הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

Summary

כאן, אנו מקימים פרוטוקול כדי לדמיין ולנתח בו זמנית מתחמי SMAD מרובים באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA) בתאי אנדותל החשופים לתנאי לחץ גזיר נוזלים פתולוגיים ופיזיולוגיים.

Abstract

שינוי גורם גדילה β (TGFβ)/חלבון מורפוגנטי עצם (BMP) איתות מוסדר ומאוזן היטב במהלך הפיתוח וההומאוסטזיס של מערכת כלי הדם ולכן, הסרת הפיקוח במסלול איתות זה גורמת לפתולוגיות כלי דם חמורות, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, טלנגיקטזיה דימומית תורשתית וטרשת עורקים. תאי אנדותל (ECs), כמו השכבה הפנימית ביותר של כלי הדם, חשופים כל הזמן ללחץ גיסת נוזלים (SS). דפוסים חריגים של SS נוזל הוכחו כדי לשפר את זהות TGFβ/BMP, אשר, יחד עם גירויים אחרים, לגרום טרוגנזה. ביחס לכך, atheroprone, למינאר נמוך SS נמצא כדי לשפר את זהות TGFβ / BMP בעוד SS atheroprotective, למינר גבוה, מפחית איתות זה. כדי לנתח ביעילות את ההפעלה של מסלולים אלה, עיצבנו זרימת עבודה כדי לחקור את היווצרות מתחמי גורם התמלול תחת SS למינאר נמוך ותנאי SS למינאר גבוהים באמצעות מערכת משאבה פנאומטית זמינה מסחרית ובוח קשירת קרבה (PLA).

איתות TGFβ/BMP פעיל דורש היווצרות מתחמי SMAD טרימרים המורכבים משני SMAD רגולטוריים (R-SMAD); SMAD2/3 ו- SMAD1/5/8 עבור איתות TGFβ ו- BMP, בהתאמה) עם מתווך נפוץ SMAD (SMAD משותף; SMAD4). באמצעות PLA מיקוד subunits שונים של קומפלקס SMAD טרימר, כלומר, או R-SMAD / co-SMAD או R-SMAD / R-SMAD / R-SMAD, היווצרות של מתחמי גורם שעתוק SMAD פעיל ניתן למדוד כמותית מרחבית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

השימוש בשקופיות זרימה עם 6 ערוצים מקבילים קטנים, שניתן לחבר בסדרה, מאפשר לחקור את גורם התמלול היווצרות מורכבת והכלה של פקדים נחוצים.

זרימת העבודה המוסברת כאן יכולה להיות מותאמת בקלות למחקרים המתמקדים בקרבה של SMADs לגורמי שעתוק אחרים או למתחמי גורם תמלול שאינם SMADs, בתנאי SS זורמים שונים. זרימת העבודה המוצגת כאן מציגה דרך מהירה ויעילה ללמוד את האיתות TGFβ/BMP המושרה ב- SS הנוזלי ב- ECs, הן כמותית והן מרחבית.

Introduction

חלבונים של גורמי גדילה משתנים בטא (TGFβ) superfamily הם ציטוקינים pleiotropic עם מגוון רחב של חברים, כולל TGFβs, חלבונים מורפוגנטיים עצם (BMPs), ו Activins1,2. כריכת ליגנד גורמת להיווצרות של אוליגומרים קולטנים המובילים לזרחן, ובכך, הפעלה של SMAD רגולטורי ציטוטולי (R-SMAD). בהתאם למשפחת המשנה של ליגנדים, R-SMADs שונים ^{מופעלים1,2}. בעוד TGFβs ו Activins בעיקר לגרום זרחן של SMAD2/3, BMPs לגרום SMAD1/5/8 זרחן. עם זאת, ישנן עדויות מצטברות כי BMPs ו- TGFβs/Activins מפעילים גם R-SMADs של תת-המשפחה האחרת בהתאמה, בתהליך המכונה 'איתות לרוחב'3,4,5,6,7,8 וכי ישנם מתחמי SMAD מעורבים המורכבים משניהם, SMAD1/5 ו- SMAD2/3, ^{חברים3,9} . שני R-SMADs מופעלים לאחר מכן יוצרים מתחמים טרימרים עם המתווך המשותף SMAD4. מתחמי גורמי שעתוק אלה מסוגלים לאחר מכן להעביר את ההקצאה לגרעין ולווסת את שעתוק הגנים היעד. SMADs יכול לקיים אינטראקציה עם מגוון של מפעילי שיתוף תעתיק שונים ומדכאים משותפים, מה שמוביל לגיוון האפשרויות לווסת את הגנים ^היעד10. הסרת הפיקוח על איתות SMAD יש השלכות חמורות במגוון מחלות. בהתאם לכך, איתות TGFβ/BMP לא מאוזן עלול להוביל לפתולוגיות כלי דם חמורות, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, טלנגיקטזיה דימומית תורשתית, או טרשת עורקים3,11,12,13,14.

תאי אנדותל (ECs) יוצרים את השכבה הפנימית ביותר של כלי הדם ולכן הם חשופים ללחץ גזוז (SS), כוח חיכוך המופעל על ידי הזרימה הצמיגית של הדם. מעניין, ECs המתגוררים בחלקים של vasculature, אשר חשופים לרמות גבוהות של מדים, למינאר SS, נשמרים במצב הומיאוסטטי ורגיע. לעומת זאת, ECs שחווים SS נמוך, לא אחיד, למשל, ב bifurcations או עקמומיות פחותה של קשת אב העורקים, הם שגשוג ולהפעיל מסלולים ^{דלקתיים15}. בתורו, אתרים של ECs מתפקד נוטים לפתח טרשת עורקים. באופן מעניין, מחשבים אלקטרוניים באזורים אלה של אתראופרון מציגים רמות גבוהות באופן חריג של SMAD2/3 ו- SMAD1/516,17,18. בהקשר זה, איתות TGFβ/BMP משופר נמצא כאירוע מוקדם בהתפתחות נגעים טרשת ^{עורקים19} והפרעה לאיתות BMP נמצאה כמפחיתה באופן משמעותי דלקת כלי דם, היווצרות אתראומה והסתיידות ^{נלווית20}.

קרבה קשירת Assay (PLA) היא טכניקה ביוכימית לחקר אינטראקציות חלבון חלבון במקום ^21,22. הוא מסתמך על הספציפיות של נוגדנים של מינים שונים שיכולים לקשור חלבונים ממוקדים של עניין, ומאפשר זיהוי ספציפי מאוד של אינטראקציות חלבון אנדוגני ברמה של תא אחד. כאן, נוגדנים ראשוניים צריכים להיקשר לאפיטופ היעד שלהם במרחק של פחות מ -40 ננומטר כדי לאפשר את ^{הגילוי23}. לכן, PLA מועיל מאוד על גישות אימונו-immunoprecipitation מסורתיות, שבו כמה מיליוני תאים נדרשים כדי לזהות אינטראקציות חלבון אנדוגני. ב- PLA, נוגדנים משניים ספציפיים למינים, המקושרים באופן קוולנטי לרסיסי DNA (המכונים בדיקות פלוס ומינוס), קושרים את הנוגדנים העיקריים ואם חלבוני העניין מתקשרים, בדיקות פלוס ומינוס מגיעות בסמיכות. הדנ"א נקשר בשלב הבא והגברת המעגל המתגלגל של הדנ"א המעגלי מתאפשרת. במהלך ההגברה, oligonucleotides משלימים שכותרתו פלואורסצנטרית נקשרים לדנ"א המסונתז, ומאפשרים לאינטראקציות חלבון אלה להיות חזותיות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית.

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר למדענים להשוות כמותית את מספר מתחמי שעתוק SMAD הפעילים בתנאי Atheroprotective ו atheroprone SS במבחנה באמצעות PLA. SS נוצר באמצעות מערכת משאבה פנאומטית ניתנת לתכנות המסוגלת ליצור זרימה חד-כיוונית למינארית של רמות מוגדרות ומאפשרת עלייה צעדים של קצבי הזרימה. שיטה זו מאפשרת זיהוי של אינטראקציות בין SMAD1/5 או SMAD2/3 עם SMAD4, כמו גם מתחמי R-SMAD מעורבים. ניתן להרחיב אותו בקלות כדי לנתח אינטראקציות של SMADs עם רגולטורים משותפים תמלול או כדי לתמלול גורמים מתחמים אחרים מלבד SMADs. איור 1 מציג את השלבים העיקריים של הפרוטוקול המוצג להלן.

איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול המתואר. (A) תאים הנזרעים בשקופיות של 6 ערוצים חשופים ללחץ גניסיה עם מערכת משאבה פנאומטית. (B) תאים קבועים משמשים לניסוי PLA או לתנאי בקרה. (C) תמונות של ניסויי PLA נרכשות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומנותחות באמצעות תוכנת ניתוח ImageJ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

1. תרבית התא וחשיפה ללחץ גזל

הערה: ECs וריד טבור אנושי (HUVECs) שימשו כדוגמה לחקר אינטראקציה המושרה SS של SMADs. ניתן להחיל את הפרוטוקול המתואר להלן על כל סוג תא רספונסיבי של SS.

1. מעיל שקופית 6 ערוצים עם 0.1% ג'לטין עור חזירי PBS במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F).
2. זרע HUVECs בשקופיות 6 ערוצים מצופות מראש בצפיפות של 2.5 x ¹⁰⁶ תאים למ"ל ב- 30 μL של M199 בינוני מלא.
   הערה: לקבלת מידע נוסף אודות אופן הזרימה של תאים בשקופית הזרימה, ראה ^reference24.
3. תן לתאים לדבוק במשך 1 שעות ב 37 °C בחממה לחה.
4. הוסף 60 μL של M199 בינוני מלא מחומם מראש לכל אחד מהמאגרים.
5. תרבות במשך יומיים, עם חילופי בינוני עדין פעם ביום, ב 37 °C (50 °F) בחממה לחה.
   1. שאפו את המאגרים לחלוטין, הוסיפו 120 מיקרו-אל של M199 בינוני מלא התחמם מראש באחד המאגרים, ושאפו מהצד השני.
   2. הוסף 60 μL של M199 בינוני מלא מחומם מראש לשני המאגרים.
6. הרכב והתחל את הגדרת הזרימה כמפורט ^{בהפניה25}.
   1. הר צינורות על יחידות נוזלים. כאן, צינורות סיליקון בקוטר של 0.8 מ"מ ו 1.6 מ"מ משמשים כדי להחיל מתח גיהה של 1 דיין / ^cm2 ו 30 ין / ^cm2, בהתאמה.
      הערה: החומר ואורך הצינורות צריכים להישאר קבועים, שכן שינויים יכולים להשפיע על הלחץ הגומרי הנובע מכך. באופן כללי, שילובים אחרים של מערכות משאבה צינורות ניתן להשתמש, כל עוד הלחץ הגיאה וכתוצאה מכך ידוע, ואת המשאבה יוצרת זרימת למינאר יציבה.
   2. מלאו את המאגרים בכמות מתאימה של M199 בינוני מלא (מינימום 10 מ"ל).
   3. חבר יחידות נוזליות עם הצינורות למערכת המשאבה ובצע ריצה מוקדמת ללא תאים כדי שיווי משקל המדיום ולהסיר את כל האוויר הנותר ²⁵.
   4. חבר באופן סדרתי את הערוצים הבודדים בשקופית בת 6 הערוצים זה לזה באמצעות צינורות חיבור סידוריים. הערוץ הראשון והאחרון בשקופית יתחברו לצינורות שהורכבו ב- 1.6.1 (ראה איור 1A לקבלת ערכה). היזהר לא להכניס כל אוויר לתוך המערכת כמו זה יכול לפגוע קשות בתאים. מידע נוסף על החיבור הסידורי ניתן למצוא ^{בהפניה26}.
   5. לחשיפת תאים לרמות גבוהות של לחץ גזוז (>20 דיס/ס"^מ2), יש להשתמש בשלב הרמפה, כלומר להגביר את הלחץ הגזוז בשלבי הסתגלות. ניתן להגדיר את השלבים במרווחים של 5 דקה/^cm2 ל-30 דקות.

2. קיבעון

1. נתק שקופיות מהמשאבות לאחר חשיפת ה-SS הנוזלי. השתמש מלחציים על הצינורות בעת ניתוק, כדי למנוע לשפוך בינוני באינקובטור.
2. העבר מיד שקופיות זרימה על קרח, בעוד הצינורות הנותרים מנותקים ברצף. בעת הסרת הצינורות ממאגרים, המאגר בצד השני צריך להישמר סגור עם אצבע כדי למנוע לכידת בועות אוויר בערוץ. הדבר עלול להפריע לשלבי הקיבעון.
3. שמירה על התאים על קרח, לשאוף למדיום בזהירות מן המאגרים אבל לא מן הערוץ שבו התאים שוכנים. לאחר מכן, לשטוף דגימות עם PBS סטרילי קר (4 °C) עם שלוש פעמים נפח הערוץ (90 μL). הוסיפו PBS למאגר אחד ושאפו בזהירות מהמאגר השני. חזור על שלב זה בכל אחד מ- 6 הערוצים לכל שקופית.
   הערה: עבור כל שלבי הכביסה והדגירה הפתרון המתאים מתווסף באחד המאגרים המוביל לחילופי פתרונות בערוץ. כדי לאפשר החלפה מלאה של פתרונות בערוץ, הפתרון העודף הוא שאיפה אז מן המאגר האחר. הפתרון בחלק העליון של התאים בערוץ אינו מוסר. תאים לא צריכים להתייבש בכל עת. לכן, חשוב לשטוף בזהירות ללא כל החדרת בועת אוויר לתוך השקופיות.
4. תקן את התאים על ידי הוספת 90 μL של פתרון PFA 4% במאגר שבו ה- PBS נוספה מראש ושאף באופן דומה את הנוזל מהמאגר האחר. חזור על שלב זה בכל ערוץ בכל שקופית. לאחר הוספת פתרון PFA, להעביר את הדגימות מקרח לטמפרטורת החדר (RT) ודגרה במשך 20 דקות.
   זהירות: PFA רעיל ויש לטפל בו בזהירות. השתמש בכפפות ועבוד מתחת למכסה המנוע.
5. לשטוף תאים 3x עם PBS (RT) על ידי הוספתו במאגר אחד ושאיפה בזהירות מן המאגר השני. רוקן רק את המאגרים, והבטיח לא לייבש את הערוץ. חזור על שלב זה עבור כל אחד מ- 6 הערוצים בכל שקופית.
6. להרוות את קיבעון PFA על ידי הוספת 90 μL של כלוריד אמוניום 50 מ"מ הסביבה ב- PBS באחד המאגרים. שאפו פתרון עודף מהמאגר השני. חזור על הפעולה עבור כל ערוץ בשקופית. לדגור על הדגימות במשך 10 דקות ב RT.
7. לשטוף כמתואר בשלב 2.5.
   הערה: בשלב זה, הדגימות עשויות להיות מאוחסנות ב 4 °C (4 °F) לילה, או הפרוטוקול ניתן להמשיך מיד עם חסימה ודגורת נוגדנים ראשונית (ראה שלב 3).

3. חסימה ודגרת נוגדנים ראשונית

1. כדי לחלחל לתאים, הוסף 90 μL של 0.3% טריטון-X-100 ב- PBS במאגר ריק, ושאף מהמאגר השני עבור כל ערוץ. דגירה במשך 10 דקות ב RT.
2. לשטוף כמתואר בשלב 2.5.
3. הוסף 90 μL של פתרון חסימת PLA סטרילי במאגר אחד של ערוץ ושאף מהצד השני. חזור על שלב זה עבור כל ערוץ. לחסום במשך 1 שעות ב 37 °C (50 °F) בתא לח.
   1. כדי להפוך תא לח, להשתמש צלחת 10 ס"מ עם רקמה רטובה אטומה עם סרט שעווה ומניחים את המנה באינקובטור. לחלופין, ניתן להשתמש בפורמטים אחרים של תאי לחות המספקים אווירה לחה.
      הערה: לחלופין, פתרון חסימה מתוצרת עצמית ניתן להשתמש (למשל, 3% (w/v) BSA ב- PBS, סינון סטרילי).
4. הכן נוגדנים ראשוניים (1:100) בדילול נוגדנים PLA. הכן 30 μL של הפתרון לכל ערוץ. מוסיפים את שני הנוגדנים העיקריים בו זמנית ואת המערבולת.
   הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בדלל נוגדנים מתוצרת עצמית (למשל, 1% (w/v) BSA ב- PBS). נוגדנים המשמשים כאן הם שילובים של SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 ופוספו-SMAD1/5-SMAD4. מידע מפורט ניתן למצוא בטבלת החומרים.
5. לפני היישום של נוגדנים ראשוניים, לשאוף את פתרון חסימה מן המאגרים, וגם, בזהירות מן הערוץ. Pipette 30 μL של פתרון הנוגדנים העיקרי מיד לתוך הערוץ הריק על ידי הטיית הערוץ תוך הוספת הפתרון.
   הערה: בצע את הסרת פתרון החסימה ותוספת של ערוץ אחר ערוץ פתרון נוגדנים כדי להבטיח שתאים לא יתייבשו ביניהם.
6. דגימות דגירה עם הנוגדנים העיקריים לילה בתאים לחים ב 4 °C (50 °F).
   הערה: הדגירה יכולה להתבצע גם במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, אם מעוניין להמשיך עם השלבים הבאים באותו יום.

4. דגירה של גשושית PLA

הערה: עבור כל השלבים בסעיף 4.1-7.3, מאגרי הכביסה A ו- B מאוחסנים ב 4 °C (7 °F) ויש לחמם אותם ל- RT לפני השימוש.

1. לדלל PLA-בדיקות (+)-עכבר ו --)ארנב ל 1:5 ב PLA נוגדן דילול (או 1% BSA) פתרון. הכן 30 μL לערוץ.
2. לשטוף דגימות 2x במשך 5 דקות באמצעות 90 μL של חוצץ לשטוף A ב RT על ידי הוספת אותו באחד המאגרים ושאיפה בזהירות מן המאגר השני. חזור על שלב זה עבור כל אחד מ- 6 הערוצים בכל שקופית.
3. שאפו את מאגר הכביסה בזהירות והוסיפו 30 μL של פתרון בדיקה PLA (מוכן בשלב 4.1), בדומה לתוספת של נוגדנים ראשוניים בשלב 3.5.
4. דגימות דגירה עבור 1 שעה ב 37 °C (50 °F) בתא לח.

5. קשירה

1. לשטוף דגימות 2x במשך 5 דקות באמצעות 90 μL של חוצץ לשטוף A ב RT, כמתואר 4.2.
2. הכן דילול 1:5 של מאגר הקשירה במים דה-יעומת. השתמש במאגר זה כדי לדלל את האנזים ליגאז ל 1:40 (על קרח). השתמש ב- 30 μL לערוץ.
3. שאפו את מאגר הכביסה A לחלוטין והוסיפו את תמסת קשירה כמתואר ב-3.5.
4. דגימות דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F) בתא לח.

6. הגברה

1. לשטוף דגימות 2x במשך 2 דקות באמצעות 90 μL של חוצץ לשטוף A ב RT, כמתואר 4.2.
2. הכן את מאגר ההגברה על ידי דילולו 1:5 במים דה-יונים והשתמש בו כדי לדלל את האנזים פולימראז ל-1:80 (על הקרח). הגן מפני אור. הכן 30 μL לערוץ.
3. שאפו את מאגר הכביסה A הוסיפו באופן מלא ומיידי את פתרון ההגברה המוכן לערוץ הריק, כמתואר ב-3.5. דגימות דגירה במשך 100 דקות ב 37 °C (50 °F) בתא לח.

7. הרכבה

1. לשטוף דגימות 2x במשך 10 דקות באמצעות 90 μL של לשטוף חוצץ B ב RT כמתואר 4.2. הוסף DAPI (1:500) מפתרון מלאי מ"ג /מ"ל אחד (במים דה-יושפזים) בשטיפה הראשונה כדי להכתים גרעינים. אין לייבש את הערוץ.
2. לדלל את חוצץ לשטוף B במים deionized (1:10) ולשטוף 1x עם 90 μL של 0.1x חוצץ B פתרון כמתואר 4.2.
3. שואפים את חוצץ הכביסה B לחלוטין ומיד להוסיף 2-3 טיפות של נוזל הרכבה בינונית למאגר אחד. פזר אותו בערוץ על-ידי הטיית השקופית. יש לאחסן דגימות במהירות של 4 °C (7%), בסביבה לחה עד להדמיה.

8. רכישת תמונות

1. השג תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ודא כי המסננים המתאימים לבדיקות PLA פלואורסצנטיות זמינים.
   הערה: זה מועיל לעשות שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי, אם אפשר, כמו כתמי PLA שהושגו מוגדרים יותר. הדבר תומך גם בעיבוד תמונה נוסף וניתוח נתונים.

9. ניתוח וכימות תמונה באמצעות ImageJ/FIJI

1. עבד תמונות מיוצאות (.tiff) עם תוכנית לעיבוד תמונה, כגון ^ImageJ27.
   הערה: כל התסריטים המשמשים במחקר זה והם נחוצים לספירה אוטומטית של תאיים, גרעיניים וכל אירועי PLA (לכל תא) ניתן למצוא במאגר GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות כל תוכנית או כלי מתאימים.

Results

השתמשנו בעבר PLA כדי לזהות אינטראקציות של חלבוני SMAD ^שונים3 וניתחנו שינויים המושרה מתח גיזה בזרחן ^SMAD28.

כאן, שתי השיטות שולבו עם הפרוטוקול שתואר לעיל. HUVECs היו נתונים ללחץ גיסת של 1 גוון / ^cm2 ו 30 גוון / ^cm2 ונותחו עבור אינטראקציות של גורמי שעתוק SMAD. אנו מראים כי בהשוואה ללחץ הגיסה הגבוה (30 גוון/^cm2), מתח הגיסה הנמוך (1 גוון/^cm2) מוביל לעלייה משמעותית באינטראקציות SMAD1-SMAD2/3, מה שנקרא מתחמי ...

Discussion

הפרוטוקול מבוסס PLA המתואר כאן מציע דרך יעילה לקבוע קרבה של שני חלבונים (למשל, האינטראקציה הישירה שלהם) ב- ECs החשופים ללחץ גיסת עם רזולוציה כמותית ומרחבית. באמצעות שקופיות זרימה עם ערוצים מקבילים מרובים, ניתן לבחון מספר אינטראקציות חלבון שונות בו זמנית בתאים בתנאים מכניים זהים. לעומת זאת, מערכות תא זרימה בהתאמה אישית עושות לעתים קרובות שימוש בערוץ יחיד הבנוי סביב כיסוי זכוכית, מה שיאפשר ניסוי PLA יחיד בלבד ללא הפקדים הדרושים לכל שקופית ומשאבה. למרות פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של אינטראקציות SMAD, זה יכול להיות מותאם כדי ל...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide VI 0.4	ibidi	80606	שקופית 6 ערוצים
אמוניום כלוריד	קארל רוט	K298.1	מרווה
סרום בקר אלבומין	קארל רוט	8076.4	חסימת
DAPI	Sigma Aldrich/ Merck	D9542	כתם DNA/גרעינים
DPBS	PAN Biotech	P04-53500	PBS
Duolink In ריאגנטים לזיהוי באתר: Green	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92014	ערכת PLA המכילה ליגאז, מאגר קשירה, פולימראז ומאגר הגברה (עם תווית ירוקה אוליגונוקלאוטידים)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92004	MINUS בדיקה
Duolink באתרה בדיקת PLA אנטי-ארנב PLUS	סיגמא אולדריץ'/ Merck	DUO92002	PLUS בדיקה
Duolink במאגרי שטיפה באתר, מאגרי שטיפה פלואורסצנטיים	סיגמא אולדריץ' / Merck	DUO82049	PLA תוסף
צמיחת תאי אנדותל	קורנינג		לבינוני (ECGS)
תוסף			עגל עוברי
FIJI			תוכנת ניתוח תמונה
פורמלדהיד 4% מאגר	KLINIPATH / VWR	VWRK4186. BO1	PFA
בינוני מלא			M199 בינוני בסיסי +20% FCS +1% P/S + 2 ננומטר L-Glu +  25 ומיקרו; גר/מ"ל Hep +    50 ומיקרו; g/mL ECGS
ג'לטין מעור חזיר, סוג A	Sigma Aldrich	G2500	השתמש ב-0.1% ב-PBS לציפוי תעלות זרימה
GraphPad Prism v.7	GarphPad		תוכנית סטטיסטית המשמשת לעלילות וחישובים סטטיסטיים
מלח נתרן הפרין מרירית המעי חזיר	תוסף Sigma Aldrich	H4784-250MG	בינוניים
			(Hep)
ibidi הרכבה בינונית	ibidi	50001	הרכבה נוזלית בינונית
ibidi מערכת משאבות	ibidi	10902	משאבה פנאומטית
Leica TCS SP8	Leica		מיקרוסקופ קונפוקלי
L-Glutamin 200mM	PAN Biotech	P04-80100	תוסף לבינוני (L-Glu)
בינוני 199	Sigma Aldrich	M2154	בסיס בינוני
עכבר נגד SMAD1 נוגדן	Abcam	ab53745	מתאים לעכבר PLA
אנטי-SMAD2/3 נוגדן	BD Bioscience	610843	לא מתאים ל-PLA בשילוב עם CST 9515
mousee anti- SMAD4 נוגדן	Sanata Cruz Biotechnology	sc-7966	מתאים ל-PLA
פניצילין 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml	PAN Biotech	P06-07100	תוסף לבינוני (P/ S)
סט זלוף לבן	ibidi	10963	צינורות המשמשים ל 1 dyn / cm2
סט זלוף צהוב וירוק	ibidi	10964	צינורות המשמשים ל 30 dyn/cm2< / sup>
rabbit אנטי פוספו SMAD1/5 טכנולוגיות	איתות תאי	9516	מתאים ל PLA
ארנב אנטי- SMAD2/3 XP	טכנולוגיות איתות תאי	8685	מתאים עבור PLA
ארנב אנטי- SMAD4 נוגדן	תאי איתות טכנולוגיות	9515	לא מתאים ל- PLA בשילוב עם BD 610843
מחבר טורי עבור µ-Slides	ibidi	10830	צינורות חיבור טוריים
טריטון X-100	קארל רוט	6683.1	חדירות