Method Article

ייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

DOI:

10.3791/62721

⸱

July 9th, 2021

 ,  ,  , 
1Department of Regenerative Medicine and Cell Biology, Medical University of South Carolina

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כאן מתוארות שיטות מפורטות לייצור, תחזוקה ואפיון של אורגנואידים במעי הדק ובמעי הגס שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. שיטות אלו נועדו לשפר את יכולת השחזור, להרחיב את המדרגיות ולהפחית את זמן העבודה הנדרש לציפוי ומעבר של אורגנואידים.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מפרט אזורי של המעי מתאר תהליך שבאמצעותו מורפולוגיה ותפקוד ייחודיים מוענקים לאזורים מוגדרים במערכת העיכול המתפתחת. אפיון אזורי במעי מונע על ידי מסלולי התפתחות מרובים, כולל מסלול החלבון המורפוגנטי של העצם (BMP). בהתבסס על מפרט אזורי רגיל, פותחה שיטה ליצירת אורגנואידים של המעי הגס האנושי (HCOs) מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs), הכוללים תאי גזע עובריים אנושיים (hES) ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). אינדוקציה של שלושה ימים של איתות BMP מעצבת מספיק תרביות צינור אמצעי/אחורי ל-HCOs מיוחדים עשירים ב-AT המבטאים רצף 2 (SATB2) המכילים את כל סוגי תאי האפיתל העיקריים הקיימים במעי הגס האנושי כמו גם תאים מזנכימליים המתפתחים במשותף. השמטת BMP (או תוספת של מעכב BMP NOGGIN) במהלך תקופת דפוס קריטית זו הביאה להיווצרות אורגנואידים במעי אנושי (HIOs). HIO ו-HCOs דומים מבחינה מורפולוגית ומולקולרית למעי הדק ולמעי הגס המתפתחים על ידי בני אדם, בהתאמה. למרות התועלת של HIO ו-HCOs לחקר התפתחות המעיים האנושיים, יצירת HIO ו-HCOs היא מאתגרת. מאמר זה מציג שיטות ליצירה, תחזוקה ואפיון של HIO ו-HCO. בנוסף, ניתנים השלבים הקריטיים בפרוטוקול והמלצות לפתרון בעיות.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

חקר התפתחות המעי הגס האנושי קשה בגלל מגבלות על השימוש ברקמת עובר אנושית. מודלים של בעלי חיים היו יקרי ערך ושימשו היסטורית לגישות גנטיות בעכברים לחקר התפתחות המעיים. עם זאת, הבדלים בין התפתחות מעיים של עכברים לבני אדם מגבילים את הישימות של עכברים כמערכת מודל. לדוגמה, למרות שהיווצרות קריפטה במעי הדק ובמעי הגס של עכברים מתרחשת לאחר הלידה, בני אדם נולדים עם קריפטות שנוצרו במלואן1. יתר על כן, המעי הדק והמעי הגס האנושיים מכילים סוגי תאים שאינם נמצאים בעכברים, כולל תאים אנטרואנדוקריניים המבטאים מוטילין (MLN) במעיהדק 2 ותאי גביע המבטאים מוצין 5B (MUC5B) במעי הגס 3,4. מסיבה זו, חשוב שתהיה מערכת תרבית תאים המדמה במדויק את האירועים המולקולריים הדינמיים המגדירים את השלבים המוקדמים של התפתחות המעי הגס. לכן, הכוונת hPSCs ליצירת תאים עם מאפיינים של המעי הגס מספקת מודל רב עוצמה לחקר התפתחות המעי הגס האנושי.

פותחו פרוטוקולים כדי להקל על היווצרות5, סינכרונית ויעילה של אורגנואידים דמויי מעי6 דמויי מעיו-7 דמויי מעי מ-hPSCs. הפרוטוקולים האלה משתמשים בהליך התמיינות מדורג שמחקה את התפתחות המעי והמעי הגס של העובר (איור 1). ראשית, אנדודרם סופי נוצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים על ידי טיפול ב-Activin A, חיקוי צמתים. חשיפה של האנדודרם הסופי לרמות גבוהות של WNT וגורם גדילה פיברובלסטים (FGF) גורמת למורפוגנזה לספרואידים של צינור אמצעי/אחורי CDX2+ . ספרואידים של המעי האמצעי/המעי האחורי מוטמעים לאחר מכן במטריצה חוץ-תאית (ECM) ומעוצבים ל-HIO או ל-HCOs באמצעות מניפולציה חולפת של איתות BMP. עיכוב איתות BMP באמצעות NOGGIN או הוספת מצע גידול בלבד מביא להיווצרות HIOs, הדומים למעי הדק הפרוקסימלי האנושי.

על ידי הפעלת איתות BMP באמצעות BMP2, ספרואידים במעי האמצעי/אחורי מעוצבים ל-HCOs, השומרים על דפוס באפיתל ובמזנכימה7. HCOs מכילים תאי גביע מועשרים במעי הגס המבטאים MUC5B והם מסוגלים לייצר תאים אנטרואנדוקריניים דמויי אינסולין 5 (INSL5) המבטאים אינסולין ספציפי למעי הגס. מזנכימה מבודדת מ-HCOs מבטאת הומאובוקס A13 (HOXA13) ו-HOXD13, המתבטאים גם במזנכימה ראשונית של המעי הגסהאנושי 8. חשוב לזכור ששלב הדפוס מתרחש במהלך הימים 7-10 של פרוטוקול ההתמיינות. תקופה זו של שלושה ימים מספיקה כדי לגרום לדפוס המעי הגס שנשמר לאחר תרבית מבחנה ממושכת.

הפרוטוקולים המתוארים להלן מיועדים לחוקרים שמכירים תרבית hPSC ללא מזין. לחוקרים שאינם מכירים סוג זה של תרבית hPSC, מומלץ קורס הכשרה על hPSCs כמו אלה המוצעים על ידי Stem Cell Technologies או מתקן תאי הגזע הפלוריפוטנטיים (PSCF) בבית החולים לילדים בסינסינטי. איכות ה-hPSCs ההתחלתיים היא קריטית ויכולה להשפיע על כל השלבים במורד הזרם. הפרוטוקול הבא יתחיל עם hPSCs שגודלו במשך 4 ימים ומוכנים לפיצול.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. יצירת אורגנואידים במעי האנושי ובמעי הגס

  1. הכנת צלחות מצופות ECM
    1. הוסף 50 מ"ל של מדיום DMEM קר לצינור חרוטי של 50 מ"ל.
    2. הסר כמות של 4x ECM מוסמך hESC (ראה טבלת החומרים) מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס והפשיר על קרח.
      הערה: עיין בתעודת הניתוח של המוצר כדי לקבוע את נפח ה-ECM המוסמך ESC הנדרש להכנת מלאי פי 4.
    3. אם ECM מוסמך hESC אינו מופשר במלואו, קח 750 מיקרוליטר של DMEM מהצינור החרוטי של 50 מ"ל וערבב אותו עם ה-ECM.
    4. העבירו את תערובת ה-ECM המוסמכת DMEM/hESC לצינור החרוטי של 50 מ"ל עם DMEM וערבבו היטב. הוסף 0.5 מ"ל לבאר לכל אחת מ -4 צלחות תרבית תאים של 24 בארות.
    5. נענע את הצלחות כדי לפזר את ה-ECM באופן שווה בכל הבאר כדי להבטיח שכל המשטח מכוסה. בעזרת פרפילם, אטמו את הלוחות המצופים ב-ECM והשאירו אותם בטמפרטורת החדר בארון בטיחות ביולוגית למשך שעה אחת לפחות. אחסן צלחות מצופות ECM בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים או עד הצורך.
  2. ציפוי hPSCs תא יחיד
    1. הנח צלחת מצופה ECM עם 24 בארות בתוך ארון בטיחות ביולוגית למשך 30 דקות כדי לאפשר לה להגיע לטמפרטורת החדר.
    2. הנח מדיום שלם mTeSR1, פתרון ניתוק תאים ו-DMEM מתקדם בתוך אמבט מים של 37 מעלות צלזיוס ואפשר להם להתחמם למשך 30 דקות.
    3. ודא ש-hPSCs הם לפחות 85% מתכנסים עם התמיינות מינימלית. הסר את כל התאים המובחנים במידת הצורך.
    4. הכן את מדיום הציפוי בצינור חרוטי של 50 מ"ל באופן הבא: 13 מ"ל של mTeSR1 ו-13 מיקרוליטר של 10 מ"מ Y-27632 מעכב חלבון קינאז הקשור ל-Rho (ROCK).
      הערה: Y-27632 מעכב אנויקיס ומגביר את ההישרדות של תאים בודדים.
    5. כדי לאסוף תאים מצלחת של 6 בארות, שאפו את המדיום מ-3 עד 4 בארות ושטפו פעם אחת עם 2 מ"ל של DMEM מתקדם לכל באר.
    6. שאפו את ה-DMEM המתקדם והוציאו 1 מ"ל מתמיסת הדיסוציאציה של התאים לכל באר. דגרו את הצלחת למשך 5-7 דקות בתוך חממה של 5% CO2, 37 מעלות צלזיוס. בדוק תחת המיקרוסקופ שהתאים נמצאים בתרחיף.
    7. נתק את כל גושי התאים שנותרו על ידי פיפטה למעלה ולמטה 4-5 פעמים באמצעות פיפטה של 5 מ"ל.
    8. הוסף 2 מ"ל של DMEM מתקדם לכל באר, פיפטה בעדינות למעלה ולמטה 4-5 פעמים והעביר לצינור חרוטי של 15 מ"ל. סובב את התאים בחום של 300 × גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    9. שאפו את המדיום מהצינור מבלי לשאוב את גלולת התא והוסיפו 6 מ"ל מהמדיום המוכן של mTeSR1 בתוספת מעכב ROCK. השעו בעדינות את התאים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 3-4 פעמים ולאחר מכן העבירו את התרחיף לשאר מדיום מעכב mTeSR1/ROCK בתוך צינור ה-50 מ"ל. השעו במרץ 4-5 פעמים וספרו את התאים באמצעות המציטומטר.
    10. שאפו את ה-ECM מלוח 24 הבארות ממש לפני ציפוי התאים. השעו את התאים שוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 2-3 פעמים והוציאו 0.5 מ"ל מתרחיף התאים בכל באר.
      הערה: צפיפות הציפוי האופטימלית צריכה להיקבע על ידי הנסיין. כאן, מספר התאים האופטימלי הוא 80,000-200,000 תאים לבאר.
    11. נדנד בעדינות את הצלחת 3 פעמים בכיוון השעון, 3 פעמים נגד כיוון השעון, 3 פעמים קדימה ואחורה, ו -3 פעמים מצד לצד כדי לפזר את התאים באופן שווה.
    12. מעבירים את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ודוגרים למשך 24 שעות.
      הערה: אל תפריע לצלחת בשעות הראשונות כדי להבטיח פיזור תקין של תאים בתוך הבארות.
    13. אחרי 24 שעות (איור 2A), שאפו את המדיום המשומש, הוסיפו 0.5 מ"ל לבאר של mTeSR1, דגרו שוב ב-37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 למשך 24 שעות (איור 2B), ואז המשיכו לשלב הבא.
  3. התמיינות של אנדודרם סופי (DE) מ-hPSCs
    1. בצינור חרוטי של 15 מ"ל, הוסף 13 מ"ל של מדיום Activin Day 1 (ראה טבלת החומרים), 13 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל Activin A, ו-1.95 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל BMP4. מחממים את המדיום באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    2. שאפו את מדיום mTeSR1 מצלחת 24 הבארות והוסיפו 0.5 מ"ל של מדיום Activin Day 1 לכל באר. מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ודוגרים למשך 24 שעות. בדוק את התאים לאחר 24 שעות.
      הערה: מוות תאים נרחב אמור להיות ניכר, כפי שמתואר באיור 2C. למרות שהחד-שכבתי תיראה דלילה, מושבות התאים יתרחבו.
    3. הכן את המדיום השלם של Activin Day 2 על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל Activin A ל-12.5 מ"ל של מדיום Activin Day 2 בצינור חרוטי של 15 מ"ל. הנח את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    4. הוצא את צלחת הבידול של 24 בארות מאינקובטור CO2 והסר את המדיום המושקע. יש להוציא 0.5 מ"ל של מדיום Activin Day 2 שחומם מראש לכל באר ולהחזיר את הצלחת לתוך חממת CO2 למשך 24 שעות.
      הערה: יש לנקוט בזהירות בעת חלוקת המדיום. אין להוציא מדיום ישירות במרכז הבאר, מכיוון שהדבר ינתק תאים בשכבה החד-שכבתית. מחלקים בזהירות מדיום בצד הבאר. למחרת נוצרת שכבה אחת של תאים עם מוות תאים זניח. התאים אמורים להיות כעת ~90 עד 95% מתכנסים (איור 2D).
    5. הכן את המדיום השלם של Activin Day 3 על ידי הוספת 12.5 מיקרוליטר של 100 מיקרוגרם/מ"ל Activin A ל-12.5 מ"ל של מדיום Activin Day 3 בצינור חרוטי של 15 מ"ל. הנח את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
    6. הסר את המדיום המושקע והוציא 0.5 מ"ל של מדיום Activin Day 3 לבאר.
      הערה: יש לנקוט בזהירות בעת חלוקת המדיום. אין להוציא מדיום ישירות במרכז הבאר מכיוון שהדבר ינתק תאים בשכבה החד-שכבתית. מחלקים בזהירות מדיום בצד הבאר. למחרת, החד-שכבתי אמורה להגיע למפגש מלא עם מעט או ללא מוות תאים בשלב זה. אל תנסה ליצור ספרואידים באמצע המעי האחורי אם השכבה החד-שכבתית אינה מתכנסת 24 שעות לאחר הוספת מדיום Activin Day 3. עיין באיור 2E למורפולוגיה האידיאלית של שכבת ה-DE החד-שכבתית לפני שתמשיך ליצירת הספרואידים באמצע המעי האחורי.
    7. בצע צביעה אימונופלואורסצנטית (IF) של החד-שכבתי לביטוי חלבון A2 של קופסת המזלג (FOXA2) וגורם שעתוק תיבה 17 (SOX17) של אזור קביעת המין Y (SRY) בעת אופטימיזציה של התמיינות DE.
  4. התמיינות של DE לספרואידים באמצע המעי האחורי
    1. בצינור חרוטי של 50 מ"ל, הוסף 25 מ"ל של מדיום אינדוקציה באמצע המעי האחורי עם FGF4 (ללא CHIR99021) והנח אותו באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
    2. כדי להכין את מדיום האינדוקציה השלם באמצע המעי האחורי, הוסף 7.5 מיקרוליטר CHIR99021 לאחר שהמדיום חם.
    3. הסר את המדיום המושקע, חלק 0.5 מ"ל של מדיום אינדוקציה באמצע המעי האחורי לבאר ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
    4. לאחר שהתרחש עיבוי של תאים בתוך החד-שכבתי למחרת (איור 3A), החלף את המדיום המושקע במדיום אינדוקציה טרי באמצע המעי האחורי והנח את הצלחת בחזרה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
      הערה: מבנים צינוריים יורגשו לאחר 48 שעות של אינדוקציה באמצע המעי האחורי, כפי שמוצג באיור 3B. ספרואידים באמצע המעי האחורי יתחילו לנבוט מהחד-שכבתי ביום השלישי, כפי שמתואר באיור 3C.
    5. כדי להימנע מהשלכת הספרואידים הצפים בזמן החלפת המדיום, העבירו את המדיום הישן לצינור של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך דקה. השעו מחדש את הספרואידים ב-12.5 מ"ל של מדיום אינדוקציה טרי באמצע המעי האחורי, הוסיפו 0.5 מ"ל לבאר לאותה צלחת של 24 בארות, ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 24 שעות.
    6. ביום הרביעי של אינדוקציה במעי האחורי (איור 3D), קצרו ספרואידים צפים מבארות הצלחת על ידי איסוף המדיום לתוך צינור של 15 מ"ל ואחריו צנטריפוגה ב-300 × גרם למשך דקה אחת. המשך לשלב הבא להטמעת ספרואידים באמצע המעי האחורי ב-ECM.
  5. ציפוי ודפוס של ספרואידים אמצעיים/אחוריים ב-ECM
    1. הפשירו את מטריצת קרום הבסיס ECM ב-4 מעלות צלזיוס למשך הלילה לפני ההטמעה.
      הערה: ECM זה שונה מה-ECM המוסמך hESC. יש לשים את ה-ECM על קרח, וניתן להכניס את הנפח המתאים של ECM לצינורות מיקרו-צנטריפוגה מקוררים מראש של 1.5 מ"ל על קרח. טבלה 1 מכילה מידע על נפח ECM. ודא שנפח ה-ECM הוא לפחות 75% בטיפה שבה יוטבעו הספרואידים.
    2. מחממים צלחת של 24 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
    3. אוספים את הספרואידים הצפים מכל 24 הבארות באמצעות פיפט של 1000 מיקרוליטר ומעבירים אותם לצינור חרוטי של 15 מ"ל. סובב את הספרואידים בחום של 300 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר. שאפו את רוב המדיום אך השאירו את הנפח הנדרש לציפוי (טבלה 1).
    4. הכן קצות פיפטה של 1000 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר על ידי חיתוך קצותיהם. הוצא את הצלחת המחוממת מראש של 24 בארות.
    5. מערבבים את הספרואידים הצפים, מעבירים את הנפח המתאים לצינור ה-ECM המונח על קרח, ולאחר מכן משהים מחדש את הספרואידים וה-ECM על ידי פיפטינג כדי לערבב אותם היטב.
    6. קח 65 מיקרוליטר מתערובת הספרואידים וה- ECM עם קצות הפיפטה החתוכים של 200 מיקרוליטר והעמיס למרכז כל באר בצלחת 24 הבארות. כדי לוודא שנוצרת טיפת ECM טובה, הרם את הפיפט בעדינות ובאטיות בזמן חלוקת התערובת.
      הערה: צלחת 30-100 ספרואידים לבאר.
    7. מעבירים בעדינות את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ומדגרים למשך 5 דקות.
    8. הפוך את הצלחת ודגירה למשך 15-25 דקות, מה שיעזור לטיפות ה-ECM לשמור על מבנה דמוי כיפה.
    9. במהלך הדגירה הכינו את המדיום הנדרש וחממו אותו. לאחר שה-ECM מתמצק, הוסף 0.5 מ"ל של מדיום דפוס HIO או HCO בכל באר ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. ראו איור 3E לתמונה של ספרואידים ב-ECM.
    10. תרבית את הספרואידים במדיום הדפוס למשך 3 ימים.
    11. לאחר 3 ימים, שנה את מדיום הגידול הרגיל או HCO למדיום הגידול הרגיל ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
      הערה: האורגנואידים בנקודת זמן זו (יום 10) הם אורגנואידים בשלב מוקדם. בהתבסס על מטרת הפרויקט, ניתן להשתמש בכמה אורגנואידים בשלב מוקדם לניתוח דפוסים מוקדמים, כמפורט בסעיף 2.
  6. צמיחה ומעבר של אורגנואידים במעי האנושי ובמעי הגס
    1. לאחר יום 10, שנה את אמצעי הגידול כל 3 ימים.
      הערה: בהתאם לצפיפות הציפוי ולצמיחת האורגנואידים, ייתכן שיידרשו שינויים תכופים יותר במדיה. יש לבצע שינויים בינוניים לפני שהפנול האדום (מחוון pH) במדיום הופך לצהוב.
    2. דגרו על האורגנואידים עד היום ה-21 (איור 3F).
      הערה: טיפול BMP2 יביא להפחתת מספר האורגנואידים (~פי 3 פחות מ-HIOs) הגדלים מספרואידים. לכן, יש לצפות מספר גדול יותר של ספרואידים ליצירת HCOs.
  7. פיצול אורגנואידים ביום ה-21
    1. בדוק את האורגנואידים.
      הערה: יש לפצל את האורגנואידים ביום ה-21 מכיוון שה-ECM כמעט מתפרק ביום ה-21 עקב צמיחה והתרחבות של אורגנואידים.
    2. הכן את קצות הפיפטה של 1000 מיקרוליטר ו-200 מיקרוליטר על ידי חיתוך קצותיהם.
    3. מחממים צלחת Nunc עם 24 בארות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
    4. ציטט את הנפח המתאים של ECM לצינורות 1.5 מ"ל מקוררים מראש (טבלה 1).
    5. מגרדים בעדינות את טיפת ה-ECM עם האורגנואידים עם קצה פיפטה של 1000 מיקרוליטר ופיפטה את התערובת למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לפרק את ה-ECM.
    6. מעבירים את התערובת לצלחת פטרי בקוטר 60 מ"מ ובודקים את האורגנואידים במיקרוסקופ. במידת הצורך, הפרד את האורגנואידים זה מזה באמצעות מלקחיים סטריליים. ודא שההפרדה אינה פוגעת באפיתל האורגנואידים.
    7. העבירו את האורגנואידים לצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך 30 שניות. שאפו את הסופרנטנט והשאירו ~1 מ"ל של מדיום בצינור.
      הערה: ניתן לשנות את עוצמת הקול של המדיום בהתאם למטרת הניסוי. אם נדרשים יותר אורגנואידים לכל טיפת ECM, ניתן להקטין את הנפח הבינוני. עם זאת, אם נדרשים פחות אורגנואידים, ניתן להגדיל את הנפח הבינוני.
    8. ערבבו היטב את האורגנואידים, העבירו את הנפח המתאים לצינור ה-ECM המונח על קרח, ולאחר מכן השעו מחדש את האורגנואידים וה-ECM על ידי פיפטינג כדי לערבב אותם היטב.
    9. הוסף 65 מיקרוליטר מתערובת הספרואידים וה-ECM למרכז כל באר של צלחת 24 הבארות באמצעות קצות הפיפטה החתוכים של 200 מיקרוליטר.
      הערה: זה קריטי לקחת תחילה את האורגנואידים ולאחר מכן את ה-ECM במהלך הפיפטינג. לפיכך, בזמן חלוקת התערובת, האורגנואידים נמצאים בחלק העליון של טיפת ה-ECM.
    10. הכניסו את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 למשך 5 דקות.
    11. הפוך את הצלחת למשך 15-25 דקות נוספות כדי לעזור לטיפות ה-ECM לשמור על מבנה דמוי כיפה.
    12. הוסף 0.5 מ"ל של מצע צמיחה HIO/HCO בכל באר ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
      הערה: מדיום הצמיחה זהה הן עבור HIO והן עבור HCOs לאחר דפוס.
    13. החלף את המדיום כל 2-3 ימים עד היום ה-35 (איור 3G).

2. אימות דפוס האורגנואידים על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית שעתוק הפוך (RT-qPCR)

  1. לפני איסוף RNA, הכינו מאגר ליזה RNA 1x בהתאם להוראות היצרן.
  2. השלך את המדיום המושקע והוסף 350 מיקרוליטר של מאגר ליזה לכל באר של צלחת 24 הבארות. ליזה את האורגנואידים על ידי פיפטה למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של 1 מ"ל. לקבלת ליזה טובה יותר, מערבולת לזמן קצר במהירות מרבית למשך 5 שניות.
  3. שמור את כל הדגימות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שהן מוכנות למיצוי RNA. לאחר שהן מוכנות, הוציאו את דגימות ה-RNA מהמקפיא של -80 מעלות צלזיוס והפשירו אותן על קרח למשך 10 דקות. מערבל את הצינורות במרץ בטמפרטורת החדר למשך 10-15 דקות כדי להבטיח ליזה מלאה של הדגימות.
  4. הניחו את הדגימות שוב על קרח והמשיכו למיצוי RNA לפי הוראות היצרן. העבירו את דגימות ה-RNA למקפיא של -80 מעלות צלזיוס אם לא מוכנים להמשיך לשלב הבא.
  5. בצע מיצוי RNA, טיפול ב-DNASE, סינתזת cDNA ו-RT-qPCR במתודולוגיה סטנדרטית. עיין בטבלה 2 לרשימה של שמות ורצפים של פריימרים.

3. אימות דפוס האורגנואידים על ידי אימונופלואורסצנציה

  1. איסוף וקיבוע של אורגנואידים
    1. שאפו מדיום HIO או HCO מהבארות המתאימות והוסיפו 1 מ"ל של מלח פוספט קר כקרח (PBS) לכל באר. נתק את האורגנואידים מה-ECM באמצעות קצה פיפטה חתוך של 200 מיקרוליטר. פיפטה למעלה ולמטה כדי לנתק נתחים גדולים של ECM מהאורגנואידים.
    2. העבירו את האורגנואידים לצינור חרוטי של 15 מ"ל ומלאו את שאר הצינור ב-PBS קר כקרח וערבבו בעדינות על ידי היפוך הצינור. אפשר לאורגנואידים להתיישב בכוח הכבידה ולשאוף את ה-PBS.
      הערה: אם האורגנואידים אינם מתיישבים בכוח הכבידה, צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 × גרם למשך דקה.
    3. שאפו את ה-PBS והוסיפו 1 מ"ל של תמיסה משפילה-ECM קרה כקרח. שמור את הצינור על קרח למשך 10-15 דקות על פלטפורמה מסתובבת עם ניעור עדין.
      הערה: הטה את הצינור בזווית של 45° כדי לאפשר ערבוב נכון של האורגנואידים ותמיסת התא. לאחר 10-15 דקות, האורגנואידים צריכים להתיישב בתחתית הצינור, מה שמעיד על עיכול מלא של ה- ECM.
    4. הוסף PBS קר בצינור עד 15 מ"ל; מערבבים היטב על ידי היפוך הצינור מספר פעמים. כאשר האורגנואידים מתיישבים בתחתית הצינור, שאפו את ה-PBS והוסיפו 1 מ"ל של פרפורמלדהיד 4% מקורר מראש כדי לתקן את האורגנואידים. דגרו את האורגנואידים עם 4% פרפורמלדהיד על קרח למשך שעה.
    5. מלאו את שאר הצינור ב-PBS קר כקרח והניחו אותו אופקית על משטח נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, השלך את הפרפורמלדהיד/PBS למיכל הפסולת שצוין ושטוף פעם אחת עם 15 מ"ל PBS קר כקרח, כמתואר בשלב 3.1.2.
    6. שאפו את ה-PBS ומלאו את הצינור ב-30% סוכרוז ב-PBS. הנח את הצינור בצורה אופקית על משטח נדנדה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    7. למחרת, הטמיעו את האורגנואידים בדגם בסיס של 7 מ"מ x 7 מ"מ x 5 מ"מ עם מדיום OCT והקפאת בזק באמצעות אמבט קרח יבש/אתנול.
    8. מייבשים את הבלוקים במגבוני מעבדה, עוטפים אותם במגבת נייר ושומרים במקפיא בטמפרטורה של -80 מעלות למשך הלילה. למחרת, חתכו קטעים של 5 מיקרומטר על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות קריוסטט. אחסן את השקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  2. צביעה אימונופלואורסצנטית של האורגנואידים
    1. עבד את השקופיות מהמקפיא -80 מעלות צלזיוס ובצע צביעת IF באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים.
    2. מרחו כיסויים על השקופיות וייבשו אותם בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור למשך שעתיים לפחות או לילה לפני ההדמיה.
    3. דמיין את השקופיות באמצעות מטרה של פי 25 של מיקרוסקופ קונפוקלי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

היצירה המוצלחת של ספרואידים בשלב האינדוקציה האמצעית/אחורית מעידה על דפוס מוצלח. בצע צביעת IF עבור CDX2 על ספרואידים צפים ועל החד-שכבתי כדי לאשר שהדפוס נכון. למרות שצביעה בשלב האנדודרם הסופי (DE) יכולה להצביע על היעילות של אינדוקציה DE, יצירת ספרואידים אינה אפשרית ללא אינדוקציה יעילה של DE. כדי לבדוק את היעילות של אינדוקציה DE, בצע צביעת IF ו/או RT-qPCR עבור FOXA2 ו-SOX17.

לאחר שלב הדפוס, הביטוי של גורמי HOX הוא האינדיקטור הטוב ביותר לדפוס מוצלח. גורמי HOX באים לידי ביטוי בעיקר במזנכימה של המעי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

הבידול של hPSCs ל-HIO ו-HCOs הוא תהליך מורכב הדורש בקרות איכות בכל שלב. ה-hPSCs ההתחלתיים צריכים להיות בעלי התמיינות מינימלית לפני שהם מתחילים התמיינות ל-DE. אופטימיזציה של הצפיפות של hPSCs המצופים עבור התמיינות DE היא קריטית להצלחת הפרוטוקול. כדי להבטיח את איכות הבידול של DE, בצע IF עבור FOXA2 ו-SOX17 כדי לקבוע את היעילות של בידול DE. התמיינות DE אמורה לגרום לכך שלמעלה מ-80% מהתאים המטופלים יהיו חיוביים ל-FOXA2 ו-SOX17. לאחר קביעת הצפיפות האופטימלית, ניתן להשתמש באותה צפיפות למספר ניסוי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מעבדת Múnera ממומנת על ידי NIH/NCI 5U54CA210962-02 מרכז המחקר של פערי הסרטן בדרום קרוליינה (SC CADRE), NIH/NIGMS P20 GM130457-01A1 COBRE במחלות עיכול וכבד, ומרכז הליבה לחקר מחלות עיכול של NIH/NIDDK 1P30 DK123704-01 MUSC.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
תמיסת אלבומין בסרום בקר (BSA) 1%לא ישיםלא ישיםלא ישים
צינור קורנינג 15 מ"לבז21008-918לא ישים
30% סוכרוזלא ישיםלא ישיםמיוצר ב-PBS.
5% סרום חמור רגילמעבדת ג'קסון למחקר חיסוני017-000-121לא ישים
צינור קורנינג 50 מ"לבז21008-951לא ישים
אקוטאזתרמו סיינטיפיקA1110501פתרון ניתוק תאים; מכסים 5 מ"ל של Accutase לתוך צינורות של 10 מ"ל בסך הכל 20 צינורות ומאחסנים בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד 6 חודשים. מניחים ב-4 מעלות; C למשך הלילה לפני השימוש.
אקטיב אמערכות הנחיית תאיםGFH6-100x10להרכיב מחדש את האבקה הליופילית ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-PBS סטרילי המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA). Aliquot 38 & L של Activin A לתוך צינורות מיקרו-צנטריפוגה מקוררים מראש ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות; C (תוקף הצינורות פג 12 חודשים מיום קבלתם).
אקטיווין יום 1 בינוני (RPMI 1640)קורנינגMT10041CVהשתמש בחומצות אמינו לא חיוניות (NEAA, Corning 11140050) ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. יום בסיסי 1 בינוני: 500 מ"ל RPMI 1640 ו-500 מ"ל NEAA. בעת הכנת Activin Day 1 medium, הוסף 13 מ"ל של יום בסיסי 1 בינוני, 13 ומיקרו; l של Activin A (100 ומיקרו; גרם/מ"ל), ו-2 ומיקרו; l של BMP4 (100 ומיקרו; גרם/מ"ל). מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.
אקטיב יום 2 בינוני (RPMI 1640, 0.2% נפח/נפח FBS)שיקלוןSH30070.03Tהשתמש בחומצות אמינו לא חיוניות (Corning 11140050) ואחסן בטמפרטורה של 4&0 מעלות צלזיוס. יום בסיסי 2 בינוני: 500 מ"ל RPMI 1640, 500 מ"ל NEAA ו-1 מ"ל של 0.2% סרום. בעת הכנת Activin Day 2 בינוני, יש להוסיף 12.5 מ"ל של יום 2 בינוני בסיסי ו-12.5 ומיקרו; ליטר אקטיבין A (100 ומיקרו; גרם/מ"ל). מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.
Activin יום 3 בינוני (RPMI 1640, 2% FBS vol/vol)שיקלוןSH30070.03Tהשתמש בחומצות אמינו לא חיוניות (Corning 11140050) ואחסן בטמפרטורה של 4&0 מעלות צלזיוס. יום בסיסי 3 בינוני: 500 מ"ל RPMI 1640, 500 מ"ל NEAA ו-10 מ"ל של סרום 2%. בעת הכנת Activin Day 3 medium, הוסיפו 12.5 מ"ל של יום 3 בסיסי ו-12.5 ומיקרו; ליטר אקטיבין A (100 ומיקרו; גרם/מ"ל). מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.
Alexa Fluor 488 חמור נגד עזיםתרמו סיינטיפיקA11055דילול 1:500 (נוגדן משני)
Alexa Fluor 488 חמור נגד ארנבתרמו סיינטיפיקא21206דילול 1:500 (נוגדן משני)
Alexa Fluor 546 חמור נגד עכברתרמו סיינטיפיקא10036דילול 1:500 (נוגדן משני)
Alexa Fluor 647 חמור נגד עכברתרמו סיינטיפיקA31571דילול 1:500 (נוגדן משני)
תבנית בסיספישר22-363-552לא ישים
מדיום מעיים בסיסי (DMEM מתקדם)ג'יבקו12491015  בעת הכנת מדיום מעיים בסיסי, יש להוסיף 500 מ"ל של DMEM, 500 מ"ל של N2 (Gibco 17-502-048), 500 מ"ל של B27 (Gibco), 500 מ"ל של L-גלוטמין כדי לקבל 2 מ"ל L-גלוטמין (Corning A2916801), 5 מ"ל של 100 U/mL פניצילין-סטרפטומיצין (Gibco 15-140-122), ו-7.5 מ"ל של  1 מיליון HEPES כדי לקבל 15 מ"מ HEPES.  מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.
Biorad CFX96 מערכת מגע לגילוי PCR בזמן אמתביורדלא ישיםניתן להשתמש במערכות qRT-PCR אחרות.
פתרון לשחזור תאיםקורנינג354253פתרון משפיל ECM
CHIR99021רפרוסל4000410להקים מחדש על ידי הוספת 2.15 מ"ל של DMSO ב-10 מ"מ. הכן 50 ומיקרו; L aliquots ומאחסנים ב-20 °C.  יש לאחסן את האבקה בטמפרטורה של 4 מעלות; C, מוגן מפני אור.
מדיום דפוס CTRL HIOלא ישיםלא ישיםמעיים בינוניים בסיסיים ו-100 ננוגרם/מ"ל EGF.
DAPIסיגמא-אולדריץ'D9542דילול 1:100 (נוגדן משני)
DE חד-שכבתילא ישיםלא ישיםחד-שכבתי נוצר בשלבים קודמים (סעיף 4.4).
Dispaseג'יבקו17105041יש להשעות מחדש את האבקה הליופילית ב-DMEM מתקדם (Gibco MT15090CV) לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל. סנן את התמיסה לעיקור על ידי שאיבת אבק באמצעות צינור עיקור מסנן Millipore. הכינו 10 מ"ל (1 מ"ג/מ"ל) ואחסנו בטמפרטורה של -20 מעלות; C עד 6 חודשים. מניחים ב-4 מעלות; C למשך הלילה לפני השימוש.
EGFתרמו סיינטיפיק236-EG-01Mבעת הכנת 100 ננוגרם/מ"ל EGF להרכיב מחדש 500 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-PBS סטרילי. לאחר מכן, הוסף 2 מ"ל של PBS סטרילי ל-1 מ"ג EGF ועשה 500 ומיקרו; תמיסת EGF של גרם/מ"ל. Aliquot 100 µ L של EGF ב -20 צינורות.
פישרברנד 6 ס"מ צלחות פטרי עם מכסה שקוףפישרFB0875713Aלא ישים
מרים תאים פישרברנדפישר08-100-240לא ישים
בקבוקוני הברגה מזכוכית שקופה של פישרברנד Class B עם סגירות מחוברותפישר03-338בלא ישים
פיפטת פסטר זכוכית בורוסיליקט חד פעמיתפישר13-678-2D0לא ישים
Fluoromount G מדיום הרכבה לשקופיותVWR100241-874לא ישים
ג'יבקו DMEM מתקדםג'יבקו12-491-023לא ישים
עז אנטי-E-Cadherinמו"פ מערכות DAF648דילול 1:400 (נוגדן ראשוני)
עיזים נגד SOX17מו"פ מערכות DAF1924דילול 1:500 (נוגדן ראשוני)
מדיום דפוס HCOsלא ישיםלא ישיםמדיום מעיים בסיסי, 100 ננוגרם/מ"ל EGF ו-100 ננוגרם/מ"ל BMP2. בעת הכנת BMP2, הוסף 1 מ"ל של 4 מ"מ HCl 0.1% BSA סטרילי לבקבוקוני BMP2 (100 ומיקרו; ז). Aliquot 25 µ L של תמיסת BMP4 ב-4 צינורות.  מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.
המוציטומטרסיגמא-אולדריץ'Z359629לא ישים
תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC)מתקן תאי גזע פלוריפוטנטייםלא ישיםתאים שנזרעו בצלחת מצופה מטריג'ל עם 24 בארות (Thermo Scientific 73520-906).
תמיסת פרפורמלדהיד 4% קרה כקרח (PFA)לא ישיםלא ישיםלא ישים
מי מלח פוספט קר כקרח (PBS)לא ישיםלא ישיםה-pH חייב להיות 7.4.
עט מחסום הידרופובי ImmEdgeמעבדות וקטור101098-065לא ישים
תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)מתקן תאי גזע פלוריפוטנטיים (המרכז הרפואי של בית החולים לילדים בסינסינטי)לא ישיםניתן להשתמש בקווי hESC או iPSC אחרים, אך יש לבצע אופטימיזציה של הפרוטוקול עבור כל קו תאים.
מיקרוטום לייקהלא ישיםלא ישיםלא ישים
LSM 880מיקרוסקופ קונפוקלי
מטריצת קרום מרתף Matrigelקורנינג354234לא ישים
מטריצה מוסמכת hESC של Matrigelקורנינג354277הכינו 4 x מטריג'ל aliquots המתאימים לנפחים המספיקים להכנת מספיק מטריג'ל מדולל ל-4 x 6 בארות.
מדיום אינדוקציה באמצע המעי האחורי (RPMI 1640)קורנינגMT10041CVחומצות אמינו לא חיוניות (Corning 11140050), 2% נפח/נפח FBS (Hyclone SH30070.03T), 3 ומיקרו; M CHIR99021 ו-500 ננוגרם/מ"ל FGF4. מדיום הבסיס יציב עד 3 שבועות אך יש להשתמש בו מיד לאחר הוספת גורמי גדילה.
ספרואידים באמצע המעי האחורילא ישיםלא ישיםלא ישים
MilliporeSigma Steriflip יחידות מסנן ואקום חד פעמיות סטריליותמיליפורסיגמאSCGP00525לא ישים
עכבר נגד CDX2ביוג'נקסMU392-UCדילול 1:300 (נוגדן ראשוני)
עכבר אנטי-FOXA2אבנובה/נובוסH00003170-M01דילול 1:500
מדיום גידול מלא mTeSR1טכנולוגיות תאי גזע85870הוסף 100 מ"ל של תוסף mTeSR (85870) למדיום mTeSR אחד של 400 מ"ל (85870) ומנה לתוך צינורות של 50 מ"ל תוך הימנעות מזיהום. יש לאחסן בטמפרטורה של 4&00 מעלות; C עד השימוש.
הפתרון הקליר של מוריי (הידוע גם בשם BABB)של מוריילא ישים1:2 בנזיל בנזואט ובנזיל אלכוהול.
מדיום דפוס NOG HIOלא ישיםלא ישיםמדיום מעיים בסיסי, 100 ננוגרם/מ"ל EGF ו-100 ננוגרם/מ"ל NOGGIN (דיספציה 25 ומיקרו; גרם של NOGGIN ב-250 ומיקרו; l PBS סטרילי עם 0.1% BSA).
NucleoSpin RNAטאקארה740955.25ניתן להשתמש בערכות בידוד RNA אחרות.
צלחת תרבית רקמות פני השטח של דלתא Nunclon 24 בארות (Nunc)תרמו סיינטיפיק73521-004לא ישים
צלחת תרבית רקמות פני השטח של Nunclon דלתא 24 בארות מצופות במטריג'לתרמו סיינטיפיק73521-004לא ישים
צלחת תרבית רקמות פני השטח של דלתא Nunclon 6 בארות (Nunc)תרמו סיינטיפיק73520-906לא ישים
צלחת תרבית רקמות משטח דלתא Nunclon 6 בארות מצופות ב  מטריגל.תרמו סיינטיפיק73520-906לא ישים
מצע צמיחה עבור HIOs, CTRL HIO ו-HCOsלא ישיםלא ישיםמדיום מעיים בסיסי ו-100 ננוגרם/מ"ל EGF (ריכוז סופי)
חוצץ פוספט מלוח, 0.5% טריטון X (PBS-T)לא ישיםלא ישיםלא ישים
פריימריםטכנולוגיות DNA משולבות בע"מ (IDT)לא ישיםהפריימרים מופיעים בטבלה 2 בפרוטוקול.
ארנב נגד CDX2סמל תאEPR22764Yדילול 1:100 (נוגדן ראשוני)
ארנב אנטי-SATB2סמל תאEP281דילול 1:100 (נוגדן ראשוני)
חלבון BMP-4 אנושי רקומביננטימו"פ מערכות D314 -BP-010להרכיב מחדש את האבקה הליופילית ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-4 מ"מ HCl סטרילי המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר (BSA). הוסף תמיסת HCl של 4.17 מ"ל ל-45.83 מ"ל מים מולקולריים בסך הכל 50 מ"ל של 1 M HCl. לאחר מכן הוסף 200 ומיקרו; L של 1 M HCl עד 49.8 מ"ל של מים בדרגה מולקולרית בסך הכל 50 מ"ל של 4 מ"מ HCl. לאחר מכן, הוסף 0.05 גרם BSA ל-50 מ"ל של 4 מ"מ HCl וסנן כדי להפוך לסטרילי. Aliquot סטרילי 4 מ"מ HCl 0.1% BSA עד 33 צינור מיקרו-צנטריפוגה בסך הכל ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס. הוסף 100 µ l של 4 מ"מ HCl סטרילי 0.1% BSA לבקבוקוני BMP4 (10 ומיקרו; ז) לייצר תמיסת BMP4 ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל.
חלבון FGF-4 אנושי רקומביננטימו"פ מערכות D235-F4-01Mלהקים מחדש ב-100 ומיקרו; גרם/מ"ל ב-PBS סטרילי המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר. הוסף 0.05 גרם BSA ב-50 מ"ל PBS כדי ליצור 0.1% BSA. סינון 0.22 ומיקרו; M BSA כדי לעקר את ה-BSA. Aliquot 10 מ"ל של 0.1% BSA ב-5 צינורות. הוסף 1 מ"ג FGF-4 ב-10 מ"ל של 0.1% BSA סטרילי. Aliquot 250 µ L לתוך 40 צינורות מיקרו-צנטריפוגה מקוררים מראש ומאחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
מעכב ROCK Y-27632טוקריס1254הריכוז הסופי הוא 10 מ"מ (10 ממול/ליטר). השעו מחדש ב-DMSO ב-10 מ"מ ועיקרו מסנן. הוסף 3 מ"ל PBS סטרילי לכל בקבוקון. Aliqout 100 ומיקרו; L של מעכב ROCK ב-30 צינורות ומאחסנים ב-20 מעלות צלזיוס.
ערכת סינתזה של SuperScript VILO cDNAתרמו סיינטיפיק11-754-250לא ישים
שקופיות מיקרוסקופ SuperFrost Plus
תרכובת Tissue Tek O.C.TVWR25608-930לא ישים

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Montgomery, R. K., Mulberg, A. E., Grand, R. J. Development of the human gastrointestinal tract: twenty years of progress. Gastroenterology. 116 (3), 702-731 (1999).
  2. Beumer, J., et al. High-resolution mRNA and secretome atlas of human enteroendocrine cells. Cell. 181 (6), 1291-1306 (2020).
  3. van Klinken, B. J., et al. MUC5B is the prominent mucin in human gallbladder and is also expressed in a subset of colonic goblet cells. American Journal of Physiology. 274 (5), Pt 1 871-878 (1998).
  4. Escande, F., Porchet, N., Aubert, J. P., Buisine, M. P. The mouse Muc5b mucin gene: cDNA and genomic structures, chromosomal localization and expression. Biochemical Journal. 363, Pt 3 589-598 (2002).
  5. Lau, S. T., et al. Activation of hedgehog signaling promotes development of mouse and human enteric neural crest cells, based on single-cell transcriptome analyses. Gastroenterology. 157 (6), 1556-1571 (2019).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. Munera, J. O., et al. Differentiation of human pluripotent stem cells into colonic organoids via transient activation of BMP signaling. Cell Stem Cell. 21 (1), 51-64 (2017).
  8. Higuchi, Y., et al. Gastrointestinal fibroblasts have specialized, diverse transcriptional phenotypes: a comprehensive gene expression analysis of human fibroblasts. PLoS One. 10 (6), 0129241(2015).
  9. Yahagi, N., et al. Position-specific expression of Hox genes along the gastrointestinal tract. Congenital Anomalies. 44 (1), 18-26 (2004).
  10. Sarvestani, S. K., et al. Induced organoids derived from patients with ulcerative colitis recapitulate colitic reactivity. Nature Communications. 12 (1), 262(2021).
  11. Holloway, E. M., et al. Differentiation of human intestinal organoids with endogenous vascular endothelial cells. Developmental Cell. 54 (4), 516-528 (2020).
  12. Britanova, O., et al. Satb2 is a postmitotic determinant for upper-layer neuron specification in the neocortex. Neuron. 57 (3), 378-392 (2008).
  13. Jaitner, C., et al. Satb2 determines miRNA expression and long-term memory in the adult central nervous system. Elife. 5, 17361(2016).
  14. Teo, A. K., et al. Activin and BMP4 synergistically promote formation of definitive endoderm in human embryonic stem cells. Stem Cells. 30 (4), 631-642 (2012).
  15. Fordham, R. P., et al. Transplantation of expanded fetal intestinal progenitors contributes to colon regeneration after injury. Cell Stem Cell. 13 (6), 734-744 (2013).
  16. Tamminen, K., et al. Intestinal commitment and maturation of human pluripotent stem cells is independent of exogenous FGF4 and R-spondin1. PloS One. 10 (7), 0134551(2015).
  17. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nature Medicine. 23 (7), 878-884 (2017).
  18. Lees, E. A., et al. Using human induced pluripotent stem cell-derived intestinal organoids to study and modify epithelial cell protection against Salmonella and other pathogens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59478(2019).
  19. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).
  20. Jung, K. B., et al. Interleukin-2 induces the in vitro maturation of human pluripotent stem cell-derived intestinal organoids. Nature Communications. 9 (1), 3039(2018).
  21. Woo, D. H., et al. Enhancing a Wnt-telomere feedback loop restores intestinal stem cell function in a human organotypic model of dyskeratosis congenita. Cell Stem Cell. 19 (3), 397-405 (2016).
  22. Sommer, C. A., et al. Modeling APC mutagenesis and familial adenomatous polyposis using human iPS cells. PLoS One. 13 (7), 0200657(2018).
  23. McCauley, H. A., et al. Enteroendocrine cells couple nutrient sensing to nutrient absorption by regulating ion transport. Nature Communications. 11 (1), 4791(2020).
  24. Zhang, X., et al. A comprehensive structure-function study of neurogenin3 disease-causing alleles during human pancreas and intestinal organoid development. Developmental Cell. 50 (3), 367-380 (2019).
  25. Kumar, N., et al. The lineage-specific transcription factor CDX2 navigates dynamic chromatin to control distinct stages of intestine development. Development. 146 (5), (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pluripotent Stem CellsIntestinal OrganoidsColonic OrganoidsHuman Intestinal OrganoidsHuman Colonic OrganoidsBMP SignalingRegional SpecificationSATB2 ExpressionEpithelial Cell TypesMesenchymal Cells

Related Articles