מאמר שיטה

מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)

DOI:

10.3791/62578

⸱

3 במאי 2021

 , 
1Biozentrum, University of Basel

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ננו-בודים הם כלים חשובים בביולוגיה מבנית ומהווים פוטנציאל גדול להתפתחות של מטיפולים. עם זאת, הבחירה של nanobodies עם תכונות מעכבות יכול להיות מאתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM) לסיווג של ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרי ממברנות אלקטרוגניות.

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

נוגדנים חד-תחומיים (ננו-בודים) שימשו בהרחבה במחקרים מכניים ומבניים של חלבונים והם מהווים פוטנציאל עצום ככלים לפיתוח טיפולים קליניים, שרבים מהם תלויים בעיכוב חלבונים ממברנים כגון מובילים. עם זאת, רוב השיטות המשמשות לקביעת עיכוב פעילות התחבורה קשה לבצע בשגרות תפוקה גבוהה ותלויים בזמינות מצעים מסומנים ובכך לסבך את ההקרנה של ספריות ננו-גוף גדולות. אלקטרופיזיולוגיה של ממברנה מוצקה (SSM) היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה, המשמשת לאפיון מובילים אלקטרוגניים ולמדידת קינטיקה ועיכוב ההובלה שלהם. כאן אנו מראים את היישום של אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לבחור ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגר משני אלקטרוגני ולחשב קבועים מעכבי ננו-בונים. טכניקה זו עשויה להיות שימושית במיוחד לבחירת ננו-בומניות מעכבות המתמקדות במשגרים שעבורם מצעים מסומנים אינם זמינים.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הנוגדנים מורכבים משתי שרשראות כבדות זהות ושתי שרשראות אור האחראיות על כריכת האנטיגן. לקמלים יש נוגדנים בעלי שרשרת כבדה בלבד שמפגינים זיקה דומה לאנטיגן הקוגנייט שלהם בהשוואה לנוגדנים קונבנציונליים1,2. התחום המשתנה היחיד (VHH) של נוגדנים כבדי שרשרת בלבד שומר על הפוטנציאל המלא של איגוד האנטיגן והוכח כיציב מאוד1,2. מולקולות VHH מבודדות אלה או "ננו-בודים" יושמו במחקרים הקשורים לביוכימיה של חלבוני ממברנה ככלים לייצוב קונפורמציות3,4, כמעכבים5,6, כסוכני ייצוב7, וכקאדג'טים לקביעת מבנה8,9,10 . Nanobodies יכול להיווצר על ידי חיסון של camelids עבור טרום העשרה של תאי B המקודדים ננו-בודים ספציפיים למטרה ובידוד לאחר מכן של תאי B, ואחריו שיבוט של ספריית nanobody ובחירה על ידי תצוגת פאג'11,12,13. דרך חלופית ליצירת ננו-ביגודים מבוססת על שיטות בחירה במבחנה הנשענות על בניית ספריות ובחירה על ידי תצוגת פאג ', תצוגת ריבוזום או תצוגת שמרים14,15,16,17,18,19,20. שיטות הפריה חוץ גופית אלה דורשות גדלי ספרייה גדולים אך נהנות מהימנעות מחיסון בעלי חיים ומעדיפים את בחירת הננו-ביגודים המתמקדים בחלבונים ביציבות נמוכה יחסית.

הגודל הקטן של nanobodies, היציבות הגבוהה שלהם מסיסות, זיקה אנטיגן חזקה, אימונוגניות נמוכה, וייצור קל יחסית, להפוך אותם מועמדים חזקים לפיתוח של טיפולי21,22,23. בפרט, nanobodies המעכב את הפעילות של חלבונים ממברנה מרובים הם נכסים פוטנציאליים עבור יישומים קליניים5,24,25,26. במקרה של מובילי ממברנה, כדי להעריך אם לננו-גוף יש פעילות מעכבת, יש צורך לפתח בבדיקה המאפשרת זיהוי של מצעים מועברים ו/או מצעים משותפים. בדיקות כאלה כרוכות בדרך כלל במולקולות מסומנות או בעיצוב שיטות זיהוי ספציפיות למצע, אשר עשויות להיות חסרות יישום אוניברסלי. יתר על כן, זיהוי של nanobodies מעכב בדרך כלל דורש הקרנה של מספר גדול של קלסרים. לכן, שיטה שניתן להשתמש בה במצב תפוקה גבוהה ואינה מסתמכת על מצעים מסומנים חיונית לבחירה זו.

אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM היא טכניקה רגישה ביותר, פתורה מאוד זמן המאפשר זיהוי של תנועה של מטענים על פני ממברנות (למשל, יונים מחייב / הובלה)27,28. טכניקה זו יושמה כדי לאפיין מובילים אלקטרוגניים, אשר קשה ללמוד באמצעות טכניקות אלקטרופיזיולוגיות אחרות בשל המחזור הנמוך יחסית של חלבונים אלה29,30,31,32,33,34,35. אלקטרופיזיולוגיה SSM אינה דורשת שימוש במצעים מסומנים, היא מתאימה להקרנה בתפוקה גבוהה, וניתן להשתמש בפרוטואוליפוזומים או בשלל ממברנה המכיל את המשגר של עניין. כאן, אנו מדגימים כי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM יכולה לשמש כדי לסווג ננו-בודיות ממוקדות טרנספורטר עם תכונות מעכבות ולא מעכבות. כהוכחה לעקרון, אנו מתארים את השיקום של טרנספורטר כולין חיידקי לליפוזומים, ואחריו צעדים מפורטים לשתקת פרוטאוליפוזומים בחיישני SSM. לאחר מכן אנו מתארים כיצד לבצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות מבוססות SSM של הובלת כולין וכיצד לקבוע את הריכוז האפקטיבי למחצה (EC50). לאחר מכן אנו מראים כיצד להשתמש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לסנן ננו-בודיות מרובות ולזהות מעכבים של הובלת כולין. לבסוף, אנו מתארים כיצד לקבוע את ריכוזי המעכבים המקסימליים למחצה (IC50) של ננו-בודיות מעכבות נבחרות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. שחזור חלבון ממברנה

  1. מערבבים 3 מ"ל של שומנים קוטביים E. coli עם 1 מ"ל של פוספטידילכולין בבקבוקון תחתון עגול מתחת למכסה המנוע מאוורר.
  2. יבש את תערובת השומנים במשך 20 דקות תחת ואקום באמצעות מאייד סיבובי ואמבט מים ב 37 °C (50 °F) כדי להסיר כלורופורם. במידת הצורך, יבש עוד יותר תחת חנקן או גז ארגון.
  3. באמצעות חוצץ TS (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) המכיל 2 מ"מ β-mercaptoethanol, שומנים resuspend ל 25 מ"ג / מ"ל.
  4. עליקוט שומנים ב 500 aliquots μL, להקפיא פלאש חנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
  5. להפשיר אחד 500 μL aliquot של שומנים לדלל 1:1 באמצעות חיץ TS המכיל 2 mM β-mercaptoethanol.
  6. לפרט את השעיית השומנים 15 פעמים באמצעות קרום 400 ננומטר.
  7. לדלל את השעיית השומנים יש ריכוז שומנים סופי של 4.4 מ"ג / מ"ל.
  8. הוסף n-דודסיל-β-D-maltoside (DDM) כדי לקבל ריכוז סופי של 0.2% ולהשאיר אותו מסתובב במשך 1 שעה ב 200 סל"ד בטמפרטורת החדר (RT).
  9. מוסיפים את החלבון המטוהר לשומנים באמצעות יחס שומנים לחלבון בין 1:10 ל-1:100 (w:w).
    הערה: יש להתאים את היחס בהתאם לעוצמת האות שזוהה במדידות SSM-אלקטרופיזיולוגיה של הובלת מצע (ראה להלן). כדי להשיג אותות גדולים יותר, השתמש ביחסי שומנים לחלבון קטנים יותר.
  10. לדגור את התערובת מסתובב ב 200 סל"ד עבור 1 שעה ב RT.
  11. יש להוסיף 30 מ"ג/מ"ל של חרוזי ספיח פוליסטירן, שנשטפו מראש במאגר TS.
    הערה: הוסף חרוזי פוליסטירן צעד אחד.
  12. לדגור את תערובת החרוזים-שומנים במשך 30 דקות ב RT תחת ערבוב איטי.
  13. כדי להסיר את החרוזים, תן תערובת חרוזים-שומנים לעמוד, כך החרוזים להתיישב. מעבירים את הפתרון לצינור חדש ומשאירים את החרוזים מאחור. הוסיפו 30 מ"ג/מ"ל של חרוזי פולסטירן טריים לתערובת השומנים המופרדת.
  14. לדגור את התערובת במשך 1 שעות ב 4 °C תחת ערבוב איטי.
  15. להפריד את החרוזים מן התערובת כמתואר בשלב 1.13 ולהוסיף 30 מ"ג / מ"ל של חרוזים ספיח פוליסטירן טרי.
  16. לדגור על התערובת במשך 16 שעות ב 4 °C (70 °F).
  17. להפריד את החרוזים מן התערובת כמתואר בשלב 13 ולהוסיף 30 מ"ג / מ"ל של חרוזים ספיח פוליסטירן טרי.
  18. לדגור את התערובת במשך 2 שעות ב 4 °C (4 °F) עבור שטיפה רביעית ואחרונה.
  19. צנטריפוגה ב 110,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F).
  20. לשטוף את הכדור עם 500 μL של חוצץ TS המכיל 2 mM β-mercaptoethanol.
  21. צנטריפוגה שוב ב 110,000 x g במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F).
  22. resuspend הכדור לריכוז שומנים סופי של 25 מ"ג / מ"ל במאגר TS עם 2 mM β-mercaptoethanol.
  23. להעריך את ריכוז החלבון באמצעות ג'ל או amido שחור assay36.
  24. Aliquot הפרוטאוליפוזומים, להקפיא פלאש חנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 °C (70 °F).

2. הכנת שבב

  1. מלא שבב חיישן יחיד עם 50-100 μL של 0.5 mM 1-octadecanethiol פתרון (resuspended איזופרופנול).
  2. לדגור את השבב עם הפתרון במשך 30 דקות ב RT.
  3. הסר את התמיסה thiol על ידי הקשה על השבב על רקמה.
  4. לשטוף את החיישן 3 פעמים עם 5 מ"ל של איזופרופנול טהור.
  5. יש לשטוף את החיישן 3 פעמים עם 5 מ"ל של מים מזוקקים כפולים.
  6. ייבשו את החיישן על ידי הקשה על נייר טישו.
  7. יש למרוח 1.5 μL של 7.5 מיקרוגרם/מיקרו-לן 1,2-דיפיטנויל-סן-גליצרי-3-פוספוצולין (שומנים מיובשים במאדה מסתובב ומותפנים מחדש ב-n-דקאן).
  8. מיד לאחר מכן, מלא את החיישן עם 50 μL של מאגר SSM שאינו מפעיל, אשר אינו מכיל את המצע. זה יוביל להיווצרות ספונטנית של שכבת SSM.
    הערה: יש למטב מראש את מאגר SSM כדי לקבוע תנאים אופטימליים בעלי רעשי רקע נמוכים. מאגר כללי המכיל 30 mM HEPES pH 7.4, 5 mM MgCl2, 140 mM NaCl, יכול לשמש כנקודת התחלה. מאגר SSM ללא המצע משמש לשטיפה לפני ואחרי המדידה (מאגר שאינו מפעיל). כדי להימנע מאי-התאמה במאגר, השתמש במאגר שאינו מפעיל כדי להכין את המאגר המכיל את המצע (הפעלת המאגר). המצע ניתן להוסיף ישירות כמו אבקה או בנפח קטן מתוך מלאי ריכוז גבוה כדי למנוע דילול.
  9. להפשיר פרוטאוליפוזומים מ שלב 1.24 ב RT.
  10. לדלל proteoliposomes בין 1:5 ו 1:100 (proteoliposomes:buffer, (v:v)) במאגר SSM שאינו מפעיל (כאן 1:20).
  11. Sonicate proteoliposomes עבור 20-30 s או 3 פעמים במשך 10 s, הצבה על קרח בין sonication, במידת הצורך. כאן נעשה שימוש בסוניטור אמבט מים ב 45 kHz.
  12. החל 5-10 μL של דגימת פרוטאוליפוזומים sonicated מדולל על פני השטח של החיישן מבלי לגעת בו.
  13. צנטריפוגות השבבים עם הפתרון ב RT במשך 30 דקות באמצעות מהירות בין 2,000 ל 3,000 x גרם.
    הערה: השתמש בצינורות 50 מ"ל עם תחתית שטוחה. הניחו בזהירות את שבבי החיישן זקופים באמצעות פינצטה. ניתן להשתמש גם בצלחות 6-באר וצנטריפוגה עם מחזיק צלחת.
  14. השתמש בשבבי החיישן באותו היום.

3. מדידת התחבורה הלולית: קביעת תנאי הרוויה

הערה: כהוכחה עקרונית, ניסויים אלה בוצעו באמצעות טרנספורטר כולין חיידקי שחודש בליפוזומים בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. התהליך שלב אחר שלב של קביעת תנאים רוויים של כולין המצע לפני מדידת עיכוב על ידי nanobodies מוצג כאן.

  1. הכן 1-2 ליטר של מאגר SSM שאינו מפעיל.
    הערה: הכן והשתמש באותו מלאי מאגר SSM עבור כל המאגרים המפעילים והלא-מופעלים בכל המדידות.
  2. קח 10 צינורות נקיים ולהעביר 10 מ"ל של מאגר SSM שאינו מפעיל לתוך כל אחד.
  3. הוסף את המצע לתוך הצינורות מ שלב 3.2 באמצעות סדרה של ריכוזים סביב הריכוז המקסימלי חצי הצפוי (כאן 15, 10, 5, 1, 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001 mM של כולין) כדי להכין את מאגרי SSM הפעלת. השתמש במלאי בריכוז גבוה כדי למנוע דילול.
  4. תדליק את מכונת ה-אס.אס.אם.
  5. הפעל את תוכנת ה- SSM ותן למחשב לאתחל באופן אוטומטי. הגדר את נתיב השמירה עבור נתונים ואשר על-ידי לחיצה על לחצן אישור. בחר את פרוטוקול הניקוי ההתחלתי הרגיל באפשרויות זרימת העבודה ולחץ על הפעל.
  6. הר את השבב מצופה proteoliposome על השקע, להזיז את הזרוע כדי לנעול את השבב, ולסגור את השבב רכוב עם הכובע.
  7. בחר את התוכנית CapCom בזרימת העבודה ותן לה לפעול כדי לקבוע את המוליכות והקיביות. ודא כי המוליכות היא מתחת 5 nS ואת הקיבול הוא בין 15 ל 35 nF לפני השימוש בו למדידה.
    הערה: ערך קיבוליות של 15-35 nF ומוליכות מתחת 5 nS מומלצים על ידי היצרן בעת שימוש בשבב 3 מ"מ.
  8. העבר את פתרונות ההפעלה לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה.
  9. העבר את המאגר שאינו מפעיל למאגר והצב אותו ליד מחזיק השבב בעמדת המאגר מימין.
  10. צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף של פתרונות אי-הפעלה (B), הפעלה (A) ופתרונות שאינם מופעלים (B) (רצף B-A-B) ולולאה המבצעת שלוש מדידות ועוברת למאגר ההפעלה הבא עבור כל 10 המאגרים שהוכנו בשלב 3.3. השתמש בקצב הזרימה המוגדר כברירת מחדל ב- 200 μL/s באמצעות זמני זרימה של 1 s - 1 - 1 s עבור רצף B-A-B. לחץ על הפעל כדי להתחיל את המידה.
    הערה: ניסוי טיפוסי מורכב מהזרימה הרציפה של פתרונות שאינם מופעלים (B), מפעילים (A) ולא מופעלים (B) (שנכתבו כ- B-A-B; ראו איור 1A). הפרוטאוליפוזומים משותקים על החיישן יישטפו עם הפתרונות. לכן, חילופי פתרון B-A מייצר שיפוע ריכוז מצע, אשר מניע את תגובת התחבורה האלקטרוגנית.
  11. שמור את הפרוטוקול ותן לזרימת העבודה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן הפעל. בצעו את אותו סוג של ניסוי אך באמצעות ליפוזומים נטולי חלבונים. זה חשוב מאוד כפי שהוא יראה את עוצמת זרמי הרקע. יש לקחת זאת בחשבון בעת ניתוח נתונים של תחבורה אלקטרוגנית הנמדדים עם פרוטאוליפוזומים(איור 1C).
  12. השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן. קרא את זרם השיא באופן ידני, או אם אתה משתמש בתוכנה, השתמש בפונקציה להערכת גובה שיא בטווח של תוספת המאגר המפעיל.
  13. התווה את זרם השיא מול ריכוז המצע כדי לקבוע את EC50 של המצע באמצעות רגרסיה לא ליניארית (איור 1B,C). קרא את הריכוז הנמוך ביותר שבו זרם השיא מגיע לערך מקסימלי, ריכוז זה מתאים לתנאים רוויים.
    הערה: חשוב לקחת בחשבון כי מספר הפרוטאוליפוזומים שנותרו משותקים משתנה משבב לשבב. וריאציה זו ניכרת שכן זרמי השיא בתנאי מדידה זהים יציגו משרעת שונה. לכן, יש צורך לנרמל את המשרעת הנוכחית של מדידות המבוצעות על כל שבב בנפרד לפני השוואת מדידות בין תכשירי שבב שונים.

4. סיווג סדרתי של ננו-בומני מעכבות ולא מעכבות

הערה: סעיף זה מראה כיצד למדוד הובלת כולין בנוכחות ננו-ביגודים שנקשרים במיוחד למשגר כולין החיידקי. זרמי שיא קטנים יותר בנוכחות ננו-בומני מצביעים על עיכוב תחבורה. ננו-בודיות לא מעכבות לא ישפיעו על הובלת המצע, כלומר, אין ירידה באות זרם השיא.

  1. הכן 1-2 ליטר של מאגר SSM שאינו מפעיל.
  2. העבר 50 מ"ל של מאגר SSM שאינו מפעיל לתוך צינור נקי. מוסיפים את כולין המצע לריכוז סופי של 5 מ"מ (תנאי רוויה). השתמש באפשרות זו למדידת בקרה חיובית.
  3. העבר 10 מ"ל של מאגר SSM שאינו מפעיל לתוך צינור נקי. מוסיפים את כולין המצע לריכוז סופי של 5 מ"מ (תנאי רוויה) ומוסיפים ננו-גוף לריכוז סופי של 500 ננומטר.
  4. חזור על שלב 4.3 עבור כל גוף ננו כדי להכין את פתרונות ההפעלה.
    הערה: אם הננו-בודיות המטוהרות יתמזגו מחדש במאגר שונה ממאגר ה- SSM, התוספת שלהם למאגרים ההפעלה והלא-הפעלה תוביל לאי-התאמה במאגר. יש להימנע מאי-התאמה במאגר מכיוון שהוא עלול להוביל לרעש גבוה. החלפת המאגר של nanobodies מטוהר עם מאגר SSM יכול לעזור למנוע בעיה זו. יתר על כן, מומלץ להשתמש בריכוזים ננו-גוף המאפשרים להגיע לתנאים רוויים. בהתחשב בכך הקבועים מחייבים של nanobodies הם בדרך כלל מתחת 100 ננומטריה, ריכוז nanobody של 500 ננומטר מומלץ לניסוי זה. עם זאת, חשוב לסנן מראש לריכוזים אופטימליים.
  5. הפעל את מכונת SSM ומדוד את הקיבול והמוליכות של השבב מצופה proteoliposome כמתואר בשלבים 3.4-3.7.
  6. העבר את פתרון ההפעלה ללא גוף ננו לתוך נביון ומניחים את המאגר בסמפלר הבדיקה. העבר את המאגר שאינו מפעיל ללא גוף ננו למאגר ולמקם אותו בסמפלר הבדיקה.
  7. העבר את פתרונות ההפעלה המכילים ננו-בונים לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה. העבר את המאגרים שאינם מפעילים המכילים ננו-בונים לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה.
  8. צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף של פתרונות (B) שאינם מופעלים(B), מפעילים (A) ולא מפעילים (B).
  9. צור לולאה המבצעת את הפעולות הבאות: שלוש מדידות של רצף B-A-B באמצעות מאגרים ללא ננו- גוף, שתי מדידות של רצף B-A-B עם מאגרים המכילים ננו- גוף, זמן עיכוב של 120 שניות לדגירה עם הננו-גוף, ואז 3 מדידות של רצף B-A-B עם מאגרים המכילים את הננו- גוף.
  10. שמור את זרימת העבודה ותן לה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן הפעל.
    הערה: זרימת עבודה זו תמדוד את התנאים ההתחלתיים של התעבורה ללא עיכוב על ידי הפעלת פרוטוקול B-A-B 3 פעמים באמצעות אי-הפעלה (B) והפעלת מאגרים (A) ללא הננו -בודי (איור 1B,C), ואחריו מדידת אפקט הננו-גוף על התחבורה על ידי הפעלת פרוטוקול B-A-B 5 פעמים עם המאגרים שאינם מופעלים ומפעילים המכילים ננו -בודי (איור 2A ). הקינטיקה המחייבת מסדר שני מכתיבה את האינטראקציה של ננו-בונים וחלבוני היעד שלהם. לכן, חשוב להשתמש בעיכוב זמן בשלב B-A על מנת לתת מספיק זמן עבור nanobodies להיקשר מובילים proteoliposomes על השבב. הזמנים האופטימליים תלויים בריכוז הננו-גוף, כלומר בריכוזים נמוכים יותר נדרשים פעמים ארוכות יותר. שתי המדידות הראשונות נדרשות כדי להתאים את המערכת לתנאים החדשים והריצה השנייה צריכה להתבצע לאחר זמן עיכוב של 120 שניות. יש להשתמש רק בשלוש המדידות הבאות לניתוח נתונים.
  11. צור פרוטוקול חדש עבור זרימת העבודה באמצעות רצף של פתרונות אי-הפעלה (B), הפעלה (A) ופתרונות שאינם מופעלים (B) (רצף B-A-B) ולולאה של 5 מדידות כדי לשטוף את הננו-גוף הכרוך בהיפוך.
    הערה: אופציונלית, לכלול שלב דגירה כדי לאפשר ניתוק של nanobodies עם קינטיקה איטית.
  12. שמור את זרימת העבודה ותן לה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן הפעל.
  13. השווה את זרם השיא האחרון של המדידות למדידה הראשונית של המצע בלבד בשלב 4.10. הננו-גוף נשטף בהצלחה והתנאים ההתחלתיים נוצרו מחדש אם זרם השיא מגיע לערך ההתחלתי, אחרת חזור על שלבים 4.12-4.13 או שנה לשבב חדש.
  14. חזור על שלבים 4.6-4.13 והשתמש בשבבים בודדים עבור כל מסך ננו-גוף ( איור 2C)או חזור עם ננו-בודיות מרובות המשתמשות באותו שבב(איור 2D).
  15. השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן. קרא את זרם השיא באופן ידני, או אם זמין, בתוכנה הנמצאת בשימוש, בחר באופן אוטומטי את הפונקציה להערכת גובה שיא בטווח התוספת של מאגר ההפעלה.
  16. לנרמל את זרם השיא בנוכחות הננו, בהתבסס על המדידה הקודמת של המצע בלבד. התווה את זרמי השיא בהיסטוגרמה והשווה את זרמי השיא של המצע רק למדידות לזרמי השיא הנמדדים בנוכחות ננו-בומניות (איור 2C, D) כדי לזהות ננו-בומני מעכבות.
    הערה: נורמליזציה של זרמי השיא שנקבעו של כל ריצה בודדת עם ננו צריך להתבצע בהתחשב בזרם השיא בהיעדר ננו מהמדידה הקודמת. כמו כן, מכיוון שמספר הפרוטאוליפוזומים שנותרו משותקים משתנה משבב לשבב, חשוב לנרמל את המשרעת הנוכחית של המדידות המבוצעות על כל שבב בנפרד לפני השוואת מדידות בין תכשירי שבב שונים.

5.מדידת IC 50 עם ננו-בודיות מעכבות

הערה: לאחר זיהוי ננו-בודיות מעכבות, ניתן לקבוע את ריכוז המעכבים המקסימליים למחצה שלהם (IC50). זה נעשה על ידי מדידת ההובלה של כולין בריכוז מתמיד, תוך ריכוזים שונים של ננו מעכב.

  1. הכן 1-2 ליטר של מאגר SSM שאינו מפעיל.
  2. העבר 50 מ"ל של מאגר SSM שאינו מפעיל לתוך צינור נקי. מוסיפים את כולין המצע לריכוז סופי של 5 מ"מ (תנאי רוויה). השתמש באפשרות זו כפתרון ההפעלה לשליטה חיובית.
  3. קח 8 צינורות נקיים ולהוסיף 5 מ"ל של פתרון שאינו מפעיל לתוך כל אחד. מוסיפים את כולין המצע לריכוז סופי של 5 מ"מ (תנאי רוויה). הוסף את nanobody מעכב לצינורות בריכוזים בטווח IC50 הצפוי (כאן 500 ננומטר - 1 ננומטר).
  4. קח 8 צינורות נקיים ולהוסיף 10 מ"ל של פתרון שאינו מפעיל לתוך כל אחד. הוסף ננו-גוף מעכב לכל צינור בנפרד באותו ריכוז כמו בשלב 5.3. פעולה זו תואמת למאגר שאינו מפעיל.
    הערה: זה ייצור סדרה של זוגות חיץ הפעלה ולא הפעלה בריכוזים שונים של אותו ננו מעכב.
  5. התחל את הגדרת SSM ומדוד את הקיבול והמוליכות של השבב מצופה proteoliposome כמתואר בשלבים 3.4-3.7.
  6. העבר את פתרון ההפעלה ללא גוף ננו לתוך נביון ומניחים אותו בסמפלר הבדיקה. מעבירים את המאגר שאינו מפעיל ללא ננו-גוף למאגר וממקם אותו בעמדת המאגר ליד מחזיק השבב מימין.
  7. העבר את פתרונות ההפעלה המכילים ננו-בונים לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה. העבר את המאגרים שאינם מפעילים המכילים ננו-בונים לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה.
  8. צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף של פתרונות (B) שאינם מופעלים(B), מפעילים (A) ולא מפעילים (B). כלול לולאה כדי למדוד כל ריכוז 2 פעמים, דגירה במשך 120 s ולמדוד 3 פעמים נוספות. זרימת העבודה תתחיל עם שליטה חיובית של מצע בלבד ואחריו הריכוז הנמוך ביותר של nanobody. כל מדידה ננו-גוף יהיה ואחריו מדידה הבאה של השליטה החיובית עם מצע בלבד כדי לשחזר את משרעת השיא הראשונית, לפני המעבר לריכוז הננו-גוף הגבוה הבא.
    הערה: הקינטיקה מסדר שני מכתיבה את כריכת הננו-ביגודים. לכן, חשוב להשתמש בעיכוב זמן בשלב B-A. הזמנים האופטימליים תלויים בריכוז הננו-גוף, כלומר בריכוזים נמוכים יותר נדרשים פעמים ארוכות יותר; כאן 120 s שימש עם תוצאות משביעות רצון.
  9. השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן. קרא את זרם השיא באופן ידני, או אם אתה משתמש בתוכנה, בחר את הפונקציה להערכת גובה השיא בטווח של הוספת מאגר ההפעלה (איור 3A). התווה את זרמי השיא נגד ריכוז הננו-גוף כדי לקבוע את IC50 באמצעות רגרסיה לא ליניארית (איור 3B).
    הערה: לנרמל את המשרעת הנוכחית של מדידות שבוצעו עבור כל שבב בודד לפני השוואת מדידות בין תכשירי שבב שונים.

6. ניקוי חיישנים

  1. יש לשטוף את שבבי החיישן הבודדים לאחר השימוש במים מזוקקים ב-10 מ"ל.
  2. ייבש את השבב על ידי הקשה עליו על נייר טישו.
  3. מלא את חלל החיישן של השבב עם 100 μL של איזופרופנול טהור ודגרה במשך 10 דקות ב RT.
  4. מניחים צמר גפן באיזופרופנול טהור ודגר במשך 1-3 דקות.
  5. השתמש בצמר גפן ספוגה מראש וסובב בעדינות על פני השטח של החיישן ללא לחץ כדי להסיר שאריות.
  6. לשטוף את החיישן עם 5 מ"ל של איזופרופנול טהור.
  7. לשטוף את החיישן עם 10 מ"ל של מים מזוקקים.
  8. ייבש את החיישן על ידי הקשה על השבב על טישו.
  9. תן לחיישן להתייבש למשך הלילה ב-RT, ולאחסן ב-RT בתנאים יבשים.
    הערה: ניתן להשתמש מחדש בחיישנים עד 4-5 פעמים בעת ניקוי ואחסנה כראוי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM שימשה בהרחבה לאפיון של מובילים אלקטרוגניים. בפרוטוקול המוצג כאן, אנו מראים כיצד להשתמש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לסווג ננו-בודיות המתמקדות במשגר משני (כאן סימפורטר כולין חיידקי) בהתבסס על תכונותיהם המעכבות והלא מעכבות. אחת התכונות השימושיות ביותר של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הקרנה בתפוקה גבוהה של תנאי חיץ מרובים. מאפיין מסוים זה מועיל לניתוח של ספריות ננו- גוף, אשר לאחר בחירת קלסרים ניתן מהווה מכמה עד עשרות ננו-בודיות. בניסוי סטנדרטי, מונולייטר שומנים יציב מורכב על שבב חיישן. לאחר החלת ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הטכניקה המוצגת כאן מסווגת ננו-ביגודיות עם תכונות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרים אלקטרוגניים. הערכת הובלת המצע אפשרית בשל זיהוי תנועת המטענים באמצעות המשגר המוטמע בקרום הפרוטאוליפוזומים. חלק מהצעדים הקריטיים במהלך ההתקנה של ניסוי הם שחזור של חלבון פעיל בליפוזומים, הכנת monolayers יציב על שבבי SSM, ושחזור של תנאים ראשוניים לאחר היישום של פרוטוקול לשטוף כדי להסיר מולקולות nanobody מאוגד. לאחר שחלבון הממברנה משוחזר ביחס מתאים בין שומנים לחלבון, ניתן לקבוע פרוטוקול SSM כללי באמצעות המצע המקומי. חשוב לבצע ניסויי בקרה באמצע...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים סדריק א.ג. הוטר ומרקוס א. סיגר מהמכון למיקרוביולוגיה רפואית באוניברסיטת ציריך, ולגונזלו קברו מ-Biozentrum מאוניברסיטת באזל על שיתוף פעולה בדור הננו-בודיות הסינתטיות (sybodies). אנו מודים למריה ברתמס ואנדרה בזון מ-NANION Technologies על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע (SNSF) (יוזמת מענק המחקר PP00P3_170607 ו-NANION ל- C.P.).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
תמיסת 1-אוקטדקנתיולסיגמא אולדריץ'O1858-25 מ"ל
1,2-דיפיטנואיל-sn-גליצרו-3-פוספוכוליןאוונטי שומנים קוטביים850356C-25 מ"ג
ביו-חרוזים סופח SM-2 (חרוזי סופח פוליסטירן)BioRad#152-3920
PD 10 עמודי התפלהGE HealthcareGE17-0851-01
מסנן קרום 200 ננומטרWhatman NucleoporeWHA800282
2-פרופנולMerck33539-1L-R
n-DecaneSigma Aldrich8034051000
n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM)Avanti Polar Lipids850520P-25g
נתרן כלורידAppliChem131659.1211
(הגדרת SSM) SURFE2R N1Nanion-----
SURFE2R N1 שבבי חיישן יחידNanion# 161001
Trizma BaseSigma AldrichT1503
E. coli תמצית שומנים קוטבייםAvanti Polar Lipids100600C
Egg PC L-α-phosphatidylcholine Avanti Polar Lipids840051C

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
  2. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  3. Perez, C., et al. Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody. Science Reports. 7, 46641(2017).
  4. Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR. Nature Communication. 11, 2216(2020).
  5. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).
  6. Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD. Science Reports. 7, 14296(2017).
  7. Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function. Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).
  8. Rasmussen, S. G., et al. Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor. Nature. 469 (2), 175-180 (2011).
  9. Jiang, X., et al. Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation. Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).
  10. Geertsma, E. R., et al. Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family. Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).
  11. Harmsen, M. M., De Haard, H. J. Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments. Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).
  12. Pardon, E., et al. A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology. Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).
  13. Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).
  14. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. Elife. 7, 34317(2018).
  15. McMahon, C., et al. Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies. Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).
  16. Olichon, A., de Marco, A. Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies. Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).
  17. Moutel, S., et al. NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies. Elife. 5, 16228(2016).
  18. Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications. Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).
  19. Sabir, J. S., et al. Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library. Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).
  20. Yau, K. Y., et al. Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library. Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).
  21. vander Linden, R. H., et al. Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies. Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).
  22. Dumoulin, M., et al. Single-domain antibody fragments with high conformational stability. Protein Science. 11, 500-515 (2002).
  23. Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment. Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).
  24. Yu, X., et al. Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications. Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).
  25. Jahnichen, S., et al. CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).
  26. Nguyen, V. S., et al. Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody. PLoS One. 10, 0122187(2015).
  27. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  28. Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. SSM-based electrophysiology. Methods. 46, 97-103 (2008).
  29. Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology. Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).
  30. Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes. Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).
  31. Zuber, D., et al. Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli. Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).
  32. Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. Electrophysiological characterization of LacY. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).
  33. Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases. PLoS One. 11, 0156392(2016).
  34. Williamson, G., et al. A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport. Elife. 9, 57183(2020).
  35. Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB. FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).
  36. Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B. Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).
  37. Kermani, A. A., et al. The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters. Nature Communication. 11, 6064(2020).
  38. Weitz, D., et al. Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1. Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

SSMIC50

מאמרים קשורים