מוצג כאן פרוטוקול ליצירת רקמות חיבור מהונדסות לתרבות מקבילה של 48 רקמות בלוח רב-בארות עם מוטות כפולים, המתאימים למחקרים מכאניסטיים, מידול מחלות ויישומי סינון. הפרוטוקול תואם פיברובלסטים מאיברים ומינים שונים ומודגם כאן עם פיברובלסטים לב ראשוניים אנושיים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיברובלסטים הם תאים דינמיים מאוד פנוטיפיים, אשר במהירות transdifferentiate לתוך myofibroblasts בתגובה גירויים ביוכימיים וביומכניים. ההבנה הנוכחית של תהליכים פיברוטיים, כולל פיברוזיס לב, נותרה גרועה, מה שמעכב את התפתחותם של טיפולים אנטי-פיברוטיים חדשים. מערכות מודל אנושיות ניתנות לשליטה ואמינות חיוניות להבנה טובה יותר של פתולוגיה פיברוזיס. זהו פרוטוקול רב-רב-ממד ליצירת רקמות חיבור מהונדסות (ECT) בלוח יציקה של 48 בארות כדי להקל על מחקרים על פיברובלסטים ועל הפתופיזיולוגיה של רקמה פיברוטית בסביבה תלת-ממדית (תלת-ממדית). ECT נוצרים סביב הקטבים עם נוקשות טונה, המאפשר מחקרים תחת עומס ביומכני מוגדר. תחת תנאי הטעינה המוגדרים, ניתן ללמוד התאמות פנוטיפיות הנשלטות על ידי אינטראקציות מטריצת תאים. בדיקה מקבילה אפשרית בפורמט 48-well עם הזדמנות לניתוח מסלול זמן של פרמטרים מרובים, כגון דחיסת רקמות והתכווצות נגד העומס. מפרמטרים אלה, תכונות ביומכניות כגון נוקשות רקמות וגמישות ניתן ללמוד.
מבוא
מכשול מרכזי בחקר מחלות פיברוטיות הוא היעדר מודלים ייצוגיים של רקמת תלת-ממד אנושית המספקים תובנה על התנהגותם של פיברובלסטים ונגזרותיהם הפתולוגיות. כדי לחקור תהליכים פיברוטיים, מערכות תרבות 2D סטנדרטיות הן תת-אופטימליות מאז פיברובלסטים מבודדים transdifferentiate במהירות לתוך אקטין שריר חלק α (SMA) - ביטוי myofibroblasts כאשר מתורבת על מצעים 2D שאינם תואמים1,2,3. לכן, פיברובלסטים בתרבות הדו-ממדית הסטנדרטית אינם משקפים פנוטיפ רגיל של רקמות "בריאות"3,4,5,6.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הצעדים חייבים להתבצע בברדסים בטיחות ביולוגית Class II המותקנים במעבדות תחת רמת בלימה 1. בהתאם לתקנות המקומיות וסוג המניפולציות שיש לבצע, כגון העברת גנים בתיווך ויראלי, יש להגדיל את רמת הבלימה לרמת הבטיחות הביולוגית 2 או 3. כל התרבויות נשמרות ב 37 °C (5 °F) באינקובטור תרבית התא עם אווירה לחה של 5 % CO2 באוויר. שים לב כי אמצעי האחסון (שלבים 1 ו- 2) מסופקים עבור בקבוקון תרבית תאים T75. התאם את הכרכים לתבניות תרבות שונות בהתאם להמלצות הרגילות של תרבית התאים.
1. הפשרה וקדם ציפוי פיברובלסט לב ראשוני (CF) לתרבות חד שכבתית (5-12 ימים)
הערה: כחלופה, ניתן להשתמש בתאי HFF-1 בהתאם לפרוטוקול תת-תרבית הסטנדרטי כפי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
ECT להגיע סביב 95% דחיסה לעומת נפח הידרוג'ל קולגן התא הראשוני בתוך 24 שעות הראשונות. דחיסת רקמות והתכווצות בתנאי בקרה ובנוכחות FCS מתבצעת מספר שעות לאחר הליהוק, ובמיוחד עולה עד היום החמישי (איור 5A). הסטת הקוטב עשויה לגדול עוד יותר במהלך 15 הימים הבאים (20 יום היה הזמן הארוך ביותר שנבדק). גודל הסטת הקוטב תלוי בסוג התא, במצב התא ובתנאי תרבית התאים והרקמות. בדרך כלל, תכונות ביומכניות נמדדות ביום 5 של תרבות, אבל כל נקודת זמן ניתן לבחור. כדוגמה ליישום של מודל ECT, הוא הראה כיצד פרוטוקול זה יכול .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הפרוטוקול המוצג מתאר את הדור של ECT מ- CF האנושי העיקרי, המאפשר לחקור את ההשפעה המכנית של תאים אלה על סביבת המטריצה החוץ-תאית שלהם ולהיפך.
הפיברובלסטים צריכים להיות מורחבים כדי להניב תאים מספיקים לניסויי ECT המתוכננים (0.75 x 106 תאים / ECT). עבור הרבייה הטובה ביותר, מומלץ מראש תרבית קפואה או רקמה נגזר פיברובלסטים בתרבות מונו-שכבתית דו-ממדית למשך סטנדרטי עד 80% השפעה בתוך כל מעבר ולפני השימוש שלהם בדור ECT (פרוטוקול שלב 3). עבור culturing ראשי CF-monolayers ו-נגזר ECT בפרט, מומלץ לה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
GLS ו- SL ניסחו את כתב היד. כל המחברים תרמו לפיתוח הפרוטוקול וערכו את כתב היד. TM, MT, ו- WHZ הם יועצים מדעיים ל- GmbH הרב. WHZ הוא המייסד ובעל המניות של GmbH הרב.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי אגודת הלב הגרמנית (מלגת המחקר DGK ל- GLS) ועל ידי קרן המחקר הגרמנית (DFG באמצעות פרויקט IRTG 1816 עבור GLS ו- AD; DFG 417880571 ו DFG TI 956/1-1 עבור MT; SFB 1002 TP C04 עבור הר ו- WHZ; SFB 1002 TP S01 עבור WHZ; ו EXC 2067/1-390729940J עבור WHZ). WHZ נתמך על ידי המשרד הפדרלי הגרמני למדע וחינוך (BMBF באמצעות הפרויקט IndiHEART), ואת פונדציה Leducq (20CVD04). MT, WHZ ו- SL נתמכים על ידי המרכז הגרמני לחקר הלב וכלי הדם (DZHK).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| ריאגנטים לתרבית תאים: | |||
| תמיסת Accutase | Merk Millipore | SCR005 | |
| מגיב דיסוציאציה – TrypLE Express | Gibco | 12604013 | |
| אבקת Modified Eagle Medium (DMEM) של Dulbecco, גלוקוז גבוה | Gibco | 12100061 | |
| Dulbecco s פוספט חוצץ מלח (DPBS), pH 7.2, -Ca2+, -Mg2+ | Gibco | 14190144 | |
| FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3132 | |
| FBM גידול פיברובלסטים בסיסי בינוני | Lonza | CC-3131 | |
| FGM-2 Fibroblast Growth Medium-2 SingleQuots, תוספי תזונה וגורמי גדילה | Lonza | CC-4126 | |
| Fibroblast Growth Medium 3 KIT | PromoCell | C-23130 | |
| Fibroblast Basal Medium 3 | PromoCell | C-23230 | |
| Growth Medium 3 SupplementPack | PromoCell | C-39350 | |
| פניצילין (10000 U/mL)/ סטרפטומיצין (10000 μ L/mL) | תמיסת נתרן | ||
| (NaOH) 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770-100ML | |
| מקורות תאים: | |||
| פיברובלסטים לבביים אנושיים רגילים מהחדר (NHCF-V) | Lonza | CC-2904 | |
| פיברובלסטים לבביים אנושיים (HCF-c) | PromoCell | C-12375 | |
| פיברובלסטים לבביים אנושיים ( HCF-p) | PromoCell | C-12377 | |
| פיברובלסטים ראשוניים של עורלה אנושית-1 (HFF-1) | ATCC | SCRC- 1041 | |
| קולגן חמצן: | |||
| קולגן סוג I (בקר) ב-0.01 M HCl | LLC פתרונות קולגן | FS22024 | 6-7 מ"ג/מ"ל |
| קולגן סוג I (זנב עכברוש) ב-0.02 M HCl | Corning | 354236 | ~4 מ"ג/מ"ל |
| תרופות: | |||
| Latrunculin-A (Lat-A) | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | |
| כלי פלסטיק: | |||
| כלי פלסטיק תרבית תאים | רשת Sarstedt ו-Starlab | ||
| (ניילון, גודל נקבוביות 40 μ m) | Falcon | 352340 | |
| myrPlate-uniform | myriamed GmbH | TM5 med | |
| פיפטות סרולוגיות פתיחה רחבה, סטרילית (10 מ"ל) | קורנינג | 07-200-619 | |
| מכשירים ספציפיים: | |||
| עדשת CORE דו-טלצנטרית עבור 1/2 & Prime; גלאים | אופטו הנדסה | TCCR12096 | |
| מצלמת סריקת שטח Basler ace acA4024 | Basler | 107404 |
מקורות
- Driesen, R. B., et al. Reversible and irreversible differentiation of cardiac fibroblasts. Cardiovascular Research. 101 (3), 411-422 (2014).
- Shi, X., et al. Elasticity of cardiac cells ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
