AB Sciex Analyst 1.6.2	Sciex	NA	Software לניתוח ושילוב נתוני MS
פורמט אמוניום	פישר מדעי	A11550	לשלבים ניידים LC
סולם אנליטי	NA		NA סולם מדויק עד 0.1 מ"ג
מתקן בקבוק	עליון Sartorius	LH-723071	משמש לחלוקת ממיסים
C12-סרמיד (d18:1/C12:0); N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine	Avanti Polar Lipids	LM2212	תקן פנימי
C12-glucosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-β-glucosyl-sphing-4-eine	Avanti Polar Lipids	LM2511	תקן פנימי
C12-lactosylceramide (d18:1/12:0); N-(dodecanoyl)-1-ß-lactosyl-sphing-4-ene	Avanti Polar Lipids	LM2512	תקן פנימי
C12-Sphingomyelin  (d18:1/C12:0), N-(dodecanoyl)-sphing-4-enine-1-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	LM2312	תקן פנימי
CHLOROFORM OMNISOLV 4L	VWR	EM-CX1054-1
ClickSeal Biocontainment	Lids Thermo Scientific	75007309	למניעת aeresולים מסוכנים ביולוגית במהלך צנטריפוגה
Conflikt	Decon Labs	4101	Decontaminant
תנור עמודה CTO-20A/20AC	Shimadzu	NA	עבור LC
d17:1-ספינגוזין;   (2S,3R,4E)-2-aminoheptadec-4-ene-1,3-diol	Avanti Polar Lipids	LM2000	תקן פנימי
d17:1-Sphingosine-1-phosphate; heptadecasphing-4-enine-1-phosphate	Avanti Polar Lipids	LM2144	תקן פנימי
DGU20A5R מסיר גז	Shimadzu	NA
צינורות תרבות חד פעמיים 13x100 מ"מ	VWR	53283-800	13x100 מ"מ צינורות
אמבט מים מחומם	NA		NA למיצוי שומנים לילה
הומוגנייזר 150	פישר סיינטיפיק	15-340-167	רקמות טריטוראט
הומוגנייזר גנרטור חד פעמי מפלסטיק בדיקה	פישר סיינטיפיק	15-340-177	להומוגניזציה
Kimwipes	Kimtech	34120	רקמה בדרגת מעבדה המשמשת לייצור פתילות
מתנול LC-MS כיתה 4L	VWR	EM-MX0486-1
Nexera LC-30 AD מערכת משאבה בינארית	Shimadzu	NA	עבור LC-MS
סמן קבוע	VWR	52877-310
סגירת חוט בורג פנולי, קימבל צ'ייס (כובעים לצינורות תרבית חד פעמיים)	VWR	89001-502	13x100 מ"מ מכסי צינור עליון בורג
פוספט מלוח	Thermo Scientific	10010023	לאחזור דגימות מצינורות לאחר שטיפת
פיפטה משחזר	Eppendorf	4987000118	לחלוקת תקנים פנימיים LC-MS
מכסי בורג, כחול, אדום PTFE/סיליקון לבן	VWR	89239-020	מכסי בקבוקון מזרק אוטומטי
בקבוקוני זכוכית הברגה עם תיקון זיהוי	VWR	46610-724	בקבוקוני מזרק
אוטומטי SIL-30AC מזרק אוטומטי	Shimadzu	NA
SpeedVac	Thermo Scientific	SPD2030P1220	לייבוש ממיסים
Supelco 2.1 (i.d.) x 50 מ"מ Ascentis Express C18 עמודה	Sigma Aldrich	581300-U	עבור LC-MS
Triple Quad 5500+ LC-MS/MS מערכת	Sciex	NA	עבור LC-ESI-MS/
MS אמבט מים אולטרסאונד	ברנסון	דגם 2800	להומוגניזציה והשעיה מחדש של שומנים שחולצו ומיובשים
Vortexer	NA	NA	עבור sOCTrP והשעיית שומנים מיובשים
צינורות תרבות VWR חד פעמיים זכוכית בורוסיליקט VWR			47729572 13x100 צינורות תרבית זכוכית
Water Hipersolve Chromanorm LC-MS	VWR	BDH83645.400