מאמר שיטה

אפיון תא יחיד של זרם סידן וזיהום HIV-1 באמצעות פלטפורמה אופטופלוידית רב-מפרקית

2.5K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62632

⸱

18 במאי 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Division of Infectious Diseases, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 3Black Family Stem Cell Institute, Department of Genetics and Genomic Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, Icahn Institute of Data Science and Genomic Technology, 4Sema4, a Mount Sinai venture

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול שבו תאים בודדים מנוטרים לאירועים חריפים וזיהום HIV-1 פרודוקטיבי במכשיר ננופלואידי. נתוני דימות מגדירים אינטראקציות של קולטן מארח וירוסים ודינמיקה של מסלולי איתות. זוהי השיטה הראשונה עבור תרבות תא יחיד אורך תפוקה גבוהה ננופלואידית והדמיה ללמוד קינטיקה איתות ואינטראקציות מולקולריות.

תקציר

HIV-1 גורם לזיהום כרוני המשפיע על יותר מ -37 מיליון אנשים ברחבי העולם. אנשים החיים עם וירוס כשל חיסוני אנושי (HIV) חווים תחלואה הקשורה לדלקת כרונית למרות טיפול תרופתי. עם זאת, איתות דלקתי אלה לא התאפיינו באופן מלא. תפקידם של אירועי כניסה מוקדמת על הפעלת אירועי איתות תאיים וביטוי גנים במורד הזרם לא נלכד ברמת תא יחיד. כאן המחברים מתארים שיטה המחילה עקרונות של מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של תאים חיים על פלטפורמה אוטומטית של תא יחיד, המתרבתת ודימוי תאים במהלך קורסי זמן מותאמים אישית על-ידי המשתמש, ומאפשרת ניתוח תפוקה גבוהה של תהליכים תאיים דינמיים. בדיקה זו יכולה לעקוב אחר מיקרוסקופיה פלואורסצנטית חיה חד-תאית של אירועים מוקדמים מיד לאחר הידבקות ב- HIV-1, במיוחד זרם הסידן המלווה חשיפה לנגיף ופיתוח זיהום פרודוקטיבי באמצעות וירוס כתב פלואורסצנטי. תאי MT-4 עמוסים בצבע רגיש לסידן ומתרבים בעטים מבודדים במכשיר ננופלואידי. התאים התרבותיים נגועים בנגיף כתב HIV-1 (HIV-1 NLCI). מיקרוסקופ פלואורסצנטי הממוקם מעל המכשיר הננופלואידי מודד זרימת סידן לאורך 8 דקות לאחר חשיפה חריפה ל- HIV-1. זיהום פרודוקטיבי HIV-1 נמדד באותם תאים על פני מרווח של 4 ימים. נתוני הדמיה מקורסי זמן אלה מנותחים כדי להגדיר אינטראקציות קולטן מארח וירוסים ודינמיקת מסלול איתות. המחברים מציגים חלופה משולבת ומדרגית לשיטות הדמיה מסורתיות באמצעות פלטפורמה אופטופלוידית חדשנית המסוגלת למיין תא יחיד, culturing, הדמיה ואוטומציה של תוכנה. מבחנים אלה יכולים למדוד את הקינטיקה של אירועים בתנאים שונים, כולל סוג התא, אגוניסט או אפקט אנטגוניסט, תוך מדידת מערך של פרמטרים. זוהי השיטה המבוססת הראשונה לתרבות חד-תאית ננופלואידית בעלת תפוקה גבוהה והדמיה: טכניקה זו יכולה להיות מותאמת באופן נרחב לחקר קינטיקה איתות תאי ואינטראקציות מולקולריות דינמיות.

מבוא

דלקת כרונית היא הגורם המוביל לתחלואה מוקדמת הקשורה ל- HIV ותמותה1,2,3. ישנם מנגנונים רבים לפיהם HIV יכול להפעיל איתות דלקתי, והראיות האחרונות מצביעות על תפקיד עבור קולטני P2X בהזנת HIV שהם סידן-gating אדנוזין טריפוספט (ATP) קולטנים3,4,5,6,7,8,9,10. תת סוג P2X של קולטנים purinergic (P2XR) עשוי להיות מנחים חשובים של דלקת זו. עם זאת, המנגנונים המולקולריים של אינטראקציות HIV-P2XR אינם ידועים במידה רבה ועשויים להשפיע על צעדי מחזור החיים הנגיפיים המוקדמים והמאוחרים של HIV-1. הגדרת המסלולים והקינטיקה המניעים דלקת כרונית הקשורה ל- HIV היא קריטית לקידום אפשרויות הטיפול עבור אנשים עם HIV.

כדי להעריך אם HIV-1 מייסר ישירות קולטני P2X, הפעלת P2XR וזיהום HIV-1 חייב להימדד במקביל. מבחנים של פעילות P2XR וזיהום HIV-1 הוקמו באופן עצמאי: זרם הסידן התאי הוא אינדיקטור להפעלת P2XR, וזיהום פרודוקטיבי HIV-1 יכול להיות מכמת על ידי שפע RNA. גילוי פלואורסצנטי של זרם סידן אפשרי עם צבע פלואו-4 סידן רגיש, וזיהום HIV-1 ניתן לדמיין עם וירוס הכתב פלורסנט mCherry HIV-NLCI11,12,13,14,15.

מכיוון שאינדיקטורים אלה להפעלת P2X (זרם סידן תאי חריף) וזיהום HIV-1 (סינתזת HIV-1 RNA) מתרחשים על צירי זמן שונים (דקות לעומת ימים), חסרה שיטת תפוקה גבוהה המאפשרת ניתוח מזווג של הפעלת P2XR וזיהום HIV-1. טכניקות ניסיוניות סטנדרטיות בעלות תפוקה גבוהה, כגון ציטומטריית זרימה, מאפשרות ניתוח אוכלוסין אך אינן יכולות להעריך את הקשר בין אירועים אקוטיים לאירועים אורך בתאים בודדים. לחלופין, הדמיה חד-תאית עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטנדרטי היא בעלת תפוקה נמוכה. מגבלות ניסיוניות אלה מציגות צורך בטכניקות חדשניות בעלות תפוקה גבוהה למדידת קשרים בין אירועים תאיים חריפים ואורך ישירות.

מערכת אופטופלוידית המתוארת היא פלטפורמה חדשנית המסוגלת למיין ולבודד תא יחיד, culturing, הדמיה, ואוטומציה תוכנה16,17,18,19. מערכת זו מציגה חלופה משולבת ובעלת תפוקה גבוהה למגבלות של שיטות הדמיה מסורתיות. פלטפורמת ביקון מורכבת מפחמן דו חמצני (CO2)ואינקובטור מבוקר טמפרטורה התומך בתאים הכלולים בשבב. השבב בעל טרנזיסטורים רגישים לאור המייצרים שיפוע חשמלי בתגובה לאור ממוקד. כוח דיאלקטרופורטי זה משמש להעברת תאים בודדים על פני השבב הננופלואידי לאזורים הרצויים. תאים ממוינים לתוך עטים על השבב, אשר מספקים מחסום לבודד תאים בודדים פיזית. זרימה למינארית רציפה של מדיית צמיחה בכל השבב מונעת נדידת תאים מן העטים תוך מתן אפשרות לפיזור חלקיקים קטנים של חומרים מזינים ריאגנטים ספציפיים לניסוי. מיקרוסקופ פלואורסצנטי יושב מעל השבב. אוטומציית תוכנה משמשת ללכידת תמונות של השבב בנקודת הזמן שצוינה על-ידי המשתמש.

כל אפיון התאים בוצע באמצעות מערכת אופטופלוידית לבחירה ומניפולציה של תא יחיד. מערכת זו מורכבת מרכיבים מכניים, מיקרופלואידיים ואופטיים משולבים המאפשרים מניפולציה, מבחנים, תרבות והדמיה חד-תאיים. התאים טעונים ומתרבתים במכשיר הננו-פלוואידי החד פעמי המורכב מ-3,500 תאים בודדים (עטים), שכל אחד מהם מסוגל להחזיק נפח תת-ננו-ליטר. תאים יכולים להיות ממוקמים בתוך עטים באמצעות אור המושרה "כלובים" dielectrophoretic ותרבית בתנאים מבוקרים טמפרטורה ו- CO2. microfluidics לאפשר זלוף של מדיה או חוצצים על השבב לתרבות התא או טיפול תרופתי. מחט מופעלת מאפשרת ייבוא וייצוא של תאים מצלחות באר דגירה ותריסים. ניתן לדמיין את אזור השבב בהגדלה של פי 4 או 10 בערוצי brightfield ופלואורסצנטיים (כולל DAPI, FITC, TRed או Cy5) כדי לאפיין פנוטיפים תאיים או ניתוח פונקציונלי. המערכת כולה אוטומטית באמצעות תוכנה שניתן להשתמש בה עבור זרימות עבודה מעוצבות מראש או ניסויים מותאמים אישית.

יחסים בין זיהום HIV-1 ו P2XR נחקרו, אבל הליך תפוקה גבוהה לאפיין ישירות אינטראקציות אלה במקביל לא דווח. כאן, המחברים מתארים מתודולוגיה לחקור אינטראקציות HIV-P2XR באמצעות מעקב אחר זרם סידן חריף וזיהום פרודוקטיבי HIV-1 הבאים ברמת תא יחיד. יש לציין, זה יוצר כלי חדשני המאפשר ישיר, תפוקה גבוהה, מדידה אורך של מטרות מרובות בתאים בודדים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת תאים להדמיה

  1. הכן פתרון טעינה טרי Fluo-4 AM: להוסיף 25 μL של ממס דטרגנט מרוכז 100x, ולאחר מכן להוסיף 2.5 μL של Fluo-4 AM 1000x לצינור 1.5 מ"ל. וורטקס לערבב.
  2. פיפטה 2.5 מ"ל של מדיה תרבותית לפתרון הטעינה והפוך לערבב. הגן מפני אור.
  3. צנטריפוגה 2 x 106 MT-4 תאים ב 500 x g במשך 3 דקות.
  4. הסר מדיה ו resuspend גלולה ב 2 מ"ל של פתרון הטעינה המוכן Fluo-4 AM. הגן מפני אור.
  5. פיפטה הכניסה תאים לתבנית פטרי 35 מ"מ. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15-30 דקות, ולאחר מכן דגירה במשך 15-30 דקות נוספות בטמפרטורת החדר.
  6. העבר את השעיית התא לצינור צנטריפוגה. תאי צנטריפוגה ב 500 x g במשך 3 דקות ולהסיר את supernatant המורכב פתרון הטעינה.
  7. Resuspend גלולת התא על ידי pipetting ב 1 מ"ל של מדיום התרבות צנטריפוגה ב 500 x g במשך 3 דקות לשטוף.
  8. Resuspend גלולת התא על ידי pipetting במדיום התרבות בריכוז של 2 x 106 תאים / מ"ל (מינימום 50 μL). הגן מפני אור.

2. הכנת מערכת Optofluidic, טעינת תאים, וכתיבת תאים

  1. הכן שבב עם פתרון הרטבה, אשר מקל על כתיבת תאים.
    1. כדי לעשות זאת, לטעון צינורות צנטריפוגה המכילים 2 מ"ל של פתרון הרטבה ו 50 מ"ל של מים DI על המכשיר עם שבב optofluidic חדש ולהפעיל את הפונקציה שבב רטוב. פונקציה זו תציף באופן אוטומטי את השבב בתמיסת ההרטבה דרך נוזלי המערכת, תדגיר את השבב ב-50 מעלות צלזיוס ותשטף את השבב במים 3 פעמים.
    2. לאחר שטיפת מים נעשה, לשטוף את השבב עם 3 מחזורים של 250 μL של מדיה תרבות.
  2. להשלים את השעיית התא משלב 1.8 עם 1:100 F-127 חומר ניקוי solute לפני הטעינה כדי להפחית את הסבירות של תאים נדבקים לערוצי השבב.
  3. השתמש במחט ייצוא המכשיר כדי לייבא תאים מצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל באמצעות פעולת עומס וייבוא נפח קטן עבור נפח 5 תאים μL.
  4. תאי עט המשתמשים במתח מיקום אופטו-חשמלי (OEP) ממוטב של 4.3 V ומהירות כלוב של 5 מיקרומטר לשעה. פניינג מתרחשת באמצעות OEP. השלם עט באמצעות הפונקציה Autopen, אשר autodetect תאים בודדים, להקיף אותם עם כלוב OEP, ולהעביר אותם לתוך עט סמוך. אם תאים מעניינים נשארים לאחר ההטבעה האוטומטית, השתמש בפונקציה Manual pen כדי לבחור תאי יעד (בלחיצת עכבר) ובעט יעד (בלחיצת עכבר עוקבת).
  5. לאחר השלמת penning (או כאשר הפונקציה Autopen משלים או כאשר המספר הרצוי של תאים penned הושג), לשטוף את השבב עם 3 מחזורים של 250 μL של מדיה תרבות כדי לנקות כל תא unpenned שנותר מהשבב.

3. זיהום חד-תאי והדמיה תפקודית

  1. לאחר כתיבת תאים, השג תמונות פלואורסצנטיות של תאים בערוצי FITC, טקסס רד ו- DAPI כדי למדוד את פלואו-4 הבסיסי, mCherry ושפעת אוטומטית.
  2. להחדיר HIV-1 לתוך השבב בריכוז של 13 ng של HIV-1 NL-CI לכל 2 x 106 תאים על ידי צינור לאט את ההשעיה לתוך השבב דרך מחט הייצוא.
  3. מיד לאחר תוספת HIV-1, שוב ושוב להשיג תמונות בערוצי FITC ו DAPI על פני קורס זמן 10 דקות.
  4. השג תמונות בערוצי טקסס אדום ו- DAPI ב- 1, 2, 3 ו- 4 ימים לאחר ההדבקה (DPI).

4. ניתוח נתוני הדמיה תפקודית חד-תאית עם תוכנת FIJI

  1. בכל נקודת זמן בכל ערוץ הדמיה של עניין, השתמש בכלי בחירת הנקודות של FIJI ובפונקציה Measure כדי למדוד את אותות Fluo-4, mCherry ו- autofluorescence של כל תא. מדוד בו-זמנית את פלואורסצנטיות הרקע על-ידי חישוב עוצמת הפלואורסצנטיות הממוצעת (MFI) של העט והשבב המכילים כל תא.
  2. שליטה עבור פלואורסצנטיות הרקע ושפע אוטומטי באמצעות הפונקציה מדידה כדי למצוא את MFI בבחירת אזור ולחסרת ערך זה מערך פלואורסצנטיות התא.
  3. נרמלו את פלואורסצנטיות הרקע של כל תמונת שבב: מדדו את ה-MFI של השבב בכל שדה. לאחר מכן הפחת את ה- MFI של השבב עם פלואורסצנטיות הרקע הפחותה ביותר מכל מדידות MFI שבב אחרות.
  4. נרמל את פלואורסצנטיות הרקע של כל עט המכיל תא: מדוד את ה- MFI של העט של כל תא בכל שדה תצוגה. לאחר מכן הפחת ערך זה מה- MFI הגולמי של התא עבור כל שדה.
  5. בקרה עבור שפעת אוטומטית של התא: הפחת את MFI של יום 0 ויום 4 DAPI של כל תא מה- MPI של יום 0 ו- 4 mCherry.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

איור 1 מדגים את הפורמט של נתוני השבב וההדמיה הגולמית הנרכשים באמצעות מיקרוסקופ הפלואורסצנטי. הזיהוי והקיבוץ באשכולות של תאים לא נגועים ונדבקים באמצעות מדידת mCherry מוצגים באיור 2. אשכולות אלה מנותחים לקינטיקה של זרם הסידן באיור 3, הממחישה זרם סידן מוקדם בתאים נגועים ב- HIV. איור 4 מראה מתאם חיובי משמעותי בין זרם הסידן לבין פלואורסצנטיות 20.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

המתודולוגיה המתוארת כדי לחקור את הקשר בין זרם סידן לבין זיהום פרודוקטיבי HIV-1 בתאים בודדים ניתן להתאים ללמוד קינטיקה סידן תאיים בתגובה אגוניסטים אחרים או אנטגוניסטים של עניין. הכנת תאים להדמיה היא פשוטה, מינימלית זמן אינטנסיבי, ריאגנטים זמינים ערכות נוחות של יצרנים בשימוש נרחב. מדידת סידן מבוססת Fluo-4 מתוארת היטב בספרות, ו- HIV-1 יכול בקלות להיות מוחלף וירוסים אחרים או תרכובות של עניין ללמוד על פלטפורמה זו. ניתן להשתמש בסוגי תאים שונים ובאמצעי תרבות שונים. ערוצי פלואורסצנטיות חלופיים או נוספים נתמכים, ופלואורופורים מרו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

ר.פ.ס. הוא עובד של סמ4. המחברים האחרים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

אנו אסירי תודה על הדיונים המדעיים עם ד"ר בנג'מין צ'ן. עבודה זו מומנה על ידי K08AI120806 (THS), R01DA052255 (THS ו KB), ו R21AI152833 (THS ו KB).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
  משואה מערכת אופטופלוזידיתברקלי אורות
  סרום בקר עובריGibco
  תוכנת קוד פתוח של פיג'יPMID: 22743772, 22930834
  ערכת הדמיית סידן Fluo-4Thermo Fisher  F10489
  מעבדת HIV-1 NLCINL4-3של בנג'מין צ'ןPMID: 28148796
  Hyclone Pennecillin תמיסת סטרפטומיציןGE Healthcare מדעי החיים  SV30010
  תאי MT-4איידס NIH  ARP-120
  שבב OptoSelect 3500Berkeley Lights
  טיפים לפיפטורדנוויל סיינטיפיק  P3020-CPS
  פריזמה 9.0.0GraphPad
  RPMI-1640סיגמא-אולדריץ  R8758
פיפטות סרולוגיותמותג פישר  13-678-11E
מכסה מנוע תרבית רקמותדגמים
צלוחיות T75קורנינג3073
מגיב ' בינונישונים

מקורות

  1. Aberg, J. A. Aging, inflammation, and HIV infection. Topics in Antiviral Medicine. 20 (3), 101-105 (2012).
  2. Deeks, S. G., Tracy, R., Douek, D. C. Systemic effects of inflammation on health during chronic HIV infection. Immunity. 39 (4), 633-645 (2013).
  3. Swartz, T. H., Dubyak, G. R., Chen, B. K. Purinergic receptors: Key mediators of HIV-1 infection and inflammation. Fromtiers in Immunology. 6, 585(2015).
  4. Giroud, C., Marin, M., Hammonds, J., Spearman, P., Melikyan, G. B. P2X1 receptor antagonists inhibit HIV-1 fusion by blocking virus-coreceptor interactions. Journal of Virology. 89 (18), 9368-9382 (2015).
  5. Hazleton, J. E., Berman, J. W., Eugenin, E. A. Purinergic receptors are required for HIV-1 infection of primary human macrophages. Journal of Immunology. 188 (9), 4488-4495 (2012).
  6. Marin, M., et al. High-throughput HIV-cell fusion assay for discovery of virus entry inhibitors. Assay and Drug Development Technology. 13 (3), 155-166 (2015).
  7. Soare, A. Y., et al. P2X Antagonists inhibit HIV-1 productive infection and inflammatory cytokines interleukin-10 (IL-10) and IL-1β in a human tonsil explant model. Journal of Virology. 93 (1), 01186(2019).
  8. Sorrell, M. E., Hauser, K. F. Ligand-gated purinergic receptors regulate HIV-1 Tat and morphine related neurotoxicity in primary mouse striatal neuron-glia co-cultures. Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (2), 233-244 (2014).
  9. Swartz, T. H., Esposito, A. M., Durham, N. D., Hartmann, B. M., Chen, B. K. P2X-selective purinergic antagonists are strong inhibitors of HIV-1 fusion during both cell-to-cell and cell-free infection. Journal of Virology. 88 (19), 11504-11515 (2014).
  10. Soare, A. Y., et al. P2RX7 at the host-pathogen interface of infectious diseases. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 85 (1), (2021).
  11. Chen, P., Hübner, W., Spinelli, M. A., Chen, B. K. Predominant mode of human immunodeficiency virus transfer between T cells is mediated by sustained Env-dependent neutralization-resistant virological synapses. Journal of Virology. 81 (22), 12582-12595 (2007).
  12. Dale, B. M., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host Microbe. 10 (6), 551-562 (2011).
  13. Gee, K. R., et al. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium. 27 (2), 97-106 (2000).
  14. He, M. L., Zemkova, H., Koshimizu, T. A., Tomić, M., Stojilkovic, S. S. Intracellular calcium measurements as a method in studies on activity of purinergic P2X receptor channels. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 285 (2), 467-479 (2003).
  15. Li, H., Zony, C., Chen, P., Chen, B. K. Reduced potency and incomplete neutralization of broadly neutralizing antibodies against cell-to-cell transmission of HIV-1 with transmitted founder envs. Journal of Virology. 91 (9), 02425(2017).
  16. Beaumont, K. G., et al. Multiparameter cell characterization using nanofluidic technology facilitates real-time phenotypic and genotypic elucidation of intratumor heterogeneity. bioRxiv. , 457010(2018).
  17. Le, K., et al. Assuring clonality on the beacon digital cell line development platform. Biotechnology Journal. 15 (1), 1900247(2020).
  18. Mocciaro, A., et al. Light-activated cell identification and sorting (LACIS) for selection of edited clones on a nanofluidic device. Communications in Biology. 1, 41(2018).
  19. Winters, A., et al. Rapid single B cell antibody discovery using nanopens and structured light. MAbs. 11 (6), 1025-1035 (2019).
  20. Wu, N., Nishioka, W. K., Derecki, N. C., Maher, M. P. High-throughput-compatible assays using a genetically-encoded calcium indicator. Science Reports. 9 (1), 12692(2019).
  21. Esposito, A. M., et al. A high-throughput cre-lox activated viral membrane fusion assay to identify inhibitors of HIV-1 viral membrane fusion. Journal of Visualized Experiments. (138), e58074(2018).
  22. Soare, A. Y., et al. P2X1 selective antagonists block HIV-1 infection through inhibition of envelope conformation-dependent fusion. Journal of Virology. 94 (6), 01622(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

MT 4

מאמרים קשורים