הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

Paul-Lennard Mendez; Leon Obendorf; Petra Knaus

doi:10.3791/62608

Method Article

הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

DOI:

10.3791/62608

⸱

September 14th, 2021

Paul-Lennard Mendez¹^,² , Leon Obendorf¹ , Petra Knaus¹

¹Institute for Chemistry and Biochemistry, Freie Universität Berlin, ²International Max-Planck Research School for Biology and Computation

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן, אנו מקימים פרוטוקול כדי לדמיין ולנתח בו זמנית מתחמי SMAD מרובים באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA) בתאי אנדותל החשופים לתנאי לחץ גזיר נוזלים פתולוגיים ופיזיולוגיים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

שינוי גורם גדילה β (TGFβ)/חלבון מורפוגנטי עצם (BMP) איתות מוסדר ומאוזן היטב במהלך הפיתוח וההומאוסטזיס של מערכת כלי הדם ולכן, הסרת הפיקוח במסלול איתות זה גורמת לפתולוגיות כלי דם חמורות, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, טלנגיקטזיה דימומית תורשתית וטרשת עורקים. תאי אנדותל (ECs), כמו השכבה הפנימית ביותר של כלי הדם, חשופים כל הזמן ללחץ גיסת נוזלים (SS). דפוסים חריגים של SS נוזל הוכחו כדי לשפר את זהות TGFβ/BMP, אשר, יחד עם גירויים אחרים, לגרום טרוגנזה. ביחס לכך, atheroprone, למינאר נמוך SS נמצא כדי לשפר את זהות TGFβ / BMP בעוד SS atheroprotective, למינר גבוה, מפחית איתות זה. כדי לנתח ביעילות את ההפעלה של מסלולים אלה, עיצבנו זרימת עבודה כדי לחקור את היווצרות מתחמי גורם התמלול תחת SS למינאר נמוך ותנאי SS למינאר גבוהים באמצעות מערכת משאבה פנאומטית זמינה מסחרית ובוח קשירת קרבה (PLA).

איתות TGFβ/BMP פעיל דורש היווצרות מתחמי SMAD טרימרים המורכבים משני SMAD רגולטוריים (R-SMAD); SMAD2/3 ו- SMAD1/5/8 עבור איתות TGFβ ו- BMP, בהתאמה) עם מתווך נפוץ SMAD (SMAD משותף; SMAD4). באמצעות PLA מיקוד subunits שונים של קומפלקס SMAD טרימר, כלומר, או R-SMAD / co-SMAD או R-SMAD / R-SMAD / R-SMAD, היווצרות של מתחמי גורם שעתוק SMAD פעיל ניתן למדוד כמותית מרחבית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

השימוש בשקופיות זרימה עם 6 ערוצים מקבילים קטנים, שניתן לחבר בסדרה, מאפשר לחקור את גורם התמלול היווצרות מורכבת והכלה של פקדים נחוצים.

זרימת העבודה המוסברת כאן יכולה להיות מותאמת בקלות למחקרים המתמקדים בקרבה של SMADs לגורמי שעתוק אחרים או למתחמי גורם תמלול שאינם SMADs, בתנאי SS זורמים שונים. זרימת העבודה המוצגת כאן מציגה דרך מהירה ויעילה ללמוד את האיתות TGFβ/BMP המושרה ב- SS הנוזלי ב- ECs, הן כמותית והן מרחבית.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חלבונים של גורמי גדילה משתנים בטא (TGFβ) superfamily הם ציטוקינים pleiotropic עם מגוון רחב של חברים, כולל TGFβs, חלבונים מורפוגנטיים עצם (BMPs), ו Activins1,2. כריכת ליגנד גורמת להיווצרות של אוליגומרים קולטנים המובילים לזרחן, ובכך, הפעלה של SMAD רגולטורי ציטוטולי (R-SMAD). בהתאם למשפחת המשנה של ליגנדים, R-SMADs שונים ^{מופעלים1,2}. בעוד TGFβs ו Activins בעיקר לגרום זרחן של SMAD2/3, BMPs לגרום SMAD1/5/8 זרחן. עם זאת, ישנן עדויות מצטברות כי BMPs ו- TGFβs/Activins מפעילים גם R-SMADs של תת-המשפחה האחרת בהתאמה, בתהליך המכונה 'איתות לרוחב'3,4,5,6,7,8 וכי ישנם מ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. תרבית התא וחשיפה ללחץ גזל

הערה: ECs וריד טבור אנושי (HUVECs) שימשו כדוגמה לחקר אינטראקציה המושרה SS של SMADs. ניתן להחיל את הפרוטוקול המתואר להלן על כל סוג תא רספונסיבי של SS.

מעיל שקופית 6 ערוצים עם 0.1% ג'לטין עור חזירי PBS במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F).
זרע HUVECs בשקופיות 6 ערוצים מצופות מראש בצפיפות של 2.5 x ¹⁰⁶ תאים למ"ל ב- 30 μL של M199 בינוני מלא.
הערה: לקבלת מידע נוסף אודות אופן הזרימה של תאים בשקופית הזרימה, ראה ^reference24.
תן לתאים לדבוק במשך 1 שעות ב 37 °C בחממה לחה.
הוסף 60 μL של M199 בינוני מלא מחומם מראש לכל אחד מהמאגרים.
תרבות במשך יומי....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

השתמשנו בעבר PLA כדי לזהות אינטראקציות של חלבוני SMAD ^שונים3 וניתחנו שינויים המושרה מתח גיזה בזרחן ^SMAD28.

כאן, שתי השיטות שולבו עם הפרוטוקול שתואר לעיל. HUVECs היו נתונים ללחץ גיסת של 1 גוון / ^cm2 ו 30 גוון / ^cm2 ונותחו עבור אינטראקציות של גורמי שעתוק SMAD. אנו מראים כי בהשוואה ללחץ הגיסה הגבוה (30 גוון/^cm2), מתח הגיסה הנמוך (1 גוון/^cm2) מוביל לעלייה משמעותית באינטראקציות SMAD1-SMAD2/3, מה שנקרא מתחמי .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הפרוטוקול מבוסס PLA המתואר כאן מציע דרך יעילה לקבוע קרבה של שני חלבונים (למשל, האינטראקציה הישירה שלהם) ב- ECs החשופים ללחץ גיסת עם רזולוציה כמותית ומרחבית. באמצעות שקופיות זרימה עם ערוצים מקבילים מרובים, ניתן לבחון מספר אינטראקציות חלבון שונות בו זמנית בתאים בתנאים מכניים זהים. לעומת זאת, מערכות תא זרימה בהתאמה אישית עושות לעתים קרובות שימוש בערוץ יחיד הבנוי סביב כיסוי זכוכית, מה שיאפשר ניסוי PLA יחיד בלבד ללא הפקדים הדרושים לכל שקופית ומשאבה. למרות פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של אינטראקציות SMAD, זה יכול להיות מותאם כדי ל.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מודים לד"ר מריה רייכנבך ולט"ר כריסטיאן הייפן על תמיכתם במערכת הזרימה ואלינור פוקס ויוניון שיאו על שקראו את כתב היד בביקורתיות. P-L.M. מומן על ידי בית הספר הבינלאומי מקס פלאנק מחקר IMPRS-ביולוגיה וחישוב (IMPRS-BAC). PK קיבלה מימון על ידי DFG-SFB1444. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
µ-Slide VI 0.4	ibidi	80606	שקופית 6 ערוצים
אמוניום כלוריד	קארל רוט	K298.1	מרווה
סרום בקר אלבומין	קארל רוט	8076.4	חסימת
DAPI	Sigma Aldrich/ Merck	D9542	כתם DNA/גרעינים
DPBS	PAN Biotech	P04-53500	PBS
Duolink In ריאגנטים לזיהוי באתר: Green	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92014	ערכת PLA המכילה ליגאז, מאגר קשירה, פולימראז ומאגר הגברה (עם תווית ירוקה אוליגונוקלאוטידים)
Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS	Sigma Aldrich/ Merck	DUO92004	MINUS בדיקה
Duolink באתרה בדיקת PLA אנטי-ארנב PLUS	סיגמא אולדריץ'/ Merck	DUO92002	PLUS בדיקה
Duolink במאגרי שטיפה באתר, מאגרי שטיפה פלואורסצנטיים	סיגמא אולדריץ' / Merck	DUO82049	PLA תוסף
צמיחת תאי אנדותל	קורנינג		לבינוני (ECGS)
תוסף			עגל עוברי
FIJI			תוכנת ניתוח תמונה
פורמלדהיד 4% מאגר	KLINIPATH / VWR	VWRK4186. BO1	PFA
בינוני מלא			M199 בינוני בסיסי +20% FCS +1% P/S + 2 ננומטר L-Glu + 25 ומיקרו; גר/מ"ל Hep + 50 ומיקרו; g/mL ECGS
ג'לטין מעור חזיר, סוג A	Sigma Aldrich	G2500	השתמש ב-0.1% ב-PBS לציפוי תעלות זרימה
GraphPad Prism v.7	GarphPad		תוכנית סטטיסטית המשמשת לעלילות וחישובים סטטיסטיים
מלח נתרן הפרין מרירית המעי חזיר	תוסף Sigma Aldrich	H4784-250MG	בינוניים
			(Hep)
ibidi הרכבה בינונית	ibidi	50001	הרכבה נוזלית בינונית
ibidi מערכת משאבות	ibidi	10902	משאבה פנאומטית
Leica TCS SP8	Leica		מיקרוסקופ קונפוקלי
L-Glutamin 200mM	PAN Biotech	P04-80100	תוסף לבינוני (L-Glu)
בינוני 199	Sigma Aldrich	M2154	בסיס בינוני
עכבר נגד SMAD1 נוגדן	Abcam	ab53745	מתאים לעכבר PLA
אנטי-SMAD2/3 נוגדן	BD Bioscience	610843	לא מתאים ל-PLA בשילוב עם CST 9515
mousee anti- SMAD4 נוגדן	Sanata Cruz Biotechnology	sc-7966	מתאים ל-PLA
פניצילין 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml	PAN Biotech	P06-07100	תוסף לבינוני (P/ S)
סט זלוף לבן	ibidi	10963	צינורות המשמשים ל 1 dyn / cm2
סט זלוף צהוב וירוק	ibidi	10964	צינורות המשמשים ל 30 dyn/cm^{2< / sup>}
rabbit אנטי פוספו SMAD1/5 טכנולוגיות	איתות תאי	9516	מתאים ל PLA
ארנב אנטי- SMAD2/3 XP	טכנולוגיות איתות תאי	8685	מתאים עבור PLA
ארנב אנטי- SMAD4 נוגדן	תאי איתות טכנולוגיות	9515	לא מתאים ל- PLA בשילוב עם BD 610843
מחבר טורי עבור µ-Slides	ibidi	10830	צינורות חיבור טוריים
טריטון X-100	קארל רוט	6683.1	חדירות

תוסף סרום לבינוני עבור HUVECs נוגדנים נוגדנים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition. Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).
Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. Recent advances in BMP receptor sig....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles