בלוטות הרוק הוצעו כאתר יעד לרקמות לטיפול גנטי, במיוחד בתחום החיסון על ידי העברת גנים. אנו מדגימים אספקת גנים במודל פרימטים לא אנושיים המשתמש בעירוי פרוטידים מדרדר.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
עירוי בלוטת פרוטידים מדרדר דרך צינור סטנסן בפרימט לא אנושי לאספקת גנים וקטורית
במאמר זה
סיכום
תקציר
בלוטות הרוק הן יעד רקמות אטרקטיבי לטיפול גנטי עם תוצאות מבטיחות כבר מוביל לניסויים בבני אדם. הם מסוגלים מטבעם להפריש חלבונים למחזור הדם והם נגישים בקלות, מה שהופך אותם לאתרי רקמות מעולים פוטנציאליים לייצור הורמונים חלופיים או חיסון על ידי העברת גנים. שיטות מוצעות להעברת גנים כוללות הזרקה עורית ועירוי מדרדר דרך צינורות רוק. אנו מדגימים כיצד לבצע עירוי בלוטת הרוק מדרדר (RSGI) בפרימטים שאינם אנושיים. אנו מתארים את ציוני הדרך האנטומיים החשובים כולל זיהוי של הפפילה הפרוטידית, שיטה אטארומטית של שינון ואיטום צינור סטנסן תוך שימוש בכלים דנטליים בסיסיים, צינורות פוליאתילן ו cyanoacrylate, ואת השיעור המתאים של עירוי. אמנם זוהי שיטת המסירה הפחות טראומטית, אך השיטה עדיין מוגבלת על ידי הנפח המסוגלת להימסר (<0.5 מ"ל) והפוטנציאל לטראומה לצינור ובבלוטות. אנו מדגימים באמצעות פלואורוסקופיה כי אינפוזאט יכול להיות מועבר באופן מלא לתוך הבלוטה, ולהדגים עוד יותר על ידי אימונוהיסטוכימיה את transduction של וקטור טיפוסי ביטוי של הגן נמסר.
מבוא
בעוד בלוטות הרוק ידועים בייצור האקסוקריני שלהם של רוק, חוקרים מזה זמן רב זיהו את יכולתם להפריש חלבונים ישירות למחזור הדם 1 , מהשהופךאותם למטרה פוטנציאלית לטיפול גנטי לניהול מערכתי, כגון הורמונים חלופיים או ייצור נוגדנים. למעשה, בלוטות הרוק מציעות מספר יתרונות על פני מטרות רקמות אחרות, כגון היכולת הטבועה לייצר חלבונים להפרשה (חסר שרירי רכוש), אנקפסולציה כבדה שיכולה להגביל דיפוזיה וקטורית, ורקמות מובחנות היטב המספקות יציבות לווקטורים שאינם משתלבים. יתר על כן, במקרה של אירוע לוואי חמור, בלוטות הרוק אינן קריטיות לחיים וניתן להסירן בניתוח. אמנם לא אינטואיטיבי מיד, בלוטות פרוטידים נגישים גם מהפה דרך צינור ההפרשה הראשי שלהם, צינור2של סטנסן .
בהתחשב ביתרונות של רקמת הרוק לטיפול גנטי, יש עניין גובר לחקור את יעד הרקמה הזה. מחקרים רבים כבר בוצעו במודלים של מכרסמים, כלבים ופרימטים לא אנושיים ולפחות ניסוי קליני אחד בבני אדם נמצא בעיצומו3,4,5. כדי להמשיך לחקור ולפתח את התועלת של יעד רקמות זה למטרות ריפוי גנטי, יותר מחקרים פרימטים שאינם אנושיים יצטרכו להתבצע. מאמר זה מתאר שיטה לגישה לבלוטות הפרוטידים דרך צינור סטנסן כדי לספק גן וקטורי להחלפת מודל הפרימטים הלא אנושי. כדי להדגים באופן ניכר את המסירה של infusate ואת האנטומיה של הצינור כפי שהוא נכנס בלוטה, פלואורוסקופיה באמצעות radiocontrast בוצע. כדי להדגים טרנסולציה מוצלחת של וקטור, נעשה שימוש בגן egfp וקטורי של אדנווירוס 5 (Ad5). Ad5 הוא וקטור מתואר היטב המסוגל לבצע חילוף של רקמת רוק. למרות שזה אימונוגני מדי לשימוש קליני אולטימטיבי, וקטור Ad5 נבחר למחקר הדגמה זה כדי להבטיח טרנסולמה יעילה. הערכת ייצור חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) היא שיטה המתוארת היטב כדי להדגים שעתוק ותרגום מוצלחים של גן וקטורי לאחר התמרה ונעשה כאן.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים בוצעו בקמפוס קלרקסון של בית הספר לרפואה ווייק פורסט ללימודי בעלי חיים. הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) התייעצה משיקולים אתיים ופרטי ההליכים הוגשו לעיון. Wake Forest IACUC אישר את פרוטוקול המחקר שלנו וכל ההליכים נעשו תחת פרוטוקול שאושר על ידי IACUC #A17-147.
1. הכנת מכשיר העירוי
- חותכים את גודל 10 צינור פוליאתילן (PET10) לאורכים של 25 ס"מ באמצעות זוג מספריים.
- סמן PET10 ב 1 ס"מ ו 2 ס"מ מקצה אחד באמצעות סמן שחור.
- מילוי מראש 0.5 מ"ל של פתרון Ad5-EGFP (109 חלקיקים ויראליים / מ"ל) לתוך מזרק 1 מ"ל (שחפת).
- החלק קצה לא מסומן של צינור PET10 מעל מחט 29-31 G מחובר מזרק. בדרך כלל קל יותר לבצע משימה זו תחת הגדלה.
- להחדיר את הפתרון לתוך PET10 עד הצינור מלא לחלוטין (טיפה גלויה בקצה חופשי).
- השתמש PPE סטנדרטי מלא, כולל סקראבס כירורגי, שמלה עם שרוולים ארוכים, כפפות בלתי חדירות, מסכה כירורגית, מגן פנים, מצנפת שיער וכיסויי נעליים.
2. הכנת החיה
הערה: מקוק Cynomolgus שימש להדגמת הווידאו. האנטומיה של פרימטים לא אנושיים ואנושיים אחרים דומה מאוד, והפרוטוקול צריך להיות מתורגם למינים אחרים.
- הזריקו תת עורית 0.05 מ"ג/ק"ג אטרופין 15 דקות לפני ההליך כדי למזער הפרשות רוק ולייעל את ההפצה והשימור של אינפוסאט.
- ספק הרדמה באמצעות מזרקי 5 מ"ל עם קטמין תוך שרירי / midazolam (10-15 מ"ג / קילוגרם של קטמין ו 0.01-0.05 מ"ג / קילוגרם של midazolam). אשר הרדמה נאותה כאשר החיה מסוממת הופכת מחוסרת הכרה ואינה מסוגלת להגיב לגירויים.
3. ביצוע ההליך
- השתמש במשחזרים אוראליים כדי להכין את הפה הפתוח.
- מניחים את משטח הגומי של קצה אחד של המפסק על החיך הקשה שמאחורי השיניים העליונות בצד הפה מול הבלוטה כי יהיה חדור. מניחים את משטח הגומי של הקצה השני על הכלב התחתון באותו צד כמו המפסק העליון. אפשר בעדינות לפעולת האביב של המפסק להתרחב ולפתוח את הפה.
- זהה את הפפילה הפרוטידית, פתח צינור סטנסן, על הלחי האחורית, בסמוך לטוחנת העליונההשנייה. זה הוא הדמיה הטובה ביותר באמצעות לולאות שיניים להגדלה.
- מרחיבים בעדינות את הפפילה הפרוטידית בנקודה של מרחיב החרוט. עדיף למקם את הנקודה של המפרש למרכז או הפתיחה של הפפילה ולאחר מכן בעדינות לסובב אותו קדימה ואחורה. הנקודה צריכה לאט להיכנס הפפילה ולהרחיב אותו על פני כ 20 - 30 s של סיבוב עדין.
- הכנס את צינורות PET10 לתוך פפילה פרוטידית המוחלפת. זה מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי החזקת הקצה המסומן של צינור PET10 עם פינצטה כ 0.5 ס"מ מן הקצה דיסטלי בעדינות החדרת קצה הצינור לתוך הפפילה המוגברת.
- לקדם בעדינות את הצינור, אשר לעתים קרובות מקל על ידי תנועות סיבוב קטנות כדי לעזור להחליק את הצינור, ואחריו הסתגלות מחדש של פינצטה 0.5 ס"מ קרוב לאחיזה הקודמת. חוזרים על הפעולה עד שסימן 2 ס"מ מגיע לפפילה הפרוטידית.
- החל ציאנואקרילט על הלחי סביב הפפילה והצינור המוחדר ולחכות שהוא יתייבש (לא נרשמה כמות ספציפית, רק מספיק כדי לאטום את הכניסה של פפילה צינור של סטנסן). זה בדרך כלל לוקח פחות מדקה ומסייע לאטום את הפפילה הפרוטידים ולהפחית שפיכה של infusate בחזרה בחלל הפה.
- לדחוף לאט את תוכן המזרק מעל 5 דקות בקצב של 100 μL / min. קצב עירוי איטי זה ממזער את הסיכון לפגיעה בצינור עקב עלייה פתאומית בלחץ תוך-צינורי.
- השאירו PET10 במקום לפחות 5 דקות לאחר עירוי הושלם. שמור את הצינור אטום ולאפשר infusate להישאר בבלוטה פרוטיד.
- הסר PET10 עם אחיזה עדינה. הציאנואקרילט ישתחרר עם הצינור.
- חזור על שלבים 3.2 עד 3.8 בצד הנגדי.
- לשחרר לאט מפסקים אוראלי לאחר שני פרוטידים כבר חדורים ושני צינורות PET10 הוסרו.
הערה: כל ההליך עבור שני הצדדים צריך לקחת פחות מ 30 דקות.
4. טיפול פוסט-פרוצדורלי
- לאחר עירוי הושלם ואת הצינור של סטנסן decannulated, להתבונן בבעלי חיים עד אפקט הרדמה פג (בדרך כלל בין 20-30 דקות לאחר ההליך).
- הצע לבעלי החיים משקאות ולאחר מכן מזון לאחר שהם ערים לחלוטין ולחדש את הטיפול השגרתי.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הליך מוצלח, התמרה ותעתיק
איור 1 מציג את הפאפילה הפרוטידית הצמודה לאוחנתהשנייה על הלחי העליונה האחורית. התמונה מציגה גם את המיקום הנכון של סד הפה, קצה גומי אחד על החיך הקשה ואת קצה הגומי השני על הכלב ipsilateral. איור 2 מציג תמונה שצולמה לאחר שינון מוצלח של הפפילה הפרוטידית בסימן 2 ס"מ ב-PET10. איור 3 מציג תמונה פלואורוסקופית ברגע של עירוי רדיו-קונטרסט המדגים הסתעפות של הפתרון דרך צינור סטנסן ולתוך בלוט...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
כאן אנו מתארים פרוטוקול של עירוי מדרדר לתוך בלוטת הפרוטיד דרך צינור סטנסן. המתודולוגיה המתוארת מציעה הדרכה שיכולה לשמש חוקרים החוקרים את התועלת של רקמת הרוק כאתר לטיפול גנטי ויישומים אחרים.
ישנם מספר שלבים קריטיים כדי להבטיח את הצלחת ההליך. בראש ובראשונה, יש להשלים בעדינות את כל השלבים הפרוצדורליים. חיבוק חזק של הפה יכול לגרום לתת-חלוקה של הלסת התחתונה. קנון כוחני של פפילה פרוטידית או עירוי מהיר של הפתרון לתוך צינור של סטנסן עלול לגרום דמעות דביקות חריפות או היצרות דביקה כרונית.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין מה לחשוף.
תודות
המחברים רוצים להודות למר קגני ג'נטרי על תמיכתו האודיו-קולית בצילומי ההליך. אנחנו גם רוצים להכיר במרכז הרפואי הפנר VA לתמיכה אקדמית במרדף אחר פרויקט זה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 500 ומיקרו; מזרקי L U100 עם מחטים בגודל 30 | Becton Dickinson | 328466 | מחט קבועה להפחתת פסולת |
| דבק (למשל, Ethicon Dermabond) | דבק ציאנואקרילט שונים לאיטום ושמירה על הצינור בצינור במהלך העירוי. | ||
| תמיסת הזרקת אטרופין | פטרסון וטרינרי | 07 869-6061 | אטרופין inj. 0.54 מ"ג/מ"ל |
| BD מזרקי אינסולין עדינים במיוחד 30G | Walmart | N/A | ניתן להפעלה בגדלים של 0.5 מ"ל ו-1.0 מ"ל. |
| ציאנואקרילט (דבק רפואי) | Ethicon | DNX12 | Dermabond דבק עור מקומי |
| לולאות שיניים עם | אור אמזון (DDP) | B012M3IV80 | משמש לשיפור ההדמיה של פפילת הצינור של סטנסן |
| מרחיב דמעות לתינוקות | Surgipro | SPOI-137 | |
| תמיסת הזרקת קטמין | פטרסון וטרינרי | 07-803-6637 | Ketaset inj. 100 מ"ג/מ"ל |
| מרחיב דמעות | Surgipro | SPOI-132 | משמש לחיוג צינור הסטנסן. |
| תמיסת הזרקה של Midazolam | פטרסון וטרינרי | 07 890-6698 | Midazolam inj. 5mg/mL |
| זוג מספריים | אמזון (DDP) | N / A | משמש לחיתוך צינור PET10 |
| צינורות פוליאתילן (PE-10) | Scientific Comodities, Inc | BB31695-PE/1 | צינורות המחברים את מזרק 30G ומוכנסים לתעלה. |
| Q-tips | Walmart | N/A | משמש למריחת ציאנואקרילט על הלחי |
| צינור פוליאתילן בגודל 10 (PET 10) | Scientific Commodities | BB31695-PE/1 | צינורות פוליאתילן בצפיפות נמוכה |
| פותחן פה של בעלי חיים קטנים | אמזון (DDP) | B01F3LVJXC משמש לשמירה על הפה של החיה פתוח. | |
| פינצטה | אמזון (DDP) | N/A | משמש להחדרת צינור PET10 לצינור של סטנסון |
| אבץ כלוריד | סיגמא-אולדריץ' | 7646-86-7 | כלול ב-DNA פלסמיד מחדיר |
מקורות
- Isenman, L., Liebow, C., Rothman, S. The secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. The American Journal of Physiology. 276, 223-232 (1999).
- Perez, P., et al. Salivary epithelial cells: An unassuming target site for gene therapeutics. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42, 773-777 (2010).
- Kochel, T. J., et al. A dengue virus serotype-1 DNA vaccine induces virus neutralizing antibodies and provides protection from viral challenge in Aotus monkeys. Vaccine. 18, 3166-3173 (2000).
- Ponzio, T. A., Sanders, J. W. The salivary gland as a target for enhancing immunization response. Tropical Diseases, Travel Medicine and Vaccines. 3, 4(2017).
- Baum, B. J., et al. Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 19403-19407 (2012).
- Voutetakis, A., et al. Sorting of Transgenic Secretory Proteins in Rhesus Macaque Parotid Glands After Adenovirus-Mediated Gene Transfer. Human Gene Therapy. 19, 1401-1405 (2008).
- Niedzinski, E. J., et al. Enhanced systemic transgene expression after nonviral salivary gland transfection using a novel endonuclease inhibitor/DNA formulation. Gene Therapy. 10, 2133-2138 (2003).
- Niedzinski, E. J., et al. Zinc Enhancement of Nonviral Salivary Gland Transfection. Molecular Therapy. 7, 396-400 (2003).
- Samuni, Y., Baum, B. J. Gene delivery in salivary glands: From the bench to the clinic. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. , (2011).
- Voutetakis, A., et al. Adeno-Associated Virus Serotype 2-Mediated Gene Transfer to The Parotid Glands of Nonhuman Primates. Human Gene Therapy. 18, 142-150 (2007).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
