הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פלטפורמה "תוצרת בית" משתלמת ויעילה למחקרי התנהגות של דרוזופילה , ופרוטוקול נלווה לרספירומטריה מיטוכונדריאלית של זחלים

1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62669

⸱

24 בספטמבר 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Tecnologia, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Biomedicina, Universidade do Oeste Paulista

במאמר זה

סיכום

אנו מספקים פרוטוקולים לכל מי שיש לו מוח של "תרבות יוצרים" להתחיל לבנות מעבדת זבוב לניתוח כמותי של מספר עצום של פרמטרים התנהגותיים בדרוזופילה מלנוגסטר, על ידי הדפסת תלת מימד של רבים מחלקי הציוד הדרושים. אנו מתארים גם פרוטוקול רספירומטריה ברזולוציה גבוהה המשתמש בזחלים כדי לשלב נתוני חילוף חומרים התנהגותי ומיטוכונדריאלי.

תקציר

התועלת של דרוזופילה כאורגניזם מודל לחקר מחלות, התנהגויות וביולוגיה בסיסית של בני אדם אינה מוטלת בספק. למרות שהוא מעשי, מחקר הדרוזופילה חסר פופולריות במדינות מתפתחות, אולי בשל הרעיון המוטעה שהקמת מעבדה וביצוע ניסויים רלוונטיים עם חרקים זעירים כאלה היא קשה ודורשת מכשירים יקרים ומיוחדים. כאן, אנו מתארים כיצד לבנות מעבדת זבוב במחיר סביר כדי לנתח כמותית מספר עצום של פרמטרים התנהגותיים ב-D. melanogaster, על ידי הדפסת תלת-ממד של רבים מחלקי הציוד הדרושים. אנו מספקים פרוטוקולים לבניית מדפי בקבוקונים פנימיים, זירות חיזור, מכשירים לבדיקות תנועה וכו', שישמשו לתחזוקה כללית של זבובים ולביצוע ניסויים התנהגותיים באמצעות זבובים וזחלים בוגרים. אנו מספקים גם פרוטוקולים כיצד להשתמש במערכות מתוחכמות יותר, כגון אוקסיגרף ברזולוציה גבוהה, כדי למדוד את צריכת החמצן המיטוכונדריאלית בדגימות זחלים, ומראים את הקשר שלו לשינויים התנהגותיים בזחלים על הביטוי הקסנוטופי של האוקסידאז האלטרנטיבי המיטוכונדריאלי (AOX). AOX מגביר את פעילות הזחלים ואת נשימת הדליפה המיטוכונדריאלית, ומאיץ את ההתפתחות בטמפרטורות נמוכות, מה שעולה בקנה אחד עם תפקידו התרמוגני של האנזים. אנו מקווים שהפרוטוקולים הללו יעניקו השראה לחוקרים, במיוחד ממדינות מתפתחות, להשתמש בדרוזופילה כדי לשלב בקלות נתוני התנהגות ומטבוליזם מיטוכונדריאלי, מה שעשוי להוביל למידע על גנים ו/או תנאים סביבתיים שעשויים גם לווסת את הפיזיולוגיה האנושית ומצבי מחלה.

מבוא

Drosophila melanogaster הוצג לקהילה המדעית כאורגניזם מודל בעל פוטנציאל רב עוצמה לפני יותר מ-100 שנה. פוטנציאל זה אומת היטב במספר תחומים של מדעי הביולוגיה והביו-רפואה, כגון גנטיקה, אבולוציה, ביולוגיה התפתחותית, נוירוביולוגיה וביולוגיה מולקולרית ותאית. כתוצאה מכך, שישה פרסי נובל לרפואה או לפיזיולוגיה הוענקו לעשרה חוקרי דרוזופילה שתרמו באופן משמעותי להבנתנו את התורשה, מוטגנזה, חסינות מולדת, מקצבים צירקדיים, חוש הריח והתפתחות1. ואולי חשוב מכך, D. melanogaster לא הפסיק לספק לנו מודלים חדשים של ביולוגיה ומחלות אנושיות, שכן חיפוש מהיר ב-PubMed מגלה כמעט 600 פרסומים ב-5 השנים האחרונות, תוך שימוש במונח החיפוש "מודל דרוזופילה" (2, נכון לפברואר 2021). בארה"ב, שבה דרוזופילה היא אורגניזם מודל נפוץ בקהילה הביו-רפואית, כ-2.2% מכלל פרסי המחקר R01 שהוענקו על ידי ה-NIH ב-2015 הוקצו לחוקרי דרוזופילה 3. בברזיל, לעומת זאת, חיפוש אחר פרויקטים הממומנים כיום באתר האינטרנט של קרן המחקר של סאו פאולו (FAPESP), סוכנות המימון החשובה ביותר למחקר בכל התחומים המדעיים במדינת סאו פאולו, הראה רק 24 מענקים ומלגות עם דרוזופילה כנושאהמחקר העיקרי 4. בהתחשב בכל 13205 הפרויקטים הממומנים כיום על ידי FAPESP (5, נכון לפברואר 2021), 24 הפרויקטים הללו מייצגים יחס של פחות מ-0.2% מכלל הפרויקטים, הנמוך כמעט פי 12 מזה של ה-NIH. אם נסיר את הפרויקטים הממומנים שמטרתם לחקור את הדרוזופילה מנקודת מבט אקולוגית ו/או אבולוציונית, ונניח שהפרויקטים הנותרים משתמשים באורגניזם זה כמודל להבנת תהליכים ביולוגיים אנושיים בבריאות ובחולי, יחס זה יורד ל-0.1~ מזעזע.

למעשה, יש צורך בחקירה ראויה כדי לחשוף את הסיבות לכך שמחקר הדרוזופילה בברזיל/סאו פאולו לא נראה כה משמעותי במספר הפרויקטים הממומנים . גידול דרוזופילה אינו יקר 6,7,8 והוא פשוט יחסית, שכן בניגוד לחולייתנים, אין צורך באישור מוועדה ביו-אתית לניסויים 9,10. עם זאת, נדרש אישור לעבודה עם קווי זבובים מהונדסים גנטית בברזיל11, מה שמוסיף שכבה של בירוקרטיה הטבועה בכל עבודה הכרוכה באורגניזמים מהונדסים גנטית. עם זאת, סביר להניח שזה לא ימנע מחוקרים מעוניינים ליזום מעבדת זבובים. אנו משערים שמידע שגוי לגבי כוחו של המודל, ולגבי העלויות הגבוהות הצפויות הקשורות להקמת מעבדת זבוב וביצוע ניסויים משמעותיים הם גורמים חשובים בהחלטה זו. באשר לרוב הציוד והאספקה המדעית, יש לייבא לברזיל את המכשירים המתאימים לביצוע תחזוקה כללית של זבובים וניתוחי התנהגות מצפון אמריקה, אירופה ו/או מקומות אחרים, וזהו תהליך יקר וגוזל זמן רב12,13.

לאחרונה צצה אלטרנטיבה לייבוא מכשירים מיוחדים כאשר מדפסות תלת מימד הפכו לזולות ונגישות יותר לכל אדם, כולל חוקרי דרוזופילה במדינות מתפתחות. טכנולוגיית הדפסת התלת מימד נמצאת בשימוש נרחב בעשר השנים האחרונות על ידי חברי "תרבות המייקרים", המבוססת על הרעיון של אספקה עצמית על פני הסתמכות בלעדית על מוצרים המיוצרים על ידי החברה14. רעיון כזה תמיד היה קיים במעבדות מחקר אקדמיות ברחבי העולם, ולכן אין זה מפתיע שמדפסות תלת מימד הפכו לציוד מעבדה סטנדרטי במקומות רבים15,16. במשך מספר שנים, אנו מדפיסים בתלת מימד מדפי בקבוקוני זבובים, זירות הזדווגות, מכשירי טיפוס, בין היתר, בשבריר מהעלות של מקבילות בשם מותג. העלויות המופחתות של הדפסה והרכבה של ציוד מעבדה ביתי מיוצגות באופן קלאסי על ידי ה-FlyPi, שניתן לבנות בפחות מ-100.00 אירו ומשמש כמיקרוסקופ אור ופלואורסצנטי המסוגל להשתמש בגירוי אופטו-תרמוגנטי מתוחכם של דג הזברה, דרוזופילה ונמטודות15. כאן, אנו מספקים סדרה של פרוטוקולים לכל מי שמעוניין להפוך לחוקר דרוזופילה (או להרחיב את מעבדת הזבובים הקיימת שלו) כדי להדפיס בתלת מימד רבים מהחומר הדרוש. על ידי השקעת זמן ופיתוח מעט מומחיות, הקורא יוכל אפילו לייעל את הפרוטוקולים המוצגים כאן כדי להדפיס מכשירים המותאמים טוב יותר לצרכי המחקר שלו.

עם זאת, מעבדת זבובים אינה מקום לציוד "זול" בלבד, במיוחד כאשר מתכוונים לקשר ניתוחים התנהגותיים לתופעות מטבוליות בסיסיות. התענייננו גם בתפקידי המיטוכונדריה באפנון דפוסי התנהגות של דרוזופילה, שכן אברונים אלה אחראים לייצור בתפזורת של ATP ברוב הרקמות באמצעות מספר מסלולים מטבוליים שתוצריהם מתכנסים לזרחון חמצוני (OXPHOS). ניתוח צריכת החמצן המיטוכונדריאלית כדרך להבין את חילוף החומרים המיטוכונדריאלי דורש אוקסיגרף, שהוא ציוד מתוחכם יותר שלמרבה הצער עדיין לא ניתן להדפיס בתלת מימד. מכיוון ש-OXPHOS משפיע כמעט על כל התהליכים התאיים מכיוון שהוא תלוי בסדרה של תגובות חמצון חיזור אקסרגוניות המתרחשות בתא17,18, שיעורי צריכת החמצן המבוססים על המצע החמצוני המסופק למיטוכונדריה עשויים לעזור לחשוף אם תפקוד האברון הוא סיבה או תוצאה של התנהגות מסוימת. לכן, אנו מספקים כאן גם פרוטוקול למדידת צריכת חמצן מיטוכונדריאלי בדגימות זחלים, מכיוון שאנו מבינים שהרוב המכריע של הפרוטוקולים שפורסמו מתמקדים בניתוח דגימות בוגרות. אנו מראים כי שינויים בנשימה המיטוכונדריאלית, הנגרמים על ידי ביטוי טרנסגני של Ciona intestinalis alternative oxidase (AOX), מובילים לניידות מוגברת של הזחלים תחת לחץ קר. סביר להניח שהדבר נובע מתרמוגנזה, מכיוון ש-AOX הוא אוקסידאז מסוף שאינו שואב פרוטונים שיכול לעקוף את הפעילות של קומפלקסים OXPHOS III ו-IV (CIII ו-CIV), מבלי לתרום לפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (ΔΨm) ולייצור ATP 19,20,21. אף חרק, כולל דרוזופילה, או בעל חוליות אינו מחזיק באופן טבעי ב-AOX 21,22,23, אך ביטויו במספר עצום של מערכות מודל 24,25,26,27,28,29 הצליח להראות את הפוטנציאל הטיפולי שלו למצבים של לחץ נשימתי מיטוכונדריאלי כללי, במיוחד כאשר הוא נגרם על ידי CIII ו/או CIV עומס יתר. AOX מעניק עמידות לרמות רעילות של אנטימיצין A24 וציאניד24,25, ומפחית פנוטיפים מגוונים הקשורים לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה 24,25,30,31,32. העובדה שביטוי AOX משנה את התנהגות הזחלים ואת תפקוד המיטוכונדריה מצדיקה מחקרים מעמיקים יותר על תפקידי האנזים הזה בחילוף החומרים והפיזיולוגיה של תאים ורקמות מטזואן33,34.

אנו מקווים שבעזרת מאמר זה נוכל לעזור להעלות את המודעות בקרב הקהילה המדעית של מדינות מתפתחות כמו ברזיל ששימוש בערכת הכלים הגנטית המצוינת שמציג D. melanogaster , בשילוב עם מכשירים ביתיים יעילים ומשתלמים לניתוחים התנהגותיים, יכול לייצר נתוני מחקר בסיסיים מהירים יחסית על תהליכים ביולוגיים מעניינים בעלי השפעה תרגומית משמעותית. תמיכה במחקרים טיפוליים עתידיים במחקר קליני. פיתוח אידיאלים קהילתיים כאלה יועיל מאוד לדרוזופילים, לחוקרים רפואיים ולמדעים הביולוגיים והביו-רפואיים. והכי חשוב, זה יועיל לחברה בכללותה, שכן ניתן יהיה להשתמש במימון ציבורי בצורה תרגומית יותר להבנת מחלות אנושיות ולטיפול בהן.

הפרוטוקולים שאנו מספקים כאן להדפסת תלת מימד המכשירים למעבדת זבוב תוכננו לשימוש עם מדפסת התלת מימד RepRap, המבוססת על דגם Prusa I3 DIY הזמין בגיל35. אנו משתמשים בחוט החומצה הפולילקטית הלבנה (PLA) (SUNLU) בקוטר 1.75 מ"מ כחומר גלם להדפסה, בפלטפורמת Tinkercad36 לעיצוב דגם, ובתוכנת Repetier-Host37 להמרת STL ל-G-Code, צעד הכרחי כדי לספק קואורדינטות למדפסת. נדרשת אופטימיזציה נוספת של הפרוטוקולים אם הקורא רוצה להשתמש בציוד, חומרים ותוכנה חלופיים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

עיצוב דגם 1. 3D

הערה: זרימת העבודה להדפסת תלת-ממד כוללת שלושה שלבים בסיסיים: (1) מידול תלת-ממד; (2) ייבוא הדגם לתוכנת החיתוך; ו-(3) בחירת החוט הנכון, הגדרת המדפסת ולבסוף, הדפסה. פרוטוקול בסיסי לדוגמנות מתלה/מגש בקבוקון זבוב קטן מוצג להלן; מתלה זה מיועד לשימוש עם בקבוקוני זבוב סטנדרטיים, בקוטר של כ-2.5 ס"מ ובגובה של כ-9.8 ס"מ. עבור עיצובי דגמים חדשים, הכלים המסופקים על ידי תוכנת Tinkercad מאפשרים טיפול קל במבנים תלת מימדיים, על ידי יצירת חלקים בצורות, גדלים ועוביים שונים, בהתאם לצרכים האישיים. עבור דרוזופילים היוצאים לראשונה לתחום ההדפסה בתלת מימד, מעקב אחר הפרוטוקולים שלהלן, אפילו עם כל הפרטים שלהם, עדיין עשוי להיות מאתגר, ולכן אנו ממליצים בחום להכיר את התוכנה לקבלת התוצאות הטובות ביותר.

  1. היכנס ל-Tinkercad באינטרנט38 (איור 1A). נדרשת הרשמה מראש עם מידע אישי כדי לגשת לפלטפורמה, ללא תשלום.
  2. לחץ על צור פרויקט חדש כדי להתחיל עיצוב חדש, ושנה את שם הפרויקט בהתאם בפינה הימנית העליונה של החלון. לחץ על Enter כדי להיות מופנה למישור העבודה של הפרויקט (איור 1B).
  3. ודא אם למישור העבודה יש את המידות הנכונות של 200 מ"מ x 200 מ"מ, על-ידי לחיצה עם הלחצן השמאלי של העכבר על ערוך רשת בפינה הימנית התחתונה (ריבוע אדום באיור 1B). בחלון המוקפץ (איור 1C), ודא שה"יחידות" הן מילימטרים, וה"הגדרות המוגדרות מראש" הן ברירת המחדל. הזן 200.00 בשדות "רוחב" ובשדות "אורך", ולחץ על עדכן רשת כדי לשמור את השינויים.
  4. ודא אם רשת ההצמדה מוגדרת ל-1.0 מ"מ (ריבוע אדום באיור 1B). אם לא, לחץ על התפריט הנפתח ובחר 1.0 מ"מ.
  5. תחת תפריט צורות בסיסיות משמאל (ריבוע כחול 2 באיור 1B), בחר תיבה מלאה וגרור אותה למרכז מישור העבודה.
  6. לחץ במקום כלשהו בתיבה במישור העבודה באמצעות הלחצן השמאלי של העכבר כדי לראות את הקצוות והקודקודים שלו. לחץ על קודקוד כלשהו (שלאחר מכן יהפוך לאדום) כדי להציג את מידות התיבה (ריבועים אדומים באיור 1D). לחץ עם הלחצן השמאלי של העכבר בכל ממד והקלד 130 מ"מ לאורך (L), 130 מ"מ לרוחב (W) ו-40 מ"מ לגובה (H). מרכז מחדש את התיבה על-ידי גרירתה לאמצע מישור העבודה.
  7. לחץ על הכלי סרגל בפינה הימנית העליונה של המסך (ריבוע אדום 1 באיור 1E). לחץ מיד על הקודקוד השמאלי התחתון של התיבה, כפי שמצוין באיור 1E (ריבוע אדום 2), כדי להגדיר את הנקודה ההתחלתית (x = 0, y = 0, z = 0) של מערכת קואורדינטות קרטזית תלת מימדית. שימו לב שהמרחק בין הקודקוד שנבחר לנקודת ההתחלה של הקואורדינטות יופיע כעת (ריבועים אדומים באיור 1F), כאשר "A", "B" ו-"C" מייצגים את המרחק לצירי x, y ו-z (שאמור להיות אפס במקרה זה), בהתאמה.
  8. לאחר מכן, בחר תיבה ריקה (חור) מתפריט צורות בסיסיות מימין (ריבוע כחול 2 באיור 1B) וגרור אותה למישור העבודה. הגדר את מידותיו ל- 30 (L) x 30 (W) x 40 (H) מ"מ, והגבהה אותו 2 מ"מ ממישור העבודה, על ידי הקלדת "2.00" בתיבת הטקסט ליד ראש החץ הירוק בפינה הימנית התחתונה של התיבה הריקה (ריבוע אדום באיור 1G). מקם את התיבה הריקה בתוך הקופסה המוצקה במרחק של 2 מ"מ מהנקודה ההתחלתית של קואורדינטות x,y, על ידי הקלדת "2.00" בתיבות הטקסט ליד החצים הירוקים בפינה השמאלית התחתונה של התיבה (ריבועים אדומים באיור 1H; השווה לאיור 1G).
  9. כאשר התיבה הריקה עדיין נבחרה, הקש על מקשי CtrL+D במקלדת כדי לפרוס את הפקודה "שכפל" וליצור תיבה ריקה חדשה באותם מידות בדיוק. מקם את התיבה הריקה החדשה בתוך התיבה המלאה, ליד התיבה הריקה הראשונה, על-ידי הקלדת "34.00" בתיבת הטקסט לצד החץ הירוק לאורך ציר ה-y, ו-"2.00" בתיבות הטקסט לצד שני החצים הירוקים הנותרים (ריבועים אדומים באיור 1I).
  10. חזרו על שלב זה, תוך התאמה למרחקים הנכונים מנקודת ההתחלה של הקואורדינטות, עד שכל הקופסה המוצקה תתמלא בקופסאות ריקות המרוחקות 2 מ"מ זו מזו (איור 1J).
  11. בחר את כל התיבות (מלאות וריקות) על ידי לחיצה עם הכפתור השמאלי של העכבר וגרירה לכל האזור. הקש על מקשי CtrL+G במקלדת כדי לפרוס את הפקודה "קבוצה" וליצור תיבה אחת עם 16 מקומות ריקים עבור בקבוקוני זבוב (איור 1K). זהו העיצוב הסופי של מתלה הבקבוקון.
  12. לחץ על ייצוא בפינה השמאלית העליונה של חלון Tinkercad. בתיבת החלון המוצגת (איור 1L), בחר הכל בעיצוב לצד כלול ו- . STL תחת להדפסת תלת-ממד כסוג הקובץ. בחר שם מתאים לקובץ העיצוב ושמור אותו במקום מתאים במחשב.

הדפסת 2. 3D

הערה: בסעיף זה, אנו מספקים הוראות כיצד להשתמש בקובץ STL שנוצר בשלב 1 ולהמיר אותו לקובץ G-Code המכיל את הוראות ההדפסה למדפסת התלת מימד. זהו תהליך החיתוך, שעבורו אנו משתמשים בתוכנת Repetier-Host.

  1. הורד את קובץ משלים 1 ושמור אותו במקום מתאים במחשב. זהו קובץ .rcp המכיל את תצורות המדפסת שישמשו להלן. לקבלת מידע נוסף על סוג הקובץ .rcp, בקר בכתובת39.
  2. פתח את תוכנת Repetier-Host, שכבר אמורה להיות מותקנת במחשב, לפי הוראותמ-37. הקש על מקשי CtrL+O במקלדת כדי לפתוח את ה-STL file במחשב שנוצר בפרוטוקול 1.
  3. לאחר הפתיחה, לחץ על מתלה הבקבוקון המעוצב ולחץ על מקש R במקלדת כדי לפתוח את תפריט העריכה בצד ימין של המסך (ריבוע אדום 1 באיור 2A). רכז את האובייקט בטבלת ההדפסה על-ידי לחיצה על כפתור מרכז האובייקט , המסומן בריבוע אדום 2 באיור 2A, בכרטיסייה מיקום אובייקט .
  4. לחץ על הכרטיסייה Slicer (ריבוע אדום 1 באיור 2B) ליד הכרטיסייה מיקום אובייקטים , ולאחר מכן לחץ על כפתור התצורה (ריבוע אדום 2 באיור 2B) למטה. שים לב שייפתח חלון חדש משמאל שבו ניתן להגדיר את פרמטרי המדפסת כגון מהירות, עובי שכבה ומחזיקים (ראה פרטים נוספים בדיון למטה).
  5. לחץ על כפתור הייבוא (ריבוע אדום 3 באיור 2E), בחר משלים file 1 מהקבצים ולחץ על Enter. שים לב שקובץ .rcp זה (שהורד בשלב 2.1) מספק את הפרמטרים לתצורה האוטומטית של המדפסת שביצענו אופטימיזציה עבור מתלה בקבוקון זה.
  6. כדי לסיים את קביעת התצורה של פרמטרי ההדפסה, בחר ללא עבור סוג תמיכה בתפריט מימין (ריבוע אדום 4 באיור 2E), מכיוון שהדפסת יצירה זו אינה דורשת תמיכה למניעת כיפוף או עיוותים אחרים. בצפיפות מילוי (ריבוע אדום 5 באיור 2E), בחר 20% כדי ליצור מבנה מוצק (ראה פרטים נוספים על פרמטרים אלה בדיון למטה).
  7. לחץ על פרוסה עם CuraEngine בפינה השמאלית העליונה של המסך כדי להפעיל את תוכנית החיתוך וליצור את ה-G-Code, המכיל את המידע הדרוש למדפסת כדי להדפיס את היצירה. שים לב שתחת הכרטיסיה הצגה לפני הדפסה בתפריט מימין (לצד הכרטיסיה כלי פריסה ), יוצג מידע אודות הזמן וכמות החומר הנדרשים להשלמת משימת ההדפסה (ריבוע אדום 1 באיור 2F).
  8. לחץ על שמור להדפסת SD כדי לשמור את ה-G-Code file בכרטיס SD (ריבוע אדום 2 באיור 2F). שימו לב שה-G-Code מכיל את הקואורדינטות התלת-ממדיות של היצירה המעוצבת, פרוסות לשכבות, לתפקוד תקין של המדפסת.
  9. הכנס את כרטיס ה-SD למדפסת התלת מימד RepRap ולאחר מכן עקוב אחר המידע המוצג על מסך המדפסת כדי לבחור הדפסה מכרטיס ה-SD.
  10. בחר את ה-G-Code file של מתלה הבקבוקון. שימו לב שהמדפסת תתחמם אוטומטית ותתחיל להדפיס את היצירה המעוצבת, מה שאמור להימשך מספר שעות. המתלה (איור 3A) צריך להיות מוכן לשימוש מיד לאחר השלמת עבודת ההדפסה.

3. מנגנוני ניתוח התנהגות

הערה: ניתן לחזור על השלבים המתוארים בפרוטוקולים 1 ו-2 עם התאמות מתאימות כדי להדפיס כמה מחלקי ציוד המעבדה הדרושים. עם זאת, אנו מבינים שעיצוב חלקים חדשים עשוי להיות מאתגר וגוזל זמן עבור משתמשים מתחילים ב-Tinkercad, ולכן במקום לספק פרוטוקולים שלב אחר שלב כיצד לעצב את כל הדגמים, אנו מעמידים להורדה מספר דגמי עיצוב שיצרנו כקבצי STL (ראה קבצים משלימים 2-11).

  1. הורידו קובץ משלים 2 עבור מודל של משפך קטן (איור 3B), שמשמש באופן שגרתי במעבדות זבובים כדי לסייע בהעברת זבובים בוגרים לבקבוקונים או לבקבוקים חדשים על ידי הימנעות מזבובים שזוחלים במעלה הקירות הפנימיים של המכלים האלה כדי לברוח.
  2. הורד את קובץ משלים 3 עבור תמיכת מחצלת הקשה (איור 3C), שיכולה להכיל קצף אתילן-ויניל אצטט או מחצלת כותנה עבה שעליה ניתן להקיש על בקבוקוני זכוכית או בקבוקים כאשר מטים זבובים לתוך מיכלים חדשים עם מזון טרי.
  3. הורד קובץ משלים 4 וקובץ משלים 5 עבור הדגם של מעמד מצלמה שקראנו לו Stalker (איור 3D).
    הערה: המכשיר מאפשר למקם כל מצלמה (מקצועית, webמצלמות, טלפונים סלולריים וכו') על גבי בסיס שבו ניתן לצלם צלחת פטרי המכילה זחלים או זבובים בוגרים או להקליט וידאו. סטוקר מאפשר הדמיה של התנהגות בעלי חיים המתרחשת אופקית, תמיד באותו מרחק מצלחת הפטרי, מה שנמנע מהכנסת שונות למדידות הניסוי אם ההקלטות חייבות להתבצע בימים שונים, למשל, או אם יש צורך להשתמש במצלמה למטרה אחרת בין ההקלטות. המכשיר מודולרי בצורה נוחה וניתן להרכיב אותו בקלות לאחר הדפסת הבסיס והחלק העליון מקובץ משלים 4, והצדדים מקובץ משלים 5. הריבועים בגודל 1 ס"מ 2 בבסיס, שניתן להדגיש באמצעות טוש קבוע, עוזרים לעקוב אחר מרחק הנסיעה של בעלי חיים בודדים. הדפיסו את המכשיר (לפחות את הבסיס) באמצעות חוט לבן, כך שיהיה מספיק ניגודיות בין הרקע לבעלי החיים כדי שתוכנת המעקב תזהה כל זבוב.
  4. הורד קובץ משלים 6 עבור העיצוב הניתן להדפסה של מוטל הזבוב (איור 3E), שיש לו עשר זירות חיזור והזדווגות (חדרים) המאורגנים באופן שמקל על הקלטות וידאו של עשרה זוגות הזדווגות בודדים בכל פעם. שימו לב שה-Fly Motel מבוסס על המכשיר שפורסם בשנת40, שם נמצא הסבר מפורט לשימוש בו במחקרים התנהגותיים. בנוסף לחלקים המודפסים בתלת מימד, המנגנון דורש 12 ברגים (3 x 8 מ"מ) לקיבוע החלק העליון לחלק התחתון כדי לייצב את המכשיר המורכב, צלחת אקרילית (60 x 60 x 3 מ"מ) ורוכסן הדוק. מכיוון שהמבנה של Fly Motel מורכב יותר, אנו מספקים גם סרטון הדרכה (קובץ משלים 7) כיצד להרכיב אותו בצורה נכונה, בהתחשב בכך שכל החלקים הנדרשים ומברג זמינים.
  5. הורידו קובץ משלים 8 עבור המודל של מבוך T (איור 3F), שמשמש לבדיקות זיכרון באמצעות זבובים בוגרים. הסבר מפורט על האופן שבו משתמשים במבוך ה-T כדי לגרום לזבובים לקשר גירויי ריח דוחים להתנהגותם הפוטוטרופית נמצא בפרסום המקורי41. המנגנון עושה שימוש גם בשני צינורות חרוטיים שקופים של 15 מ"ל, הנמצאים בדרך כלל בכל מעבדה ומחוברים לפתחים העגולים ברוחב 2 ס"מ בכל צד של החלק המרכזי. שימו לב שהדפסת ה-T-Maze דורשת תמיכה (ראו פרטים נוספים במקרא לאיור 2). בחר "בכל מקום" עבור סוג תמיכה (ריבוע אדום 4 באיור 2E) לאחר ביצוע שלבים 2.1-2.6 לעיל.
  6. הורד את הקובץ המשלים 9 ואת הקובץ המשלים 10 לתכנון החלקים הניתנים להדפסה של הגרסה שלנו של המכשיר עבור מבחני גיאוטקסיס שליליים איטרטיביים מהירים (RING) (איור 3G), המשמשים לביצוע מבחני טיפוס עם זבובים בוגרים ממספר גנוטיפים או תנאים סביבתיים בו זמנית, ומייצרים תוצאות בצורה סטנדרטית יותר ותפוקה גבוהה יותר42. מנגנון ה-RING הוא גם מודולרי, ובנוסף לחלקים המודפסים בתלת מימד, הוא דורש חלקים נוספים שניתן לרכוש בקלות באינטרנט או בחנות לחומרי בניין בעלות נמוכה: שני פירים מיושרים Φ8 x 300 מ"מ, ארבעה מיסבים ליניאריים Φ8 מ"מ, גומיות (או חתיכות חוט), חתיכת עץ בגודל 240 x 60 x 20 מ"מ לבסיס, ושמונה ברגי עץ (8 מ"מ) לקיבוע החלקים המודפסים לבסיס העץ. הורד את Supplemental File 11 לקבלת הוראות כיצד להרכיב את המכשיר לאחר שכל החלקים מודפסים או נרכשים. הסבר מפורט על אופן השימוש במנגנון ה-RING נמצא בפרסום המקורי42.

4. בדיקת ניידות זחלים

הערה: ביצענו אופטימיזציה של פרוטוקול זה, המבוסס במקור על Nichols et al.42, כדי לחקור את ההשפעות של ביטוי AOX על התפתחות דרוזופילה תחת לחץ קר. הקווים 3xtubAOX25 ו-w1118, המשמשים כדוגמאות לזחלי AOX המבטאים וביקורת, בהתאמה, תורבו בתזונה סטנדרטית24 ב-12 מעלות צלזיוס, על פי Saari et al.34. אנו ממליצים על פרוטוקול זה כדי לנתח את הניידות של דגימות זחל מכל מצב גנטי, שגודלו בכל תנאי סביבתי מעניין.

  1. הכינו צלחות אגר 2% על ידי הרתחת הכמות המקבילה של אגר במים נטולי יונים, מזיגה לתוך צלחות פטרי Φ90 X 15 מ"מ, ומתן אפשרות להן להתמצק בטמפרטורת החדר. עבור צלחות בנפח סופי של 20 מ"ל כל אחת, השתמש ב 0.4 גרם אגר.
  2. אספו בזהירות זחלי L3 נודדים מהצד של בקבוקוני התרבית/צלוחיות באמצעות זוג מלקחיים עגולים או מברשת, והניחו את הפרטים בצלחת פטרי בגודל Φ90 x 15 מ"מ עם מים נטולי יונים למשך פחות מ-10 שניות כדי לשטוף חלקיקי מזון המחוברים לגופם.
  3. העבירו זחל בודד לתבשילים עם אגרוז והמתינו 5 דקות עד שבעלי החיים יתאקלמו.
  4. מקמו את הכלים המכילים את הזחל הבודד על גבי נייר גרף (0.2 ס"מ2 רשת), וספרו את מספר הקווים שהחיה חצתה במשך דקה אחת, כשהיא נעה על גבי האגר. כל קו שנחצה מייצג מרחק של 2 מ"מ. חזור על ההליך עם אותו אדם 10-15 פעמים כדי לקבל שכפולים טכניים.
  5. חזור על שלב 4.4 עם לפחות 8-10 פרטים מצינורות/צלוחיות שונות, שגודלו בזמנים שונים כדי להשיג שכפולים ביולוגיים של אותו קו.
  6. חזור על שלבים 4.4 ו- 4.5 כדי לקבל נתונים עבור קו הזבוב השני (או עבור מספר הקווים שמתכוונים לנתח).
  7. ניתן להשתמש באותם זחלים בודדים ששימשו בשלבים 4.4-4.6 כדי להשיג נתונים נוספים על תנועת הגוף על ידי הנחת צלחות האגר עם זחל בודד תחת סטריאומיקרוסקופ וספירת מספר ההתכווצויות הפריסטלטיות של דופן הגוף למשך דקה אחת. השג שכפולים טכניים וביולוגיים לאומדן הניידות הממוצעת בין קווי הזבובים שנותחו.
  8. יישם את המבחן הסטטיסטי כדי לחשב את ההסתברות שהערכים של פרמטרי ניידות הזחלים הללו יהיו מובחנים בין קווי העניין. מכיוון שאנו משווים כאן נתונים משתי שורות בלבד, ניתן ליישם מבחן t של סטודנט.

5. רספירומטריה מיטוכונדריאלית באמצעות הומוגנטים של זחלים

הערה: הפרוטוקול הבא עבר אופטימיזציה למדידת צריכת חמצן מיטוכונדריאלית מהומוגנטים של זחלים של קו המבטא AOX 3xtubAOX והבקרה w1118, שתורבת ב-12 מעלות צלזיוס, אך אנו ממליצים להשתמש בו גם לדגימות זחלים של כל תנאי גנטי וסביבתי. אנו מבינים שביצוע ניסויים כאלה לא צריך להיכלל כיעד "בר השגה" עבור מעבדת זבובים "תוצרת בית", בניגוד לכל הפרוטוקולים האחרים שאנו מספקים במאמר זה, מכיוון שנדרשת השקעה ראשונית ניכרת כדי שהמעבדה תרכוש אוקסיגרף ברזולוציה גבוהה. הפרוטוקול מיועד לשימוש עם Oxygraph-2k (O2k) ותוכנת DatLab מבית Oroboros Instruments, כך שנדרשת אופטימיזציה נוספת אם הקורא ירצה להשתמש בציוד חלופי.

  1. הפעל את ה-O2k והפעל את תוכנת DatLab במחשב המחובר לאוקסיגרף. הסורגים המגנטיים בתוך תאי הבדיקה צריכים להתחיל לערבב אוטומטית. הסר את תמיסת אחסון האתנול מהתאים.
  2. שטפו את התאים לפחות 3 פעמים עם 100% אתנול ו -3 פעמים במים טהורים במיוחד.
  3. ב- DatLab, החלון בקרת O2k ייפתח אוטומטית. בטמפרטורת הבלוק [°C], הזן 12 מעלות צלזיוס (או הטמפרטורה המועדפת בטווח של 2-47 מעלות צלזיוס) ולחץ על אישור.
  4. חלון שני, ערוך ניסוי, ייפתח אוטומטית. הזן שמות לדוגמה בשדות דוגמה , בהתאם למה שיתווסף בתאים A ו-B, ולחץ על שמור.
  5. הוסף 1800 מיקרוליטר של מאגר הבדיקה (120 מ"מ KCl, 5 מ"מ KH2PO4, 3 מ"מ Hepes, 1 מ"מ EGTA, 1 מ"מ MgCl2, 2% BSA, pH 7.4) בכל תא וסגור אותם חלקית, ועדיין מאפשר חילופי חמצן עם האוויר החיצוני. אפשר לאותות ריכוז החמצן ושטף החמצן להתייצב, ולהראות תנודות מינימליות למשך 10 דקות לפחות. שלב זה יספק את כיול הציוד עם האוויר החיצוני ביום הניסוי (ראה שלבים 6.3 ו-6.4 להלן לפרטים נוספים על כיולים ניסיוניים).
  6. במהלך שלב כיול האוויר, התחל הכנת דגימה על ידי איסוף זהיר מצינורות התרבית/צלוחיות 20 זחלים נודדים של הגנוטיפ המתאים, באמצעות זוג מלקחיים או מכחול קטן.
  7. שטפו כל זחל במהירות אך ביסודיות במים נטולי יונים או 1x PBS (137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 8 מ"מ Na2HPO4 ו-2 מ"מ KH2PO4) והעבירו אותם להומוגניזטור זכוכית של 1 מ"ל על קרח, המכיל 500 מיקרוליטר של מאגר בידוד קר כקרח (250 מ"מ סוכרוז, 5 מ"מ Tris HCl, 2 מ"מ EGTA, pH 7.4)
  8. הומוגניזציה של כל הזחלים ב-5 משיכות ושפכו את ההומוגנאט לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל על קרח.
  9. הוסף 300 מיקרוליטר של מאגר בידוד להומוגניזטור הזכוכית, השרה את רקמות הזחל הנותרות עוד יותר ב-3 פעימות, ושפך שוב את ההומוגנאט לאותו צינור מיקרו-צנטריפוגה על קרח.
  10. הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר בידוד להומוגניזטור הזכוכית, השרה את רקמות הזחל הנותרות עוד יותר בשתי פעימות, ושפך שוב את ההומוגנאט לאותו צינור מיקרו-צנטריפוגה על קרח.
  11. מערבבים את ההומוגנאט הסופי (~1 מ"ל) על ידי היפוך הצינור פעמיים בעדינות ושומרים אותו על קרח עד לעיבוד הדגימה השנייה.
  12. חזור על שלבים 5.6-5.11 כדי להשיג את הומוגנט הזחל של הגנוטיפ השני.
  13. פתח את תאי האוקסיגרף A ו-B, והעביר 200 מיקרוליטר מכל הומוגנאט למאגר הבדיקה בכל תא, שחייב להיות בדיוק ב-12 מעלות צלזיוס בשלב זה. סגור את התאים לחלוטין ואפשר לריכוז החמצן ולאותות שטף החמצן להתייצב למשך כ -10 דקות.
  14. התחל מדידות צריכת חמצן על ידי הוספת 5 מיקרוליטר לכל תא של תמיסה של 2 M פירובאט, 2 M פרולין (ריכוז סופי בתאים = 5 מ"מ כל אחד) ו-7.5 מיקרוליטר של תמיסה של 0.4 M מלאט (1.5 מ"מ). אפשר לפחות 5 דקות לייצוב האות. שימו לב שבשלב זה, המיטוכונדריה תיטען במצעים הניתנים לחמצון כדי ליזום את תגובות מחזור החומצה הטריקרבוקסילית (TCA). כל עלייה באות צריכת החמצן עשויה לנבוע מתפקודיהם של חלבונים מנותקים (או עקב תופעות ניתוק אחרות), וניתן להשתמש בה לחישוב נשימה כללית לא מצומדת (המכונה גם נשימת דליפה בהיעדר אדנילטים, LN- ראה תוצאות מייצגות לפרטים).
  15. הוסף לכל תא 4 מיקרוליטר של תמיסה של 0.5 M ADP (1 mM) ואפשר לפחות 5 דקות לייצוב האות. בדרך כלל נצפית מיד עלייה משמעותית באות צריכת החמצן, המייצגת את הנשימה הזרחנית החמצונית (OXPHOS). הרוב הגדול של נשימת OXPHOS זו מונע על ידי קומפלקס I (CI).
  16. הוסף לכל תא 2 מיקרוליטר של תמיסה של 0.05 M antimycin A (0.05 mM) כדי לעכב CIII, ואפשר לפחות 5 דקות לייצוב האות. יש להבחין בירידה באות צריכת החמצן עד לרמות הבסיסיות שנראו לפני הוספת פירובאט, פרולין ומלאט, עבור דגימת הבקרה w1118 . נשימה מיטוכונדריאלית מזחלים המבטאים AOX תהיה עמידה חלקית לאנטימיצין-A, מכיוון שניתן כעת להפנות את האלקטרונים ל-AOX. כ-40% מכלל נשימת ה-OXPHOS צריכה להישאר לאחר עיכוב CIII, שאמור להיות נתמך אך ורק על ידי AOX.
  17. הוסף לכל תא 4 מיקרוליטר של תמיסה של 0.1 M פרופיל-גלאט (0.2 מ"מ) כדי לעכב AOX, ואפשר לפחות 15 דקות לייצוב האות. רמות צריכת החמצן בדגימות הזחל המבטאות AOX אמורות כעת לרדת לרמות הבסיסיות שנראו לפני הוספת פירובאט, פרולין ומלאט. ירידה זו מוכיחה כי הנשימה העמידה לאנטימיצין-A שנצפתה נובעת מתפקוד AOX.
  18. הוסף לכל תא 1 μL 0.01 M רוטנון (0.005 מ"מ) כדי לעכב את CI, ואפשר לפחות 5 דקות לייצוב האות כדי לקבל את אות צריכת החמצן של הדגימה ללא תלות בנשימה המיטוכונדריאלית. אות זה בדרך כלל נמוך כמו זה שנצפה לפני הוספת פירובט, פרולין ומלאט.
  19. שמור את הניסוי וסגור את תוכנת DatLab.

6. עיבוד נתוני רספירומטריה מיטוכונדריאלית

הערה: ערכי צריכת החמצן מתקבלים כממוצע של אותות שטף החמצן בפרק זמן מוגדר ומתבטאים כ-pmol O2 הנצרך לשנייה לכל מ"ג חלבון כולל בדגימה. הערכים מוזכרים תחילה כנגד ריכוז החמצן המקסימלי הזמין במאגר הבדיקה ביום הניסוי, בהתבסס על טמפרטורת הניסוי (המכונה רוויית אוויר), וריכוז החמצן המינימלי, שנקבע קודם לכן בכל תא על ידי הוספת Na2S2O4 למאגר הבדיקה (ראה 43 להנחיות היצרן להשגת כיול אפס חמצן). הערכים מנורמלים גם על ידי כמות החלבון הכוללת בהומוגנטים של הזחלים שנוספו למאגר הבדיקה של כל תא.

  1. קבע את ריכוז החלבון הכולל של כל דגימה בשיטת ברדפורד44. פתח מחדש את הניסוי השמור בתוכנת DatLab, לחץ על ניסוי בתפריט העליון ולאחר מכן ערוך. בחלון שנפתח, בחר מ"ג בקטע היחידה ובסעיף הכמות הזן את כמות החלבון הכלולה ב-200 מיקרוליטר של הדגימה שנוספה בכל תא. הריכוז יחושב אוטומטית על ידי התוכנה, בהתחשב בנפח החדר הכולל של 2 מ"ל. לחץ על כפתור שמור .
  2. לחץ על גרף בתפריט העליון ולאחר מכן בחר עלילות. בחלון שנפתח, בחר שטף למסה עבור שני הגרפים (1 ו-2, המתייחסים לתאים A ו-B, בהתאמה). לחץ על אישור. תוצאת הניסוי מנורמלת כעת על ידי ריכוז החלבון של הדגימות (pmol O2/s/mg חלבון כולל).
  3. בפינה הימנית העליונה של כל גרף (1 ו-2) בדף תוצאות הניסוי הראשי, לחץ על O2 ריכוז. לאורך ציר ה-x, זהה טווח זמן לפני הוספת הדגימות בתאים, שבו ריכוז החמצן ואותות השטף יציבים מאוד.
    1. לחצו לחיצה ממושכת על מקש Shift במקלדת המחשב, לחצו עם לחצן העכבר השמאלי בזמן ההתחלתי שנבחר, גררו את הסמן לאורך ציר הזמן לבחירת האזור הרצוי ושחררו את לחצן העכבר. בצע הליך זה עבור כל אחד מהגרפים בנפרד.
    2. לחץ פעמיים על הפסים הכחולים של האזורים שנבחרו בתחתית הגרפים, והקלד "אוויר" כדי לציין שאלו האזורים שנבחרו המשמשים לחישוב רוויית האוויר בחמצן.
  4. לחץ על כיול בשורת התפריטים העליונה, ובחר A: חמצן, O2 כדי לכייל את תא A. בחלון שנפתח, ודא שנבחר O2 Calib (צבע צהוב).
    1. לכיול אפס, לחץ על העתק מקובץ ובחר את הקובץ עם כיול אפס חמצן שבוצע בעבר (ראה 43 להנחיות היצרן).
    2. עבור כיול אוויר, בחר אוויר בעמודה בחר סימן . לחץ על כיול והעתק ללוח.
  5. לחץ על כיול בשורת התפריטים העליונה, בחר B: חמצן, O2 וחזור על שלב 6.4 כדי לכייל את תא B.
  6. בפינה הימנית העליונה של כל גרף (1 ו-2) בדף תוצאות הניסוי הראשי, לחץ על O2 שטף למסה. בחר את האזורים היציבים הרצויים של אות צריכת החמצן על ידי לחיצה ממושכת על מקש Shift במקלדת, לחיצה עם לחצן העכבר השמאלי וגרירת הסמן לאורך ציר הזמן. האזורים היציבים שנבחרו בין תוספות של פירובט / פרולין / מלאט ו- ADP מייצגים את ה- LN; בין ADP לאנטימיצין A, OXPHOS; בין אנטימיצין A לפרופיל גלאט (על עיכוב CIII), נשימה עמידה לאנטימיצין A; בין פרופיל גלאט לרוטנון (על עיכוב CIII+AOX), נשימה שיורית; לאחר רוטנון (על עיכוב CI+CIII+AOX), שאריות נשימה שאינן מיטוכונדריאליות. לחץ פעמיים על הפסים האדומים של האזורים שנבחרו בתחתית הגרפים, והזן תוויות מתאימות.
  7. לחץ על סימנים בשורת התפריטים העליונה, ולאחר מכן על סטטיסטיקה. בכרטיסייה הצג של החלון שנפתח, בטל את הסימון של כל האפשרויות למעט O2 שטף למסה. בכרטיסייה בחר באותו חלון, בחר תא A כדי לקבל את נתוני הנשימה עבור הדגימה הראשונה. לחץ על העתק ללוח והדבק את הנתונים בגיליון אלקטרוני. חזור על ההליך כדי להשיג את הנתונים עבור הדגימה השנייה בתא B.
  8. בגיליון אלקטרוני, הפחיתו את כל ערכי הנשימה על ידי שאריות הנשימה הלא מיטוכונדריאלית (הנתונים לאחר הוספת רוטנון). חשב ממוצעים ממספר שכפולים ניסיוניים והתווה את הנתונים לפי העדפתך.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

על ידי ביצוע השלבים בפרוטוקולים 1 ו-2, אדם אמור להיות מסוגל לעצב מתלה בקבוקון זבוב פשוט, ולהריץ את קובץ STL המודל דרך תוכנית החיתוך כדי ליצור קואורדינטות למדפסת התלת מימד. איור 3A מציג יחידה מודפסת של הדגם לצד העיצוב שלו. אנו גם מקווים ששלב 1 יוכל לספק את המיומנויות הבסיסיות לשימוש בצורות הבסיסיות הזמינות בפלטפורמת Tinkercad כדי ליצור מכשירים שימושיים למעבדה. עם זאת, פיתוח מיומנויות אלה עשוי לדרוש תרגול מתמיד והתייעצויות תכופות של מרכז העזרה של Tinkercad45. בפרוטוקול ...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקולי הדפסת התלת מימד וקבצי STL המופיעים כאן נועדו להקל על הקמת מעבדת זבובים חדשה או להגדיל את רפרטואר המכשירים במתקן התנהגותי קיים של דרוזופילה , תוך שימוש בציוד "תוצרת בית". אסטרטגיית ההדפסה התלת-ממדית עשויה להיות שימושית במיוחד במדינות מתפתחות כמו ברזיל, שם נראה כי מחקר המשתמש בדרוזופילה כאורגניזם מודל לחקר הביולוגיה האנושית אינו מיוצג, וציוד מיוחד הוא יקר. הפרוטוקולים שלנו מספקים הוראות כיצד ליצור את מסגרת הפלסטיק ולהרכיב מכשירים פשוטים יחסית, כגון מדפי בקבוקוני...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

המחברים מצהירים שאין ניגוד עניינים.

תודות

ברצוננו להודות לאמילי א. מקיני על העריכה האנגלית של כתב היד. GSG נתמכה על ידי מלגה מה-Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, מענק מספר 141001/2019-4). M.T.O. מבקש להודות למימון מ-Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, מספרי מענק 2014/02253-6 ו-2017/04372-0), ו-CNPq (מספרי מענקים 424562/2018-9 ו-306974/2017-7). C.A.C.-L. ברצוני להודות לתמיכה הכספית הפנימית של Universidade do Oeste Paulista. העבודה עם קווי דרוזופילה מהונדסים גנטית אושרה על ידי הוועדה המקומית לבטיחות ביולוגית (CIBio) של Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal, על פי הפרוטוקולים 001/2014 ו-006/2014, ועל ידי הוועדה הטכנית הלאומית לבטיחות ביולוגית (CTNBio), תחת הפרוטוקולים 36343/2017/SEI-MCTIC, 01200.706019/2016-45 ו-5488/2017.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
מדפסת תלת מימד RapRepמדפסת תלת מימד פופולרית המבוססת על מצב Prusa I3 DIY, הוראות זמינות בקו
הזבוב https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisited/ 3xtubAOXHowy Jacobs´ s מעבדה, אוניברסיטת טמפרה<em>קו דרוזופילה המבטא את הגן AOX מ- C. intestinalis תחת שליטת מקדם האלפא;-טובולין. 5 ו-6 עותקים של מבנה זה קיימים בזכרים ונקבות בהומו/המיזיגוסיטי, בהתאמה, אחד בכל אחד מהכרומוזומים X, 2 ו-3.
אדנוזין 5&פריים;-דיפוספט נתרן סל (מספר CAS 20398-34-9); ≥ 95%; משקל מולקולרי = 427.20 גרם/מול; מסיסות במים ב-50 מ"ג/מ"ל
Antimycin-ASigma-AldrichA8674Antimycin A מ-Streptomyces sp. (מספר CAS 1397-94-0); משקל מולקולרי ~ 548.63 גרם/מול; מסיסות ב-95% אתנול ב-50 מ"ג/מ"ל
AgarKasvK25-611001לשימוש בקטריולוגי; אבקה; חומר ממצק (12-20 גרם/ליטר)
סרום בקר אלבומין (BSA)Sigma-AldrichA7030חלק הלם חום, ללא פרוטאז, ללא חומצות שומן, למעשה ללא גלובולין (מספר CAS 9048-46-8); pH 7; ≥ 98%; מסיסות במים 40 גרם/מ"ל
נטולי יונים
EGTASigma-AldrichE4378אתילן גליקול-ביס(2-אמינואתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית (מספר CAS 67-42-5); ≥ 97%; משקל מולקולרי = 380.35 גרם/מול
אתנול 99.5%
קצףניתן להחלפה בחתיכות כותנה עבות
נייר0.2 ס"מ רשת
HepesSigma-AldrichH40344-(2-הידרוקסיאתיל) פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית (מספר CAS 7365-45-9), מוסמך BioPerformance; ≥ 99,5% (טיטרציה), נבדק בתרבית תאים; משקל מולקולרי = 238.30 גרם/מול
הומוגנייזרזכוכית יד SartoriusS), 1 מ"ל; מורכב מצילינדר עשוי זכוכית בורוסיליקט בתוספת בוכנה S; משמש לעתים קרובות להכנת דגימה פשוטה, למשל ריסוק דגימות רקמה.
KClAmresco0395-2אשלגן כלורי (מספר CAS 7447-40-7); ≥ 99,0%; משקל מולקולרי = 74.55 גרם/מול
KH2PO4סיגמא-אולדריץ'P5379אשלגן פופט מונו-בסיסי (מספר CAS 7778-77-0); ריאגנט פלוס; משקל מולקולרי = 136.09 גרם/מול
מיסבים ליניאריים (LM8UU)8 מ"מ, כל מותג
MalateSigma-AldrichM1000L-(-)-חומצה מאלית (מספר CAS 97-67-6); ≥ 95-100%; משקל מולקולרי = 134.09 גרם/מול), מסיסות במים: 100 מ"ג/מ"ל. תמיסה מותאמת ל-7.0 בקירוב.
MgCl2אמרסקו0288-1KGמגנזיום כלוריד, הקסהידרט (מספר CAS 7791-18-6); 99%-102%; משקל מולקולרי = 203.3 גרם/מול
צינורות מיקרוצנטריפוגה1.5 מ"ל; בוגר כל 100 ומיקרו; L,
Na2HPO4Amresco0348-1KGנתרן פוספט ניתן לחיטוי, דו-בסיסי, הפטהידראט (מספר CAS 7782-85-6); 98-102%; משקל מולקולרי = 268.07 גרם/מול
NaClHoneywell31434-1KGנתרן כלורי (מספר CAS 7647-14-5); ≥ 99,5%; משקל מולקולרי 58,44 גרם/מול. לשימוש במעבדה בלבד.
Oxigraph-O2kOroboros10000-02סדרה D-G; O2k-Core: כולל יחידה ראשית O2k עם בית נירוסטה, ערכת הרכבה O2k, שני OroboPOS (חיישני חמצן פולרוגרפיים) וערכת שירות OroboPOS, תוכנת DatLab, מערכת היניקה המשולבת של ISS וערכת טיטרציה O2k.
טושרצוי
צלחות90 X 15 מ"מ; משמש בדרך כלל לתרבות בקטריולוגית
PLA הדפסת תלת מימד נימהקוונטית הדפסת תלת מימדhttp://quantum3dprinting.com/נימה של חומצה פולילטית באיכות גבוהה (PLA), מומלץ בחום, (גליל 1.0 ק"ג), כל מותג
ProlineSigma-AldrichP0380L-Proline (מספר CAS 147-85-3); אבקה; 99%; משקל מולקולרי = 115.13 גרם/מול
פרופיל גלאטסיגמא-אולדריץ'P3130פרופיל גלאט (מספר CAS 121-79-9); אבקה; ≥ 98%; משקל מולקולרי = 212.2 0 גרם/מול; מסיסות באתנול ב-50 מ"ג/מ"ל
פירובטסיגמא-אולדריץ'P2256נתרן פירובט (מספר CAS 113-24-6), ≥ 99%; משקל מולקולרי = 110.04 גרם/מול; מסיסות במים ב-100 מ"ג/מ"ל
פירים מתוקנים8 x 300 מ"מ, כל מותג
RotenoneSigma-AldrichR8875Rotetone (מספר CAS 83-79-4); ≥ 95%, משקל מולקולרי 394.42 גרם/מול
גומיותניתנות להחלפה בחתיכות של מברג
כדי להרכיב חלק מהמכשירים המודפסים בתלת מימד
ScreewsM3 x 8 מ"מ
כרטיסבגודל 32Mb לפחות; מסופק בדרך כלל עם מדפסות תלת מימד
תוכנה Repetier HostHot-World GmbH & Co. KGhttps://www.repetier.com/תוכנת חיתוך מעולה, זמינה ללא עלות
תוכנה TinkercadAutodeskhttps://www.tinkercad.comתוכנת עיצוב מודלים תלת מימדיים, זמינה ללא עלות
סטריאומיקרוסקופLeicaM-80סטריאומיקרוסקופ, זום 7.5-60X + Leica cls 150 מקור אור לד
סוכרוזMerck107,651,000סוכרוז לשימוש במיקרוביולוגיה (מספר CAS 57-50-1);
TrisAmersham Biosciences17-1321-01Tris (hydroxymethyl)-aminomethane (מספר CAS 77-86-1); 99,8-100.1%; משקל מולקולרי 121.14 גרם/מול
פינצטה/מלקחייםסטארקST08710פינצטה היסטולוגית, ישר, קצה עגול, 12 ס"מ, AISI-410 נירוסטה
w1118 קו זבובHowy Jacobs´ s lab, אוניברסיטתקו דרוזופילה המשמש כבקרת רקע גנטית עבור צלחת
240 x 60 x 20 מ"מ
טייץ2 x 210 מ"מ, כל מותג
לוח אקרילי 60 x 60 x 3 מ"מ ADP Sigma-Aldrich A2754 מים אתילן-ויניל אצטט גרף ( קבוע פטרי שחורות מחרוזת SD טמפרה עץ 3XtubAOX רוכסן

מקורות

  1. nobelprize.org. , Available from: http://www.nobelprize.org/prizes/medicine/ (2021).
  2. Drosophila Model Filter. , Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/?term=%22drosophilia+model%22&filter=datesearch.y_5 (2021).
  3. A Look at Trends in NIHS Model Organism Research Support. , Available from: https://nexus.od.nih.gov/all/2016/07/14/a-look-at-trends-in-nihs-model-organism-research-support/ (2021).
  4. Drosophila. , Available from: https://bv.fapesp.br/pt/metapesquisa/?q=drosophila (2021).
  5. Metapesquisa. , Available from: https://bv.fapesp.br/pt/metapesquisa/ (2021).
  6. Jennings, B. H. Drosophila-a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
  7. Brandt, A., Vilcinskas, A. The Fruit Fly Drosophila melanogaster as a Model for Aging Research. Yellow Biotechnology I. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 135, 63-77 (2013).
  8. Yang, D. Simple homemade tools to handle fruit flies-drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (149), e59613(2019).
  9. Cheluvappa, R., Scowen, P., Eri, R. Ethics of animal research in human disease remediation, its institutional teaching; and alternatives to animal experimentation. Pharmacology Research and Perspectives. 5 (4), (2017).
  10. Plan Alto.gov. , Available from: http://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2007-2010/2008/lei/|11794.htm (2021).
  11. Plan Alto.gov. , Available from: https://www.planalto.gov.br/ccivil_03/_ato2004-2006/2005/decreto/d5591.htm (2021).
  12. Revistapesquisa.fapesp.br. , Available from: https://revistapesquisa.fapesp.br/en/supply-side-research-constraints/ (2021).
  13. ABC.org.br. , Available from: http://www.abc.org.br/2014/05/08/em-depoimento-a-cell-dario-zamboni-fala-dos-desafios-de-produzir-boa-ciencia-no-brasil/ (2021).
  14. Nascimento, S., Pólvora, A. Maker Cultures and the Prospects for Technological Action. Science and Engineering Ethics. 24 (3), 927-946 (2018).
  15. Maia Chagas, A., Prieto-Godino, L. L., Arrenberg, A. B., Baden, T. The €100 lab: A 3D-printable open-source platform for fluorescence microscopy, optogenetics, and accurate temperature control during behaviour of zebrafish, Drosophila, and Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 15 (7), (2017).
  16. Baden, T., Chagas, A. M., Gage, G., Marzullo, T., Prieto-Godino, L. L., Euler, T. Open Labware: 3-D Printing Your Own Lab Equipment. PLOS Biology. 13 (3), 1002086(2015).
  17. Zhou, B., Tian, R. Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure. Journal of Clinical Investigation. 128 (9), 3716-3726 (2018).
  18. Hock, D. H., Robinson, D. R. L., Stroud, D. A. Blackout in the powerhouse: Clinical phenotypes associated with defects in the assembly of OXPHOS complexes and the mitoribosome. Biochemical Journal. 477 (21), 4085-4132 (2020).
  19. Juszczuk, I. M., Rychter, A. M. Alternative oxidase in higher plants. Acta Biochimica Polonica. 50 (4), 1257-1271 (2003).
  20. McDonald, A. E. Alternative oxidase: An inter-kingdom perspective on the function and regulation of this broadly distributed "cyanide-resistant" terminal oxidase. Functional Plant Biology. 35 (7), 535-552 (2008).
  21. McDonald, A. E., Vanlerberghe, G. C., Staples, J. F. Alternative oxidase in animals: Unique characteristics and taxonomic distribution. Journal of Experimental Biology. 212, 2627-2634 (2009).
  22. McDonald, A., Vanlerberghe, G. Branched Mitochondrial Electron Transport in the Animalia: Presence of Alternative Oxidase in Several Animal Phyla. IUBMB Life (International Union of Biochemistry and Molecular Biology: Life. 56 (6), 333-341 (2004).
  23. McDonald, A. E., Costa, J. H., Nobre, T., De Melo, D. F., Arnholdt-Schmitt, B. Evolution of AOX genes across kingdoms and the challenge of classification. Alternative Respiratory Pathways in Higher Plants. , 267-272 (2015).
  24. Fernandez-Ayala, D. J. M., et al. Expression of the Ciona intestinalis Alternative Oxidase (AOX) in Drosophila Complements Defects in Mitochondrial Oxidative Phosphorylation. Cell Metabolism. 9 (5), 449-460 (2009).
  25. Kemppainen, K. K., et al. Expression of alternative oxidase in Drosophila ameliorates diverse phenotypes due to cytochrome oxidase deficiency. Human Molecular Genetics. 23 (8), 2078-2093 (2014).
  26. Andjeiković, A., Kemppainen, K. K., Jacobs, H. T. Ligand-bound geneswitch causes developmental aberrations in drosophila that are alleviated by the alternative oxidase. G3: Genes, Genomes, Genetics. 6 (9), 2839-2846 (2016).
  27. Hakkaart, G. A. J., Dassa, E. P. E. P., Jacobs, H. T., Rustin, P. Allotopic expression of a mitochondrial alternative oxidase confers cyanide resistance to human cell respiration. EMBO Reports. 7 (3), 341-345 (2006).
  28. Dassa, E. P., et al. Expression of the alternative oxidase complements cytochrome c oxidase deficiency in human cells. EMBO Molecular Medicine. 1 (1), 30-36 (2009).
  29. Szibor, M., et al. Broad AOX expression in a genetically tractable mouse model does not disturb normal physiology. DMM Disease Models and Mechanisms. 10 (2), 163-171 (2017).
  30. El-Khoury, R., Kaulio, E., Lassila, K. A., Crowther, D. C., Jacobs, H. T., Rustin, P. Expression of the alternative oxidase mitigates beta-amyloid production and toxicity in model systems. Free Radical Biology and Medicine. 96, 57-66 (2016).
  31. Mills, E. L., et al. Succinate Dehydrogenase Supports Metabolic Repurposing of Mitochondria to Drive Inflammatory Macrophages. Cell. 167 (2), 457-470 (2016).
  32. Giordano, L., et al. Alternative Oxidase Attenuates Cigarette Smoke-induced Lung Dysfunction and Tissue Damage. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60 (5), 515-522 (2019).
  33. Camargo, A. F., et al. Xenotopic expression of alternative electron transport enzymes in animal mitochondria and their impact in health and disease. Cell biology International. 42 (6), 664-669 (2018).
  34. Saari, S., et al. Alternative respiratory chain enzymes: Therapeutic potential and possible pitfalls. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1865 (4), 854-866 (2019).
  35. Instructables.com. , Available from: https://www.instructables.com/Building-a-Prusa-I3-3D-Printer-Revisted/ (2021).
  36. Tindercad.com. , Available from: https://www.tinkercad.com/ (2021).
  37. Repetier.com. , Available from: https://www.repetier.com/ (2021).
  38. Tinkercad.com. , Available from: https://www.tinkercad.com/login (2021).
  39. Knowledge.autodesk.com. , Available from: https://knowledge.autodesk.com/support/revit-products/learn_explore/caas/CloudHelp/cloudhelp/2016/ENU/Revit-Model/files/GUID-B89AD692-C705-458F-A638-EE7DD83D694C-htm.html (2021).
  40. Koemans, T. S., et al. Drosophila courtship conditioning as a measure of learning and memory. Journal of Visualized Experiments. (124), e55808(2017).
  41. Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration. Journal of Visualized Experiments. (49), (2011).
  42. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments JoVE. (61), e3795(2012).
  43. Oroboros. , Available from: https://www.oroboros.at/">"https://www.oroboros.at/">https://www.oroboros.at/ (2021).
  44. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).
  45. Tinkercad. , Available from: https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ">"https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ">https://tinkercad.zendesk.com/hc/en-us/categories/200357447-FAQ (2021).
  46. Morton, J. D., Barnes, M. F., Zyskowski, R. F. Respiratory control ratio: A computer simulation of oxidative phosphorylation. Biochemical Education. 24 (2), 110-111 (1996).
  47. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization. The Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 383-393 (1955).
  48. Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., French, A. S., Jamasb, A. R., Gilestro, G. F. Ethoscopes: An open platform for high-throughput ethomics. PLOS Biology. 15 (10), 2003026(2017).
  49. Github.com. , Available from: https://github.com/amchagas/Flypi">"https://github.com/amchagas/Flypi">https://github.com/amchagas/Flypi (2021).
  50. Gilestrolab.github.io. , Available from: https://gilestrolab.github.io/ethoscope/">"https://gilestrolab.github.io/ethoscope/">https://gilestrolab.github.io/ethoscope/ (2021).
  51. Imagej.nih.gov. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/">"https://imagej.nih.gov/ij/">https://imagej.nih.gov/ij/ (2021).
  52. Open-Neuroscience.com. , Available from: https://open-neuroscience.com/">"https://open-neuroscience.com/">https://open-neuroscience.com/ (2021).
  53. Appropedia.org. , Available from: https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment">"https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment">https://www.appropedia.org/3D_printable_science_equipment (2021).
  54. McParland, A. L., Follansbee, T. L., Ganter, G. K. Measurement of larval activity in the Drosophila activity monitor. Journal of Visualized Experiments. , (2015).
  55. Schou, M. F., Kristensen, T. N., Pedersen, A., Karlsson, B., Loeschcke, V., Malmendal, A. Metabolic and functional characterization of effects of developmental temperature in Drosophila melanogaster. American Journal of Physiology - Regulatory Integrative and Comparative Physiology. 312 (2), 211-222 (2017).
  56. Meeuse, B. J. D. Thermogenic Respiration in Aroids. Annual Review of Plant Physiology. , (1975).
  57. Watling, J. R., Robinson, S. A., Seymour, R. S. Contribution of the alternative pathway to respiration during thermogenesis in flowers of the sacred lotus. Plant Physiology. , (2006).
  58. Inaba, Y. I., et al. Alternative oxidase capacity of mitochondria in microsporophylls may function in cycad thermogenesis. Plant Physiology. 180 (2), 743-756 (2019).
  59. Sanz, A., Stefanatos, R., McIlroy, G. Production of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain in Drosophila melanogaster. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 42 (2), 135-142 (2010).
  60. Miwa, S., St-Pierre, J., Partridge, L., Brand, M. D. Superoxide and hydrogen peroxide production by Drosophila mitochondria. Free Radical Biology and Medicine. 35 (8), 938-948 (2003).
  61. Gnaiger, E. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control An Introduction to OXPHOS Analysis. Bioenergetics Communications. 2, Bionergetics Communications. Innsbruck, Austria. (2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.