מאמר שיטה

הערכה במבחנה של תכנות לב מחדש על ידי מדידת שטף סידן ספציפי לב עם כתב GCaMP3

DOI:

10.3791/62643

⸱

22 בפברואר 2022

 ,  , 
1Department of Cardiac Surgery, Cardiovascular Center, The University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Cardiovascular Medicine, Xiangya Hospital, Central South University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מתארים כאן, את הקמתו ויישום של Tg(Myh6-cre)1Jmk / J / GT (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze / J (המכונה αMHC-Cre / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 להלן) קו כתב עכבר להערכת תכנות לב. פיברובלסטים לב ילודים (NCFs) מבודדים מזן העכבר מומרים לקרדיומיוציטים מושרה (iCMs), ומאפשרים הערכה נוחה ויעילה של יעילות תכנות מחדש והתבגרות תפקודית של iCMs באמצעות שטף סידן (Ca2+).

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

תכנות לב הפך לטיפול מבטיח פוטנציאלי לתיקון לב פגום. על ידי החדרת גורמי שעתוק מרובים, כולל Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), פיברובלסטים ניתן לתכנת מחדש לתוך cardiomyocytes המושרה (iCMs). iCMs אלה, כאשר נוצר במקום בלב אוטם, לשלב חשמלית ומכאנית עם שריר הלב שמסביב, מה שמוביל לירידה בגודל צלקת ושיפור בתפקוד הלב. בגלל היעילות, הטוהר והאיכות הנמוכים יחסית של iCMs, אפיון iCMs נותר אתגר. השיטות הנפוצות כיום בתחום זה, כולל ציטומטריית זרימה, אימונוציטוכימיה ו- qPCR, מתמקדות בעיקר בביטוי גנים וחלבון ספציפיים לב, אך לא על ההתבגרות התפקודית של iCMs. מופעל על ידי פוטנציאל פעולה, פתיחת תעלות סידן מגודר מתח cardiomyocytes מוביל זרם מהיר של סידן לתוך התא. לכן, כימות קצב זרם הסידן היא שיטה מבטיחה להעריך את תפקוד הקרדיומיוציט. כאן, הפרוטוקול מציג שיטה להערכת תפקוד iCM על ידי שטף סידן (Ca2+). זן עכבר αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 הוקם על ידי חציית Tg(Myh6-cre)1Jmk/J (המכונה Myh6-Cre להלן) עם G(ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze/J (המכונה Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 להלן) עכברים. פיברובלסטים לב ילודים (NCFs) מעכברי יילודים P0-P2 היו מבודדים ותרבותיים במבחנה, ובנייה פוליציסטרונית של MGT הוצגה ל- NCFs, מה שהוביל לתכנות מחדש שלהם ל- iCMs. מכיוון שרק iCMs המתוכנתים מחדש בהצלחה יבטאו כתב GCaMP3, ההבשלה התפקודית של iCMs יכולה להיות מוערכת חזותית על ידי שטף Ca2+ עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בהשוואה ל- NCFs שלא תוכנתו מחדש, NCF-iCMs הראו שטף סידן ארעי משמעותי והתכווצות ספונטנית, בדומה ל- CMs. פרוטוקול זה מתאר בפירוט את הממסד זן העכבר, בידוד ובחירה של לבבות עכברים יילודים, בידוד NCF, ייצור של רטרווירוס לתכנות מחדש של הלב, אינדוקציה iCM, הערכה של iCM Ca2 + שטף באמצעות קו הכתב שלנו, וניתוח סטטיסטי קשור ומצגת נתונים. זה צפוי כי השיטות המתוארות כאן יספק פלטפורמה חשובה כדי להעריך את ההבשלה התפקודית של iCMs עבור מחקרים תכנות לב.

מבוא

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אוטם שריר הלב (MI) היא מחלה קשה ברחבי העולם. מחלות לב וכלי דם (CVDs) הן הגורם המוביל למוות ברחבי העולם ומהווה כ-18.6 מיליון מקרי מוות בשנת 20191,2. התמותה הכוללת של תקליטורי CVD ירדה במהלך חצי המאה האחרונה. עם זאת, מגמה זו הואטה או אפילו התהפכה בכמה מדינות לא מפותחות1, מה שקורא לטיפולים יעילים יותר של תקליטורי CVD. כאחד הביטויים הקטלניים של CVD, MI מהווה כמחצית מכלל מקרי המוות המיוחסים תקליטורי CVD בארצות הברית2. במהלך האיסכמיה, עם חסימת עורקים כליליים ואספקה מוגבלת של חומרים מזינים וחמצן, שריר הלב סובל משינויים מטבוליים חמורים, פוגע בתפקוד הסיסטולי של קרדיומיוציטים (CMs), ומוביל למוות CM3. גישות רבות במחקר לב וכלי דם נחקרו כדי לתקן פגיעה בלב ולשחזר את תפקוד הלב הפגום4. תכנות לב ישיר התגלה כאסטרטגיה מבטיחה אחת לתיקון הלב הפגוע ולשיקום תפקודו5,6. על ידי הצגת Mef2c, Gata4, Tbx5 (MGT), פיברובלסטים יכולים להיות מתוכנתים מחדש iCMs במבחנה ו in vivo, ו- iCMs אלה יכולים להפחית את אזור הצלקת ולשפר את תפקוד הלב7,8.

למרות תכנות לב מחדש היא אסטרטגיה מבטיחה לטיפול MI, נותרו מספר אתגרים. ראשית, יעילות התכנות מחדש, הטוהר והאיכות אינם תמיד גבוהים כצפוי. תמריץ MGT יכול להשיג רק 8.4% (cTnT+) או 24.7% (αMHC-GFP+) מסך ה- CFS שיש לתכנת מחדש ל- iCMs במבחנה7, או עד 35% ב- vivo8, מה שמגביל את היישום שלו. אפילו עם גורמים נוספים המושרים במערכת, כגון Hand29 או Akt1/PKB10, יעילות התכנות מחדש עדיין בקושי משביעת רצון לשימוש בסביבה קלינית. לכן, מחקרים נוספים התמקדו בשיפור יעילות התכנות מחדש נדרשים בתחום זה. שנית, שלמות חשמלית ומאפייני התכווצות של iCMs חשובים לשיפור יעיל של תפקוד הלב, אך אלה מאתגרים להערכה. נכון לעכשיו, שיטות הערכה נפוצות בתחום, כולל ציטומטריית זרימה, אימונוציטוכימיה, ו- qPCR של כמה ביטוי גנים של CMs מפתח, מתמקדים כולם בדמיון של iCMs ו- CMs, אך אינם קשורים ישירות למאפיינים התפקודיים של iCMs. יתר על כן, שיטות אלה יש הליכים מסובכים יחסית והם גוזלים זמן רב. בעוד מחקרי תכנות מחדש בדרך כלל כרוכים הקרנה של גורמי תכנות פוטנציאליים המקדמים התבגרות iCMs11, תכנות לב מחדש קורא שיטה מהירה ונוחה המבוססת על פונקציית iCMs.

CMs לפתוח את תעלות יוני סידן מגודר מתח על cytomembrane במהלך כל מחזור התכווצות, מה שמוביל זרם חולף של יון סידן (Ca2+) מהנוזל הבין תאי כדי ציטופלסמה להשתתף התכווצות myofilament. כזה Ca2 + זרם מחזור outflux הוא התכונה הבסיסית של התכווצות שריר הלב ומהווה את הפונקציה הרגילה של CMs12. לכן, שיטה המזהה Ca2+ זרם יכול להיות דרך פוטנציאלית למדוד את הפונקציה של CMs ותאים דמויי CM, כולל iCMs. יתר על כן, עבור iCMs, שיטה כזו מספקת דרך נוספת להעריך את יעילות התכנות מחדש.

אינדיקטורים סידן מקודדים גנטית (GECIs) פותחו בשימוש נרחב כדי להצביע על פעילות התא, במיוחד פוטנציאל פעולה. בדרך כלל, GECIs מורכבים מתחום מחייב Ca2+ כגון calmodulin, ותחום פלואורסצנטי כגון GFP, ו- GCaMP3 הוא תחום עם זיקה גבוהה ועוצמת פלואורסצנטיות. תחום הפלואורסצנטיות של GCaMP3 יופעל כאשר ריכוז הסידן המקומי ישתנה13. במאמר זה, זן עכבר המבטא באופן ספציפי כתב GCaMP3 בתאי Myh6 + מתואר. על ידי הצגת MGT ל- NCFs המבודדים מיילודים של זן זה, ניתן לתכנת מחדש על ידי פלואורסצנטיות, אשר iCMs מתוכנתים מחדש בהצלחה יציגו. זן ושיטה כאלה של העכבר יספקו פלטפורמה חשובה לחקור תכנות לב.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הניסיוניים והמנהגים הקשורים לבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת מישיגן. כל ההליכים הניסיוניים והשיטות הכרוכות בתרבית תאים חייבים להתבצע בקבינט הבטיחות הביולוגית BSL2 בתנאים סטריליים. עבור הנהלים והנהלים הכרוכים בווירוסים, בוצעה ההנחיה לסילוק נאות של תאים שהודבקו, טיפים לצינורות וצינורות כדי למנוע את הסיכון לסכנות סביבתיות ובריאותיות.

1. הקמת Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze /J (המכונה Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3) זן עכבר (איור 1)

  1. הכן Tg (Myh6-cre)1Jmk / J זן עכבר (מלאי מעבדת ג'קסון 009074, המכונה Myh6-Cre) ו GT (ROSA)26Sortm38 (CAG-GCaMP3)Hze / J זן עכבר (מלאי מעבדת ג'קסון 014538, המכונה Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3), בהתאמה.
  2. לגדל כל זן עד 8 שבועות כדי להשיג מבוגר Myh6-Cre ו Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 עכברים, בהתאמה.
  3. הכלאתי את עכברי Myh6-Cre הבוגרים ואת עכברי רוזה-פלוקס-סטופ-פלוקס-GCaMP3.
    הערה: להגדיר Myh6-Cre זכר / Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 נקבה או להיפך. אין הבדל משמעותי בין צאצאיהם. בדרך כלל, העכברים הנקבות יולדו 8-10 גורים 19-21 ימים לאחר הכלאה.

2. בידוד ובחירה של לבבות עכברי Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3.

  1. להשיג גורים P0-P2. ודא כי 8-10 גורים נוכחים כדי לבודד 10 מיליון NCFs עם פרוטוקול זה.
  2. מאוד מרדים את הגורים על ידי היפותרמיה. מניחים את הגורים בכפפת לטקס וטובלים עד הצוואר בקרח ומים כתושים (2°C - 3°C).
  3. לחטא בקצרה את הגורים עם 75% אתנול.
  4. להקריב את הגורים על ידי עריפת ראש עם מספריים סטריליים.
  5. לעשות נתק אופקי ליד הלב, לסחוט את הלב, ולאחר מכן לבודד אותו על ידי הפרדה בשורש של בריון עם מספריים.
  6. שימו לב שהלב פועם תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ודא את הלבבות עם Myh6-Cre /Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 גנוטיפ מראה Ca2 + שטף המצוין על ידי GCaMP3 עם פעימות לב. הגנוטיפים האחרים אינם מראים פלואורסצנטיות (איור 2, וידאו 1 ווידאו 2).

3. בידוד של פיברובלסטים לב יילודים (NCFs)

הערה: עבור חלק זה, פרוטוקול ממעבדה של ד"ר לי צ'יאן 14 אומץ עם אופטימיזציות קלות כאשר ישים על מחקר זה.

  1. לאחר בידוד של αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3, חותכים אותם לארבעה חלקים המחוברים באופן רופף. לשטוף אותם DPBS קר כקרח בצלחת 6 ס"מ ביסודיות מספר פעמים כדי להגביל את זיהום תאי הדם בתאים המבודדים.
  2. העבר את הלבבות לצינור חרוט 15 מ"ל.
  3. לעכל את הלבבות עם 8 מ"ל של חם 0.25% טריפסין-EDTA ב 37 °C (50 °F) במשך 10 דקות.
  4. השלך את הלנסין supernatant ולהוסיף 5 מ"ל של קולגנאז חם מסוג II (0.5 מ"ג / מ"ל) ב- HBSS.
  5. מערבולת את התערובת ביסודיות, ודגרה ב 37 °C (5 דקות).
  6. לאחר הדגירה, מערבולת ביסודיות ולתת לרקמה הבלתי מעוכלת להתיישב על ידי כוח המשיכה.
  7. לאסוף את supernatant בצינור חרוטי 15 מ"ל עם 5 מ"ל פיברובלסט קר (FB) בינוני (IMDM עם 20% FBS ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין).
  8. חזור על שלבים 3.4-3.7 עבור הרקמה הלא מעוקל 4-5 פעמים.
  9. לאסוף את כל supernatant יחד ולסנן את supernatant עם מסננת 40 מיקרומטר.
  10. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F) להשליך את supernatant.
  11. תגדיל את התאים ב-10 מ"ל של מאגר מיון תאים המופעל באמצעות מגנטית (מאגר MACS; 1x PBS עם 2 מ"מ EDTA ו-0.5% BSA).
  12. קבע את מספר התא בר קיימא על-ידי כתמים כחולים.
    1. קח 10 μL של תאים מתוך 10 מ"ל של השעיית תא בשלב 3.11.
    2. מערבבים עם 10 μL של 0.4% פתרון כחול טריפן ודגרה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
    3. מוסיפים את התערובת להמוציטומטר וקובעים את מספר התא בר קיימא. התאים המתים מוכתמים בכחול, בעוד התאים קיימא אינם נגועים.
  13. צנטריפוגות התאים ב 200 x g במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F) ולהשליך את supernatant.
  14. Resuspend התאים עם 10 μL של Thy1.2 microbeads ב 90 μL של חיץ MACS צונן עבור פחות מ -10 מיליון תאים קיימא. הוסף יותר חרוזים באופן פרופורציונלי אם יש יותר מ -10 מיליון תאים קיימא. פיפטה את התערובת היטב ודגרה ב 4 °C (50 °F) במשך 30-60 דקות.
  15. הוסף 10 מ"ל של מאגר MACS ומערבב היטב.
  16. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות, להשליך את supernatant.
  17. חזור על שלבים 3.15-3.16 פעם אחת.
  18. resuspend התאים והחרוזים עם 2 מ"ל של מאגר MACS.
  19. הגדר מפריד MACS בשכונה. הוסף עמודת LS למפריד ושויב את העמודה עם מאגר MACS של 3 מ"ל.
  20. כאשר העמודה LS מכוילת, העביר את התאים דרך העמודה.
  21. לשטוף את העמודה LS עם 2 מ"ל של מאגר MACS שלוש פעמים.
  22. קח את העמודה מהמפריד, לחמוק ממנו עם 2 מ"ל של חיץ MACS שלוש פעמים, ולאחר מכן לאסוף את ההתחמקות לצינור 50 מ"ל.
  23. צנטריפוגה ב 200 x g במשך 5 דקות ולהשליך את supernatant.
  24. resuspend התאים עם 5 מ"ל של מדיה FB.
  25. קבע את מספר התא עם המוצ'ימומטר.
  26. לדלל את התאים עם מדיה FB לזרוע את התאים לכלים או צלחות כרצונו. ודא כי צפיפות זריעת התאים היא סביב 2-2.5 x 104 תאים / cm2 (לייעל את הצפיפות בהתבסס על ניסויים בודדים). ודאו שלפיברובלסטים המצורפים יש צורה אליפטית לעגולה ביום השני לאחר הזריעה (איור 3).

4. ייצור של רטרווירוס קידוד וקטור MGT פוליציסטרוני לתכנות מחדש של הלב

  1. לשמור על Plat-E עם מדיה תרבות Plat-E (DMEM בתוספת עם 10% FBS, 1 מיקרוגרם / מ"ל של puromycin ו 10 מיקרוגרם / מ"ל של blasticidin) ב 37 °C עם 5% CO2.
  2. ביום 1, לפצל Plat-E לצלחת 6-באר בערך 4-5 x 105 תאים / צפיפות באר.
  3. ביום 2, Plat-E בדרך כלל מגיע 80% השפעה. לבצע טרנסג'נדר את התאים בהליכים הבאים. כוונן את עוצמת הקול והכמות של כל רכיב שנמצא כאן בהתבסס על כל באר בלוח של 6 בארות.
    1. לדלל 2 מיקרוגרם של pMX-puro-MGT ביטוי רטרו-וירוס polycistronic ביטוי plasmid וקטור (Addgene 111809) כדי 500 ng/ μL עם מאגר TE.
    2. הכן את תערובת transfection על ידי ערבוב 10 μL של ליפופקטמין עם 150 μL של בינוני סרום מופחת. בזהירות pipette לערבב היטב לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. היזהרו כדי למנוע בועות בעת צנרת.
    3. בינתיים, להכין תערובת plasmid על ידי ערבוב plasmid עם 150 μL של בינוני סרום מופחת. בזהירות pipette לערבב היטב לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. היזהרו כדי למנוע בועות בעת צנרת.
    4. מערבבים בזהירות את שתי התערובות ודגר בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. הפתרון עשוי להיראות מעונן.
    5. מוסיפים את התערובת טיפה אחר טיפה לתאים כדי להיות transfected.
    6. לדגור על התאים ב 37 °C (50 °F) לילה.
  4. ביום 3, לשנות את המדיום למדיום תרבית תאים מלאה טרי חסר puromycin ו blasticidin.
  5. ביום 4, 48 שעות לאחר ההדבקה, לאסוף את supernatant המכיל רטרווירוס ולאחסן אותו ב 4 °C (70 °F).
  6. ביום 5, 72 שעות לאחר ההדבקה, לאסוף את supernatant המכיל רטרווירוס.
  7. סנן הן את 48 h ו 72 h supernatant עם מסנן 0.45 מיקרומטר, לזרז לילה ב 4 °C (7 °F) על ידי הוספת נפח 1/5 של 40% פולי (אתילן גליקול) (PEG) פתרון כדי להפוך את הריכוז הסופי של 8% PEG.
  8. צנטריפוגה ב 4,000 x g במשך 30 דקות כדי לזרז את הנגיף.
    הערה: PEG8000-וירוס יוצר משקעים לבנים קטנים.
  9. Resuspend הווירוס עם iCM בינוני המכיל 8 מיקרוגרם / mL polybrene כרצונו. השתמש בוירוס הרטרו מיד.

5. תכנות מחדש של NCFs ל- iCMs עם זיהום רטרווירוס קידוד MGT

  1. לגדול או לעבור NCFs לפני זיהום וירוס.
    הערה: בדרך כלל, NCF ניתן לעבור פעמיים.
  2. ביום 0, זרע NCF לצפיפות סביב 1-2 x 104 תאים / cm2 במצב בינוני FB.
  3. ביום הראשון, החליפו את המדיום התרבותי במדיום המכיל וירוסים לכל אחד מהם, לפי הצורך. השתמש בווירוס מבאר אחת Plat-E בצלחת 6-באר כדי להדביק שתי בארות בצלחת 24-well. Titer הווירוס כדי לקבוע את ריכוז הווירוס האופטימלי.
    הערה: וירוסים המכילים גורמי תכנות מחדש אחרים של עניין ניתן להציג יחד עם רטרווירוס MGT.
  4. דגירה ב 37 °C (50 °F) לילה.
  5. ביום 2, 24 שעות לאחר ההדבקה בנגיף, החליפו את המדיום המכיל וירוס למדיום iCM רגיל.
  6. כדי לפקח על ביטוי GCaMP3, צלחת זה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטיות הפוכה. תחת 10x בערוץ GFP, לצפות הפלואורסצנטיות הבסיסית הקלה GCaMP3 של חלק מהתאים כבר ביום 5.
  7. החלף את המדיום כל 2-3 ימים במהלך התככנות מחדש. במידת הצורך, לבצע בחירה חיובית עבור תאים נגועים רטרווירוס MGT על ידי הוספת 2 מיקרוגרם / מ"ל של puromycin למדיום התרבות במשך 3 ימים ושמירה על זה ב 1 מיקרוגרם / מ"ל.
    הערה: הצג כימיקלים מעניינים (למשל, IGF-1, MM589, A83-01 ו- PTC-209, המכונה IMAP כפי שדיווחנו בעבר15) יחד עם שינוי בינוני.
  8. לאחר 14 ימים של זיהום, להחליף את המדיום עם B27 בינוני כדי לגרום עוד יותר iCM התבגרות.

6. הערכה של התבגרות פונקציונלית iCM ויעילות תכנות מחדש על ידי Ca2 + שטף

הערה: הוסף 1 μM isoproterenol לתאים להיות מוערך לפני ההערכה, במידת הצורך.

  1. להעריך את שטף Ca2 + עם מיקרוסקופ פלואורסצנטיות הפוכה בטמפרטורת החדר.
  2. בערוץ GFP, צפה בתאי GCaMP3+ תחת המטרה 10x. ודא שהוא מציג מכות תאים ספונטניות בערוץ השדה הבהיר.
  3. בחר באופן אקראי שלושה שדות מתחת ל- 20x ורשום את שטף Ca2+ של ה- iCMs למשך 3 דקות עבור כל שדה.
    הערה: כאן, השטף Ca2+ סונכרן עם מכות תאים ספונטניות (איור 4, איור 5, ווידאו 3, וידאו 4, וידאו 5, וידאו 6, וידאו 7, וידאו 8).
  4. לכמת באופן ידני את התאים עם שטף Ca2+ .

7. ניתוח סטטיסטי ומצגת נתונים

  1. לנתח את ההבדלים בין קבוצות ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA) ולבצע את התלמיד-ניומן-Keuls בדיקות השוואה מרובות.
    הערה: התוצאות הן ממוצעות ± S.E. עם p < 0.05 נחשב משמעותי מבחינה סטטיסטית. כל ניסוי בוצע לפחות שלוש פעמים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

זרימת העבודה הניסיונית ליצירת זן העכבר Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 ומבנה הגנים של העכברים מהונדסים מוצגת באיור 1. בעוד זן העכבר נקבע, ליבם של הגורים היה מבודד ונצפה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך כדי לאשר את הגנוטיפ. לבבות עם גנוטיפ נכון מראים ש-Ca2+ שטף מסונכרן עם פעימות, דמיינו אותו פלואורסצנטיות GCaMP3, בעוד שלא נצפתה פלואורסצנטיות בלב שליטה (איור 2, וידאו 1 ווידאו 2). NCFs מבודדים יתחברו לבאר תוך 2 שעו...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הערכת פונקציית iCMs נחוצה לשדה תכנות מחדש של הלב. בכתב יד זה, הפרוטוקול מתאר Tg(Myh6-cre)1Jmk / J / GT(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze / J זן עכברים שהוקם, כיצד להשתמש ב- NCFs המבודדים מעכברי היילוד בזן זה לתכנות מחדש ל- iCMs, והערכת פונקציית iCMs על ידי שטף Ca2 + . זוהי שיטת de novo להערכת התבגרות פונקציונלית של iCMs.

מספר שלבים קריטיים חשובים לתכנות מחדש והערכה מוצלחים בשיטה זו. ראשית, NCFs צריך להיות מוכן טרי ובריא לאחר הבידוד. הליך מהיר של בידוד לב וחיתוך הוא ח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

אנו מעריכים את מאמציו של ליאו גנובסקי בעריכת הטקסט האנגלי של כתב יד זה. איור 1 נוצר עם BioRender.com. מחקר זה נתמך על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) של ארצות הברית (1R01HL109054) מענק לד"ר וואנג.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםתרמו פישר מדעי14-959-70C
50 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטייםתרמו פישר סיינטיפיק14-959-49A
6 צלחות תרבית תאיםבאר אלקלי מדעיTP9006
A83-01Stemgent04– 0014
All-in-One מיקרוסקופ פלואורסצנטיKeyenceBZ-X800Eמיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך
B-27 תוסף (50X), ללא סרוםThermo Fisher Scientific17504044
Blasticidin S HCl (10 מ"ג/מ"ל)Thermo Fisher ScientificA1113903
בקר סרום אלבומין (BSA) אבקה ללא DNase ופרוטאזThermo Fisher Scientific
CD90.2 מיקרו-חרוזים, עכברMiltenyi Biotec130-049-101Thy1.2 מיקרו-חרוזים
קולגנאז, סוג 2תרמו פישרNC9693955
מדעי תא ספירהתרמו פישר סיינטיפיק02-671-51Bהמוציטומטר
DMEM, גלוקוז גבוה, ללא גלוטמיןתרמו פישר מדעי11960069
DPBS, סידן, מגנזיוםThermo Fisher Scientific14-040-133
אתנול, 200 הוכחה (100%)Thermo Fisher Scientific04-355-451
חומצה אתילנדיאמין טטראצטית (מאושר ACS)Thermo Fisher ScientificE478-500
סרום בקרעוברי קורנינג35-010-CV
HBSS, סידן, מגנזיום, ללא פנול אדוםתרמו פישר 14025092
מדעי IMDM מדיהתרמו פישר סיינטיפיק12440053
IX73 מיקרוסקופ הפוךאולימפוסIX73P2Fמיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך
ליפופקטמין 2000 מגיב טרנספקציהתרמו פישר מדעי11-668-019
עמודות LSMiltenyi Biotec130-042-401
בינוני 199Earle's SaltsThermo Fisher Scientific11150059
MidiMACS מפריד וערכות התחלהMiltenyi Biotec130-042-302
Millex-HV יחידת מסנן מזרק, 0.45 , ומיקרו; m, PVDF, 33  MMMillipore SigmaSLHV033RB
MM589שהושג מד"ר שאומנג וואנג s מעבדה באוניברסיטת מישיגן
Opti-MEM I סרום מופחת בינוניתרמו פישר סיינטיפיק31-985-070
PBS, pH 7.4תרמו פישר סיינטיפיק10-010-049
פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
פלטינום-E (Plat-E) אריזה רטרו-ויראלית תא קוnbsp; BiolabsRV-101
pMx-puro-MGTAddgene111809
פולי (אתילן גליקול)Millipore SigmaP5413-1KGPEG8000
זיהום פוליברן / מגיב טרנספקציהMillipore SigmaTR-1003-G
PTC-209SigmaSML1143– 5 מ"ג
Puromycin DihydrochlorideThermo Fisher ScientificA1113803
רקומביננטי אנושי IGF-IPeprotech100-11
RPMI 1640בינוני תרמו פישר 11875093
ST 16 סדרת צנטריפוגותתרמו פישר סיינטיפיק75-004-381
מסנני תאים סטרילייםתרמו פישר סיינטיפיק22-363-54740 ומיקרו; m מסננת
כלי תרבית רקמות מטופלות פני השטחתרמו פישר מדעיFB012921
TE Bufferתרמו פישר12090015
תמיסה כחולה טריפאןMillipore SigmaT8154
טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדוםתרמו פישר מדעי25300054
מערבולת מערבולת מיקסרתרמו פישר סיינטיפיק
BP9706100, מעוקר גמא תא&02215365

מקורות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vos, T., et al. Global burden of 369 diseases and injuries in 204 countries and territories, 1990-2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. The Lancet. 396 (10258), 1204-1222 (2020).
  2. Virani, S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the american heart association. Circulation. 143 (8), e254-e743 (2021).
  3. Frangogiannis, N. G. Pathophysiology of myocardial infarction. Comprehensive Physiology. 5 (4), 1841-1875 (2015).
  4. Tian, S., et al. HDAC inhibitor valproic acid protects heart function through Foxm1 pathway after acute myocardial infarction. EBioMedicine. 39, 83-94 (2019).
  5. Mohamed, T. M., et al. Chemical enhancement of in vitro and in vivo direct cardiac reprogramming. Circulation. 135 (10), 978-995 (2017).
  6. Liu, L., Lei, I., Wang, Z. Improving cardiac reprogramming for heart regeneration. Current Opinion in Organ Transplantation. 21 (6), 588-594 (2016).
  7. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  8. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  11. Liu, L., et al. Targeting Mll1 H3K4 methyltransferase activity to guide cardiac lineage specific reprogramming of fibroblasts. Cell Discovery. 2, 16036(2016).
  12. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  13. Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
  14. Wang, L., et al. Improved Generation of Induced Cardiomyocytes Using a Polycistronic Construct Expressing Optimal Ratio of Gata4, Mef2c and Tbx5. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (105), e53426(2015).
  15. Guo, Y., et al. Chemical suppression of specific C-C chemokine signaling pathways enhances cardiac reprogramming. Journal of Biological Chemistry. 294 (23), 9134-9146 (2019).
  16. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
  17. Stevenson, A. J., et al. Multiscale imaging of basal cell dynamics in the functionally mature mammary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (43), 26822-26832 (2020).
  18. Ikeda, K., et al. UCP1-independent signaling involving SERCA2b-mediated calcium cycling regulates beige fat thermogenesis and systemic glucose homeostasis. Nature Medicine. 23 (12), 1454-1465 (2017).
  19. Golebiewska, U., Scarlata, S. Measuring fast calcium fluxes in cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (57), e3505(2011).
  20. Eng, G., et al. Autonomous beating rate adaptation in human stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Communications. 7, 10312(2016).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

מאמרים קשורים