הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

תהודה מגנטית גרעינית Pure Shift: כלי חדש למטבולומיקה של צמחים

1.8K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62719

⸱

31 ביולי 2021

 ,  , 
1Departamento de Ciencias - Química, CERMN, Pontificia Universidad Católica del Perú

במאמר זה

סיכום

מאמר זה מציג את השימוש ב-PSYCHE וב-SAPPHIRE-PSYCHE באפיון מטבולי של צמחים וכולל נהלים מפורטים להכנת דגימות והקלטה אופטימלית של ספקטרום NMR Pure Shift. דוגמאות שבאמצעותן נדון הרווח ברזולוציה שהושג על ידי ניתוק הומו-גרעיני המאפשר הבנה מקיפה יותר של המערכת.

תקציר

תהודה מגנטית גרעינית (NMR) היא אחד הכלים החזקים ביותר המשמשים במטבולומיקה. היא עומדת כשיטה מדויקת ביותר וניתנת לשחזור שלא רק מספקת נתונים כמותיים, אלא גם מאפשרת זיהוי מבני של המטבוליטים הקיימים בתערובות מורכבות.

פרופיל מטבולי על ידי 1H NMR הוכח שימושי במחקר של סוגים שונים של תרחישי צמחים, הכוללים הערכה של תנאי היבול, קציר וטיפולים לאחר הקציר, פנוטיפ מטבולי, מסלולים מטבוליים, בקרת גנים, זיהוי סמנים ביולוגיים, כימוטקסונומיה, בקרת איכות, המלים של המקור, בין היתר. עם זאת, חפיפת אותות של מספר גדול של תהודה עם מכפלות צימוד J מורחבות מסבכת את ניתוח הספקטרום ואת פרשנותו, ומייצגת מגבלה עבור פרופיל NMR קלאסי של 1H.

בעשור האחרון פותחו טכניקות חדשניות לניתוק-צימוד הומו-גרעיני בפס רחב של NMR, שבאמצעותן אותות מרובים קורסים לקווי תהודה בודדים - הנקראות בדרך כלל שיטות Pure Shift - כדי להתגבר על בעיית רזולוציית הספקטרום הטבועה בספקטרום הקלאסי של 1H NMR.

כאן מוצג פרוטוקול שלב אחר שלב של הכנת תמצית הצמח וההליך לרישום אופטימלי של ספקטרום Pure Shift PSYCHE ו- SAPPHIRE-PSYCHE בשלוש מטריצות צמחים שונות - עלי צמח וניל , פקעות תפוחי אדמה (S. tuberosum) ודומדמניות כף (P. peruviana). נדונה השפעת העלייה ברזולוציה בזיהוי מטבולי, ניתוח מתאמים וניתוחים רב-משתניים, בהשוואה לספקטרום הקלאסי.

מבוא

מערך שלם של מטבוליטים המרכיבים אורגניזם - מצעים, מתווכים ותוצרים סופיים של תהליכים ביולוגיים - נטבע בשנת 1998 עם המונח מטבוליזם. ידוע היטב כי חילוף החומרים קשור קשר הדוק לפנוטיפ, והוא מעניין במיוחד בצמחים מכיוון שהוא משקף את האינטראקציה הישירה בין הגנוטיפ לסביבה 1,2. לפיכך, אפיון הפרופיל המטבולי הפך להיות בעל חשיבות עליונה בצמחים. באמצעות זיהוי וכימות של סמנים ביולוגיים (מטבוליטים מרכזיים) ודפוסים מטבוליים, ההבחנה בין מינים, זנים, שלבי התפתחות, מחלות פתוגניות, או תנאים סביבתיים (שינויים יומיים ועונתיים, קרקעות, לחץ מים, לחץ מכני, קציר וטיפולים לאחר הקציר), בין היתר, התאפשרה 3,4,5.

ספקטרומטריית מסות (MS) וספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) הן הפלטפורמות האנליטיות הנפוצות ביותר למטרה זו. בניגוד למתודולוגיות הטרשת הנפוצה, NMR עומדת כטכניקה מאוד ניתנת לשחזור, לא מוטה, כמותית, מדויקת ולא הרסנית הדורשת הכנת דגימה מינימלית, מה שהופך אותה מתאימה למחקרים מטבולומיים. עם זאת, בהשוואה לשיטות טרשת נפוצה, הרגישות הנמוכה המובנית היא מגבלה. בשנים האחרונות ובאמצעות שימוש במגנטים בעלי שדה גבוה, גשושיות קריוגניות, התקני מיקרו-סליל ושיטות קיטוב גרעיני דינמי (DNP), הרגישות של NMR השתפרה מאוד. במקרה של הגישה השנייה, למשל, העלייה ברגישות הייתה ברמה של שניים עד שלושה סדרי גודל 6,7. נכון להיום, כמעט 20% ממחקרי המטבולומיקה שפורסמו מבוססים על NMR והמספר עולה7.

למרות שפרוטון NMR הוא הניסוי הפופולרי והרגיש ביותר לטביעת אצבע מטבולומית של NMR, יש לו כמה חסרונות. ראשית, כל אותות ה-NMR של 1H שזוהו בדגימה מפוזרים בחלון קטן המתאים לחלון ההסטה הכימי של הפרוטון, מה שגורם לספקטרום צפוף. שנית, הצימוד הסקלרי ההומו-גרעיני מפצל את האותות למספר רכיבים (ריבוי אותות), מפזר את אות הפרוטון על פני טווח תדרים רחב יותר, ומסבך עוד יותר את קריאת הספקטרום על ידי הגדלת הצפיפות וחפיפת האותות. בנוסף, מטבולומיקה של NMR משמשת בניתוח תערובות המכילות בדרך כלל 50 עד 300 מולקולות בריכוז נצפה של NMR, ומייצרות ספקטרום מורכב המורכב מ-200 עד 2000 פסגות.

Homonuclear decoupling proton NMR, הידוע גם בשם Pure Shift, היא שיטה הגורמת לקריסה של אות מרובה לשיא יחיד. הוא מהווה כלי מצוין להגדלת רזולוציית האות בספקטרום צפוף 8,9,10 ולכן מהווה כלי נוח לצמחים מטבוליים11.

בעשור האחרון הופיעו רצפי פולסים חדשים של Pure Shift, המגבירים הן את הרגישות והן את ביצועי הניתוק. מגוון היישומים שלהם התרחב גם הוא, מהבהרת מבנה מולקולרי12,13, לפלוקסומיקה14, הקצאת תערובת 15,16,17, מדידות דיפוזיה תרגומית 18, אפליה אננטיומרית19, התפלגות יחידות בקו-פולימרים20, בין היתר.

מבחינה היסטורית, ניסויי Pure Shift בפס רחב סובלים מרגישות נמוכה ומשיטות עיבוד מסובכות, המגבילות את היקפם בהערכת תמציות ביולוגיות8. בשנת 2014, Foroozandeh et al. פרסמו ניסוי חדש של Pure Shift, PSYCHE (Pure Shift Yielded by Chirp Excitation), המבוסס על רצף פולסים אנטי-z-COSY שהניב ניתוק הומו-גרעיני מצוין וערכי רגישות משופרים21. עם זאת, מכיוון ש-PSYCHE הוא ניסוי אינטרפרוגרמה דו-ממדי שבו נרכשים נתחים של נתוני תחום הזמן, הוא סובל מארטיפקטים תקופתיים של פס צד הנובעים מעיוותי אפנון צימוד J בקצוות הגוש. בתערובות מורכבות, ממצאים אלה מניבים אותות גדולים יותר מאלה הקשורים למטבוליטים הנמצאים בריכוזים נמוכים מאוד, מה שמעכב את הניתוח11. ישנן שתי שיטות להסיר ממצאים אלה - TSE-PHYCHE22 ושינוי עדכני יותר של ניסוי PSYCHE שנקרא SAPPHIRE-PSYCHE (Sideband Averaging by Periodic PHase Incrementation of Residual J Evolution)23.

בשנת 2019 הדגמנו לראשונה11 כי שיטת SAPPHIRE-PSYCHE Pure Shift, המסירה ממצאים כמעט ללא עונש רגישות23, יכולה לשמש לניתוח תערובות ביולוגיות מורכבות, כגון תמציות של פירות Physalis peruviana, הידוע בכינויו Cape gooseberries11. הראינו כי שיטות אלה מגבירות את הביצועים של ניתוחי נתונים מטאבולומיים כגון הקצאה מטבולית, ניתוח מתאם וניתוח מקדמים רב-משתנים11. מאז, מספר מחקרים מטבולומיים של Pure Shift על מטריצות ביולוגיות שונות, כגון אלמוגים רכים24, צמחי היפריקום25, דבש26,27, תה27, שמן נענע חריפה26 ואגוזי מלך28 טופלו, מה שמדגים את חשיבותו ככלי חדש לניתוח מטבולומיקס. באופן פרדוקסלי, רובם המכריע של מחקרים אלה השתמשו ברצף הדופק הנפשי הסטנדרטי והקל ליישום, הזמין מכל ספריית ספקטרומטר, במקום ברצף הדופק SAPPHIRE-PSYCHE, שהוכח כבעל ביצועים טובים יותר. עם זאת, זה דורש הבנה טובה יותר של רצף הדופק עבור הגדרה נכונה.

מאמר זה נועד לסייע למשתמשים חדשים ליישם שיטות Pure Shift בחקר צמחים, בפרט, עלים של Vanilla sp (V. planifolia and V. pompona)29, פקעות תפוחי אדמה (S. tuberosum)30, ודומדמניות כף (P. peruviana)31. הכנת דגימות, הגדרת ניסוי NMR, רכישת נתונים וניתוח נתונים מתוארים בפירוט. יתר על כן, הפרוטוקול כולל הערות מפתח כדי לסייע לחוקרים, חדשים בתחום, להקים כראוי ניסויים PSYCHE ו- SAPPHIRE-PSYCHE בפרופיל מטבולי של צמחים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מדגם

  1. דומדמניות כף
    1. מניחים 100-200 גרם של פירות טריים באגרטל בלנדר. שמור על 4 ° C במשך 30 דקות, ולאחר מכן הומוגניזציה בבלנדר מעבדה.
    2. מיד, להעביר את המיץ 50 מ"ל צינורות פלסטיק, להקפיא אותם בחנקן נוזלי lyophilize ליובש במשך 4 עד 5 ימים.
    3. טוחנים את החומר הליופילי לאבקה דקה באמצעות מטחנה חשמלית.
      הערה: הטיפול בחומר היבש צריך להיעשות במהירות מכיוון שהאבקה היגרוסקופית מאוד.
    4. שוקלים 1 גרם מחומר הקרקע ומוסיפים 10 מ"ל מים טהורים במיוחד. מערבולת במשך דקה אחת.
    5. סוניק במשך 20 דקות ב-10°C, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-23,000 × גרם למשך 20 דקות ב-10°C.
    6. לשחזר את supernatant ולסנן אותו דרך מסנן מזרק 13 מ"מ polytetrafluoroethylene (PTFE) 0.45 מיקרומטר.
    7. Lyophilize 1 מ"ל של תמצית מסוננת ליובש ולאחר מכן להשעות מחדש את מוצק המתקבל ב 0.9 מ"ל של 200 mM נתרן אוקסלט חיץ pH 4. מערבולת.
    8. Lyophilize את הדגימה המתקבלת ליובש ולהמיס אותו 0.9 מ"ל של תחמוצת דאוטריום המכיל 5 mM של 3-(trimethylsilyl)propionic-2,2,3,3-d4 מלח נתרן חומצה (TMSP-d4).
    9. מלא את צינור NMR עם 0.6 מ"ל של הדגימה באמצעות micropipette.
  2. עלי וניל
    1. אספו את העלים, נקו אותם בנייר טישו לח והקפיאו אותם שלמים בחנקן נוזלי.
    2. שוברים את העלים לחתיכות קטנות ועושים ליופיליזציה במשך 4 ימים עד ליובש.
    3. טוחנים את החומר היבש לאבקה דקה באמצעות מטחנה חשמלית.
    4. שוקלים 50 מ"ג חומר טחון ומוסיפים 0.75 מ"ל חיץ פוספט pH 6.0 בתחמוצת דאוטריום המכילה 0.1% TMSP (w/w) ו-0.75 מ"ל מתנול-d4. מערבולת במשך דקה אחת.
    5. סוניק למשך 20 דקות ב-25°C.
    6. צנטריפוגה ב 13,000 × גרם במשך 10 דקות ב 25 ° C.
    7. לשחזר את supernatant (~ 1.3-1.4 מ"ל) ולסנן אותו דרך מסנן מזרק 13 מ"מ PTFE 0.45 מיקרומטר.
    8. מלא את צינור NMR עם 0.6 מ"ל של הדגימה המסוננת באמצעות micropipette.
  3. פקעות תפוחי אדמה
    1. מקלפים ופורסים 4 עד 8 פקעות. יש לשים מיד כ-125 גרם חומר בשקיות עמידה ולהקפיא אותן בחנקן נוזלי.
      הערה: כדי למנוע חמצון במהלך הטיפול יש לשמור על תפוח האדמה לח.
    2. ליופיליזציה במשך 4 עד 6 ימים עד ליובש מוחלט.
    3. טוחנים את החומר היבש לאבקה דקה באמצעות מטחנה חשמלית.
    4. שוקלים 160 מ"ג של פקעת הקרקע ומוסיפים 1.6 מ"ל של מים deionized. מערבולת במשך דקה אחת.
    5. סוניק למשך 45 דקות ב-10°C.
    6. צנטריפוגה ב-23,000 x גרם למשך 20 דקות ב-10°C.
    7. לשחזר את supernatant (~ 1.5 -1.6 מ"ל) ולאדות אותו ליובש ברכז ואקום צנטריפוגלי קירור במשך 16 שעות, ב 10 ° C.
    8. מוסיפים למוצק המתקבל (20-25 מ"ג) 0.9 מ"ל של 100 mM נתרן אוקסלט חוצץ pH 4, מערבולת, ומתאדים במשך 16 שעות ב 10 ° C.
    9. להמיס את המוצק המתקבל 0.9 מ"ל של תחמוצת דאוטריום המכיל 3 mM של TMSP.
    10. צנטריפוגה ב-23,000 x גרם למשך 5 דקות ב-10°C ולסנן את הסופרנאטנט ישירות לתוך צינור ה-NMR דרך מסנן מזרק PTFE 0.45 מיקרומטר בקוטר 13 מ"מ.
      הערה: במקרה זה, סינון ישיר לתוך צינור NMR בוצע כדי להפחית את השלבים בהכנת יותר מ -1000 דגימות.

2. איסוף ועיבוד נתוני NMR

  1. התקנה ראשונית של תמ"ג
    1. העבירו את הדגימות לספקטרומטר NMR.
    2. כוונן והתאם את ראש הבדיקה.
    3. לנעול ולשפוך את המדגם.
    4. כיול הפולס הקשיח של 90°. כייל את הפולס של 90° באמצעות כל אחד מההליכים הסטנדרטיים.
    5. הפעל ספקטרום NMR סטנדרטי של פרוטון 1D.
  2. ניסוי פסיכי
    1. בחר את רצף הפולסים reset_psyche_1d מספריית Bruker Topspin (איור S1). השתמש בפרמטרים הסטנדרטיים הבאים: רוחב ספקטרלי של 5 kHz (SW2), לפחות שנייה או שתיים של עיכוב התאוששות הרפיה (D1), 16 סריקות דמה (DS), 64 או 128 נקודות נתונים מורכבות לכל בלוק (L31), ו- 64 או 128 סריקות (NS) (איור S1).
      הערה: L31 הוא מספר הנקודות הדיגיטליות המורכבות שנרכשו בכל בלוק Pure Shift, שעדיף להגדיר בחזקה של 2. 21
    2. הגדר את עירור זווית היפוך פולס CHIRP הרצוי (CNST61) ו- 10 קילו-הרץ עבור רוחב הפס של פולס CHIRP (CNST60) (איור S2).
      הערה: ניסוי הנפש מבוסס על סכמה אנטי-z-COSY ; כתוצאה מכך, זווית היפוך הדופק של CHIRP צריכה להיות קטנה כדי להימנע משחזור ממצאים (איור 1). העוצמה האבסולוטית עולה עם זווית ההתהפכות של העירור. הממצאים המחזוריים גם משופרים, מתפשטים לתוך הספקטרום ומגבירים את ה"רעש" (איור 1). ה"רעש" הופך לשילוב של רעש סטנדרטי וקיבוץ חפצים. פשרה טובה בין רגישות לבין תוצרי צימוד נמוכים היא להגדיר CNST61 = 20°. 19,22
    3. הגדר את אורך הפולס הקשיח (P1) לערך שכויל קודם לכן ואת אורך הפולס בצורת PSYCHE ל- 30 אלפיות השנייה (P49) (איור S2).
      הערה: חשוב מאוד לכייל את ערך הדופק הקשיח מכיוון שעוצמת הדופק הצורני תחושב באופן אוטומטי מערך זה.
    4. בחר את פעימת הצורה Crp_psyche.20 (SPNAM 37) עבור רכיב PSYCHE (איור S2).
    5. הגדר את עוצמת שיפוע שדה הדופק המופעל במהלך אלמנט PSYCHE (GPZ0). בחר RECT.1 לפעימת צורת מעבר הצבע (GPNAM 0) (איור S2).
      הערה: שיפוע שדה מגנטי חלש מוחל במהלך אלמנט הנפש, בדרך כלל, בין 1% ל -4% מהחוזק המרבי של השיפוע, בהתאם לבדיקה.
    6. הגדר את מספר הבלוקים שיש לרכוש כדי לשחזר את Pure Shift FID (TD1) (איור S3).
      הערה: PSYCHE נרכש כניסוי פסאודו-דו-ממדי כאשר TD1 הוא מספר בלוקי האינטרפרוגרמה של Pure Shift. רזולוציית הספקטרום תלויה בגודל החלון הספקטרלי (SW1) ובמספר הכולל של נקודות שנרכשו, שהוא TD1*2*L31. בדרך כלל, 16 או 32 בלוקים עם 64 או 128 נקודות מורכבות לכל בלוק יספקו מספיק רזולוציה דיגיטלית. כאשר PSYCHE נרשם באופן אינטרפרוגרמה, מספר גבוה יותר של בלוקים מגדיל את הרזולוציה הדיגיטלית, אבל, גם את זמן הרכישה הכולל19. צימודי J הומו-גרעיניים מתפתחים במהלך כל בלוק וכתוצאה מכך נוצרת תבנית אפנון J מתנודדת21,23. לאחר התמרת פורייה, זה יוצר תוצרי פס צד מחזוריים שתלויים באורך הבלוק (איור 2). כדי להפחית חפצים, משך הבלוק חייב להיות קצר, בדרך כלל פחות מ- 16 אלפיות השנייה (משך בלוק = 2*in0: איור S1). אם משך החסימה גבוה, הפחיתו את L31.
    7. עבד את הנתונים עם תוכנית Proc_reset AU של Bruker והתמרת פורייה.
      הערה: אנו ממליצים לשנות את הספקטרום באמצעות מילוי אפס ואפודיזציית פעמון סינוס (איור S4).
  3. ניסוי ספיר-פסיכה
    1. בחר את רצף הדופק SAPPHIRE-PSYCHE והגדר את פרמטרי רצף הדופק. הפרמטרים הסטנדרטיים יהיו הבאים: רוחב ספקטרלי של 5 קילו-הרץ (SW3), לפחות שנייה או שתיים של עיכוב הרפיה (D1), 16 סריקות דמה (DS), 8 או 16 סריקות לכל הפרש קבוע (NS) ו-D2 עד 14 אלפיות השנייה (איור S5).
      הערה: רצף זה אינו נמצא ברפרטואר של Bruker, עם זאת, ניתן לקבל את הרצף ואת תוכניות העיבוד מאתר האינטרנט של Manchester NMR Methodology Group, (https://www.nmr.chemistry.manchester.ac.uk/?q=node/426)23. השהיית D2 מבטיחה שההרפיה של T2 תישאר קבועה עם כל תוספת אפנון J. D2 צריך להיות גדול מ- 1/4*SW1+p16+2*d16. 23
    2. הגדר את עירור זווית היפוך פולס CHIRP הרצוי (CNST20) ו- 10 kHz עבור רוחב הפס של פולס CHIRP (CNST21) (איור S6).
      הערה: כמו בניסוי פסיכה רגיל, זווית היפוך הדופק של CHIRP צריכה להיות קצרה כדי למנוע שחזור ממצאים. CNST20 = 20° היא פשרה טובה בין רגישות לבין תוצרי צימוד נמוכים 21,23,25.
    3. הגדר את אורך הדופק הקשיח (P1) לערך שכויל קודם לכן ואת אורך הפולס בצורת PSYCHE ל- 30 אלפיות השנייה (P40) (איור S6).
      הערה: חשוב לכייל את ערך הדופק הקשיח מכיוון שעוצמת הדופק הצורני תחושב ממנו באופן אוטומטי.
    4. בחרו פולס צורה PSYCHE_Saltire_10kHz_30m עבור אלמנט PSYCHE (איור S6).
    5. הגדר את עוצמת שיפוע שדה הדופק המופעל במהלך אלמנט PSYCHE (GPZ10). בחר RECT.1 לפעימת צורת מעבר הצבע (GPNAM 10) (איור S7).
      הערה: שיפוע שדה מגנטי חלש מוחל במהלך אלמנט הנפש, בדרך כלל, בין 1% ל -4% מהחוזק המרבי של השיפוע, ערך התלוי בבדיקה.
    6. הגדר את מספר הפרשים הקבועים של אפנון SAPPHIRE J ב- F2 (TD2) (איור S7).
      הערה: בדרך כלל 8 דרגות מבטיחות דיכוי מצוין של תוצרי הרצועה הצידית (איור 2 ו-3). המספר הכולל של סריקות Pure Shift FID הסופי הוא NS*TD2. 23
    7. הגדר את החלונות הספקטרליים F1 ו- F2 (SW1 ו- SW2) (איור S5).
      הערה: SW2=SW3/(2*TD2) ו-SW3/SW1 = TD2*N, היו TD2 ו-N הם מספרים שלמים זוגיים23. ניסוי SAPPHIRE-PSYCHE נרכש כפסאודו תלת-ממדי שבו F2 מקודד את אפנון שלב החפץ צימוד J ואת F1 את רכישת אינטרפרוגרמה Pure Shift20. מאחר ש-SAPPHIRE-PSYCHE מסיר רצועות צד של אפנון J , משך בלוק האינטרפרוגרמה Pure Shift יכול להיות ארוך יותר מ-PSYCHE רגיל (Pure Shift block duration = 1/SW1), בדרך כלל בין 20 ל-40ms (איור 2). עם זאת, רכישת נתונים בנתחים ארוכים יותר מובילה לאבולוציות גבוהות יותר של צימוד J, אשר ידרשו יותר תוספות אפנון שלב של צימוד J כדי להסיר את רצועות הצד החזקות יותר שהושגו23.
    8. הגדר את מספר בלוקי Pure Shift (TD1) (איור S7).
      הערה: מכיוון שספיר-פסיכה צריכה לפצות על אפנון שלב צימוד J של הבלוק הראשון, יש לרכוש בלוק נוסף. בדרך כלל, 17 (16+1) או 33 (32+1) בלוקים נותנים מספיק רזולוציה דיגיטלית23.
    9. עבד את הנתונים המבצעים את תוכניות pm_pshift ו- pm_fidadd AU ולאחר מכן התמרת פורייה23.
      הערה: אנו ממליצים לשנות את הספקטרום באמצעות מילוי אפס ואפודיזציית פעמון סינוס (איור S4).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

ניתוח ספקטרום NMR
ניסויי פסיכה מגדילים את רזולוציית הספקטרום על ידי כיווץ תהודה מצומדת לסינגלטים21, שבתורה מפחיתה חפיפה ומקלה על הקצאה וניתוח נתונים. ניתן ליישם NMR Pure Shift על תמציות צמחים. כאן אנו מדגימים את השימוש בו בשלוש מטריצות שונות: עלי וניל, פקעות תפוחי אדמה ופירות Physalis peruviana . שיפור הרזולוציה שהושג בספקטרום של תמציות צמחים אלה ברור מאיורים S8-S11.

על מנת להעריך את ההשפעה של רצפי פולסים אלה ברזולוציה של או...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

זיהוי מכנסי מטבוליטים וכימות הם נושאים מרכזיים באפיון המטבוליזם, נתונים שכאשר הם נתונים לניתוחים מרובי משתנים מאפשרים להבין טוב יותר את המערכת הביולוגית הנחקרת. הכנת מדגם ורכישת נתונים הם היבטים קריטיים הזקוקים לאופטימיזציה על מנת לספק תוצאות אמינות.

במאמר זה נתאר ונמחיש את הכנת הדגימה לניתוח NMR של שלוש מטריצות צמחים שונות. כמו בכל הליך מיצוי, כמות הממס לגרם של חומר והתכונות הפיזיקליות של הממס שנבחר יקבעו את ההרכב הכימי של התמצית הסופית ואת ריכוז המטבוליטים ש...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

תודות

מחקר זה מומן על ידי Consejo Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación Tecnológica (CONCYTEC) - Programa Atracción de Investigadores Cienciactiva - חוזה # 008-2017-FONDECYT.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
77500 Freezone 4.5 ליטר שולחן שולחןLabconco77500
Bruker Avance III 500 מגה-הרץ מצויד בבדיקה קריוגנית 5 מ"מ TCI Z-gradientBruker Corporation
Centrivap Centrivap רכזים צנטריפוגליים מקוררים Labconco 7310000 סדרתLabconco7310000
תחמוצת דאוטריוםסיגמא-אולדריץ'151882
מכונת מטחנה MKM6003בושMKM6003
ליקוואדורה בלנדר 8011S דגם Hgb2wts3WaringHgb2wts3
מתנול-d4סיגמא-אולדריץ'151947

מקורות

  1. Hall, R., Beale, M., Fiehn, O., Hardy, N., Sumner, L., Bino, R. Plant metabolomics: the missing link in functional genomics strategies. The Plant Cell. 14 (7), 1437-1440 (2002).
  2. Fiehn, O. Metabolomics-the link between genotypes and phenotypes. Plant Molecular Biology. 48 (1-2), 155-171 (2002).
  3. Schauer, N., Fernie, A. R. Plant metabolomics: towards biological function and mechanism. Trends in Plant Science. 11 (10), 508-516 (2006).
  4. Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go. Trends in Biotechnology. 29 (6), 267-275 (2011).
  5. Kumar, R., Bohra, A., Pandey, A. K., Pandey, M. K., Kumar, A. Metabolomics for Plant Improvement: Status and Prospects. Frontiers in Plant Science. 8, (2017).
  6. Dumez, J. -N., et al. Hyperpolarized NMR of plant and cancer cell extracts at natural abundance. Analyst. 140 (17), 5860-5863 (2015).
  7. Emwas, A. -H., et al. NMR Spectroscopy for Metabolomics Research. Metabolites. 9 (7), (2019).
  8. Zangger, K. Pure shift NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 86-87, 1-20 (2015).
  9. Foroozandeh, M., Morris, G. A., Nilsson, M. PSYCHE Pure Shift NMR Spectroscopy. Chemistry - A European Journal. 24 (53), 13988-14000 (2018).
  10. Castañar, L. Pure shift NMR: Past, present, and future. Magnetic Resonance in Chemistry. 56 (10), 874-875 (2018).
  11. Lopez, J. M., Cabrera, R., Maruenda, H. Ultra-Clean Pure Shift 1 H-NMR applied to metabolomics profiling. Scientific Reports. 9 (1), 1-8 (2019).
  12. Marcó, N., Gil, R. R., Parella, T. Isotropic/Anisotropic NMR Editing by Resolution-Enhanced NMR Spectroscopy. Chemphyschem: A European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 19 (9), 1024-1029 (2018).
  13. Kaltschnee, L., et al. Extraction of distance restraints from pure shift NOE experiments. Journal of Magnetic Resonance. 271, 99-109 (2016).
  14. Sinnaeve, D., et al. Improved Isotopic Profiling by Pure Shift Heteronuclear 2D J-Resolved NMR Spectroscopy. Analytical Chemistry. 90 (6), 4025-4031 (2018).
  15. Timári, I., et al. Real-Time Pure Shift HSQC NMR for Untargeted Metabolomics. Analytical Chemistry. 91 (3), 2304-2311 (2019).
  16. Zhao, Q., et al. Combination of pure shift NMR and chemical shift selective filters for analysis of Fischer-Tropsch waste-water. Analytica Chimica Acta. 1110, 131-140 (2020).
  17. Zhao, Q., et al. Pure Shift NMR: Application of 1D PSYCHE and 1D TOCSY-PSYCHE Techniques for Directly Analyzing the Mixtures from Biomass-Derived Platform Compound Hydrogenation/Hydrogenolysis. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 9 (6), 2456-2464 (2021).
  18. Foroozandeh, M., et al. Ultrahigh-Resolution Diffusion-Ordered Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 55 (50), 15579-15582 (2016).
  19. Castañar, L., Pérez-Trujillo, M., Nolis, P., Monteagudo, E., Virgili, A., Parella, T. Enantiodifferentiation through Frequency-Selective Pure-Shift 1H Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. ChemPhysChem. 15 (5), 854-857 (2014).
  20. Lopez, J. M., Sánchez, L. F., Nakamatsu, J., Maruenda, H. Study of the Acetylation Pattern of Chitosan by Pure Shift NMR. Analytical Chemistry. , (2020).
  21. Foroozandeh, M., Adams, R. W., Meharry, N. J., Jeannerat, D., Nilsson, M., Morris, G. A. Ultrahigh-Resolution NMR Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition. 53 (27), 6990-6992 (2014).
  22. Foroozandeh, M., Adams, R. W., Kiraly, P., Nilsson, M., Morris, G. A. Measuring couplings in crowded NMR spectra: pure shift NMR with multiplet analysis. Chemical Communications. 51 (84), 15410-15413 (2015).
  23. Moutzouri, P., et al. Ultraclean pure shift NMR. Chemical Communications. 53 (73), 10188-10191 (2017).
  24. Santacruz, L., Hurtado, D. X., Doohan, R., Thomas, O. P., Puyana, M., Tello, E. Metabolomic study of soft corals from the Colombian Caribbean: PSYCHE and 1 H-NMR comparative analysis. Scientific Reports. 10 (1), 5417(2020).
  25. Stark, P., Zab, C., Porzel, A., Franke, K., Rizzo, P., Wessjohann, L. A. PSYCHE-A Valuable Experiment in Plant NMR-Metabolomics. Molecules. 25 (21), 5125(2020).
  26. Kakita, V. M. R., Rachineni, K., Hosur, R. V. Ultraclean Pure Shift NMR Spectroscopy with Adiabatic Composite Refocusing Pulses: Application to Metabolite Samples. ChemistrySelect. 4 (34), 9893-9896 (2019).
  27. Bo, Y., et al. High-resolution pure shift NMR spectroscopy offers better metabolite discrimination in food quality analysis. Food Research International. 125, 108574(2019).
  28. Watermann, S., Schmitt, C., Schneider, T., Hackl, T. Comparison of Regular, Pure Shift, and Fast 2D NMR Experiments for Determination of the Geographical Origin of Walnuts. Metabolites. 11 (1), 39(2021).
  29. Leyva-Zegarra, V., et al. NMR-based leaf metabolic profiling of V. planifolia and three endemic Vanilla species from the Peruvian Amazon. Food Chemistry. , 129365(2021).
  30. Toubiana, D., et al. Morphological and metabolic profiling of a tropical-adapted potato association panel subjected to water recovery treatment reveals new insights into plant vigor. The Plant Journal. 103 (6), 2193-2210 (2020).
  31. Maruenda, H., Cabrera, R., Cañari-Chumpitaz, C., Lopez, J. M., Toubiana, D. NMR-based metabolic study of fruits of Physalis peruviana L. grown in eight different Peruvian ecosystems. Food Chemistry. 262, 94-101 (2018).
  32. Cloarec, O., et al. Statistical total correlation spectroscopy: an exploratory approach for latent biomarker identification from metabolic 1H NMR data sets. Analytical Chemistry. 77 (5), 1282-1289 (2005).
  33. Steuer, R. Review: on the analysis and interpretation of correlations in metabolomic data. Briefings in Bioinformatics. 7 (2), 151-158 (2006).
  34. Trygg, J., Holmes, E., Lundstedt, T. Chemometrics in Metabonomics. Journal of Proteome Research. 6 (2), 469-479 (2007).
  35. Worley, B., Powers, R. Multivariate Analysis in Metabolomics. Current Metabolomics. 1 (1), 92-107 (2013).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

Pure Shift NMRNMRSAPPHIRE PSYCHE
תהודה מגנטית גרעינית Pure Shift: כלי חדש למטבולומיקה של צמחים
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.