ננו-בודים הם כלים חשובים בביולוגיה מבנית ומהווים פוטנציאל גדול להתפתחות של מטיפולים. עם זאת, הבחירה של nanobodies עם תכונות מעכבות יכול להיות מאתגר. כאן אנו מדגימים את השימוש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM) לסיווג של ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרי ממברנות אלקטרוגניות.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)
במאמר זה
סיכום
תקציר
נוגדנים חד-תחומיים (ננו-בודים) שימשו בהרחבה במחקרים מכניים ומבניים של חלבונים והם מהווים פוטנציאל עצום ככלים לפיתוח טיפולים קליניים, שרבים מהם תלויים בעיכוב חלבונים ממברנים כגון מובילים. עם זאת, רוב השיטות המשמשות לקביעת עיכוב פעילות התחבורה קשה לבצע בשגרות תפוקה גבוהה ותלויים בזמינות מצעים מסומנים ובכך לסבך את ההקרנה של ספריות ננו-גוף גדולות. אלקטרופיזיולוגיה של ממברנה מוצקה (SSM) היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה, המשמשת לאפיון מובילים אלקטרוגניים ולמדידת קינטיקה ועיכוב ההובלה שלהם. כאן אנו מראים את היישום של אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לבחור ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגר משני אלקטרוגני ולחשב קבועים מעכבי ננו-בונים. טכניקה זו עשויה להיות שימושית במיוחד לבחירת ננו-בומניות מעכבות המתמקדות במשגרים שעבורם מצעים מסומנים אינם זמינים.
מבוא
הנוגדנים מורכבים משתי שרשראות כבדות זהות ושתי שרשראות אור האחראיות על כריכת האנטיגן. לקמלים יש נוגדנים בעלי שרשרת כבדה בלבד שמפגינים זיקה דומה לאנטיגן הקוגנייט שלהם בהשוואה לנוגדנים קונבנציונליים1,2. התחום המשתנה היחיד (VHH) של נוגדנים כבדי שרשרת בלבד שומר על הפוטנציאל המלא של איגוד האנטיגן והוכח כיציב מאוד1,2. מולקולות VHH מבודדות אלה או "ננו-בודים" יושמו במחקרים הקשורים לביוכימיה של חלבוני ממברנה ככלים לייצוב קונפורמציות3,4, כמעכבים5,6
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. שחזור חלבון ממברנה
- מערבבים 3 מ"ל של שומנים קוטביים E. coli עם 1 מ"ל של פוספטידילכולין בבקבוקון תחתון עגול מתחת למכסה המנוע מאוורר.
- יבש את תערובת השומנים במשך 20 דקות תחת ואקום באמצעות מאייד סיבובי ואמבט מים ב 37 °C (50 °F) כדי להסיר כלורופורם. במידת הצורך, יבש עוד יותר תחת חנקן או גז ארגון.
- באמצעות חוצץ TS (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl) המכיל 2 מ"מ β-mercaptoethanol, שומנים resuspend ל 25 מ"ג / מ"ל.
- עליקוט שומנים ב 500 aliquots μL, להקפיא פלאש חנקן נוזלי, ולאחסן ב -80 °C (80 °F).
- להפשיר אחד 500 μL aliquot של שומנים לדלל 1:1 באמצעות חיץ TS המכיל 2 mM β-mercaptoethanol.
- לפרט את השעיית השומנים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
אלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM שימשה בהרחבה לאפיון של מובילים אלקטרוגניים. בפרוטוקול המוצג כאן, אנו מראים כיצד להשתמש באלקטרופיזיולוגיה מבוססת SSM כדי לסווג ננו-בודיות המתמקדות במשגר משני (כאן סימפורטר כולין חיידקי) בהתבסס על תכונותיהם המעכבות והלא מעכבות. אחת התכונות השימושיות ביותר של טכניקה זו היא שהיא מאפשרת הקרנה בתפוקה גבוהה של תנאי חיץ מרובים. מאפיין מסוים זה מועיל לניתוח של ספריות ננו- גוף, אשר לאחר בחירת קלסרים ניתן מהווה מכמה עד עשרות ננו-בודיות. בניסוי סטנדרטי, מונולייטר שומנים יציב מורכב על שבב חיישן. לאחר החלת .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הטכניקה המוצגת כאן מסווגת ננו-ביגודיות עם תכונות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרים אלקטרוגניים. הערכת הובלת המצע אפשרית בשל זיהוי תנועת המטענים באמצעות המשגר המוטמע בקרום הפרוטאוליפוזומים. חלק מהצעדים הקריטיים במהלך ההתקנה של ניסוי הם שחזור של חלבון פעיל בליפוזומים, הכנת monolayers יציב על שבבי SSM, ושחזור של תנאים ראשוניים לאחר היישום של פרוטוקול לשטוף כדי להסיר מולקולות nanobody מאוגד. לאחר שחלבון הממברנה משוחזר ביחס מתאים בין שומנים לחלבון, ניתן לקבוע פרוטוקול SSM כללי באמצעות המצע המקומי. חשוב לבצע ניסויי בקרה באמצע.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים מצהירים שאין אינטרסים כלכליים מתחרים.
תודות
אנו מודים סדריק א.ג. הוטר ומרקוס א. סיגר מהמכון למיקרוביולוגיה רפואית באוניברסיטת ציריך, ולגונזלו קברו מ-Biozentrum מאוניברסיטת באזל על שיתוף פעולה בדור הננו-בודיות הסינתטיות (sybodies). אנו מודים למריה ברתמס ואנדרה בזון מ-NANION Technologies על הסיוע הטכני. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית השוויצרית למדע (SNSF) (יוזמת מענק המחקר PP00P3_170607 ו-NANION ל- C.P.).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסת 1-אוקטדקנתיול | סיגמא אולדריץ' | O1858-25 מ"ל | |
| 1,2-דיפיטנואיל-sn-גליצרו-3-פוספוכולין | אוונטי שומנים קוטביים | 850356C-25 מ"ג | |
| ביו-חרוזים סופח SM-2 (חרוזי סופח פוליסטירן) | BioRad | #152-3920 | |
| PD 10 עמודי התפלה | GE Healthcare | GE17-0851-01 | |
| מסנן קרום 200 ננומטר | Whatman Nucleopore | WHA800282 | |
| 2-פרופנול | Merck | 33539-1L-R | |
| n-Decane | Sigma Aldrich | 8034051000 | |
| n-dodecyl-ß-D-maltoside (DDM) | Avanti Polar Lipids | 850520P-25g | |
| נתרן כלוריד | AppliChem | 131659.1211 | |
| (הגדרת SSM) SURFE2R N1 | Nanion | ----- | |
| SURFE2R N1 שבבי חיישן יחיד | Nanion | # 161001 | |
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503 | |
| E. coli תמצית שומנים קוטביים | Avanti Polar Lipids | 100600C | |
| Egg PC L-α-phosphatidylcholine | Avanti Polar Lipids | 840051C |
מקורות
- Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3. Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).
- Hamers-Casterman, C., et al.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
