כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 C. elegans והדמיה של פעילות שעתוק במערכת במבחנה .
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה
במאמר זה
סיכום
תקציר
Caenorhabditis elegans היה מערכת מודל חשוב למחקר ביולוגי מאז הוצג בשנת 1963. עם זאת, C. elegans לא נוצל באופן מלא במחקר הביוכימי של תגובות ביולוגיות באמצעות תמציות גרעיניות שלה כגון תמלול במבחנה ושכפול DNA. משוכה משמעותית לשימוש C. elegans במחקרים ביוכימיים היא לשבש את החתך החיצוני העבה של הנמטודה מבלי להקריב את הפעילות של התמצית הגרעינית. בעוד מספר שיטות משמשות כדי לשבור את הקיטור, כגון הומוגניזציה Dounce או sonication, הם לעתים קרובות להוביל חוסר יציבות חלבון. אין פרוטוקולים מבוססים לבידוד חלבונים גרעיניים פעילים מזחלים או C. elegans למבוגרים לתגובות במבחנה . כאן, הפרוטוקול מתאר בפירוט את ההומוגניזציה של שלב זחל 4 C. elegans באמצעות הומוגניזר Balch. ההומוגניזר הבלץ' משתמש בלחץ כדי לאלץ את בעלי החיים באיטיות לעבור פער צר ששובר את הקיטור בתהליך. העיצוב האחיד והעיצוב המדויק של ההומוגניזר בלך מאפשרים שחיקה עקבית של בעלי חיים בין ניסויים. פירוק ההומוגנית המתקבלת מההומוגניזר Balch מניבה תמצית גרעינית פעילה מבחינה תפקודית שניתן להשתמש בה בשיטת מבחנה לבדיקת פעילות שעתוק של C. elegans.
מבוא
הנמטודה הקטנה, החיה החופשית Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם מודל פשוט אך רב עוצמה לטיפול במגוון רחב של שאלות ביולוגיות. מאז הצגתו בשנת 1963, הנמטודות היו יקרות ערך לענות על שאלות נוירוביולוגיה, חילוף החומרים, הזדקנות, התפתחות, חסינות, וגנטיקה1. חלק מהמאפיינים הרבים של החיה שהופכים אותו לאורגניזם מודל אידיאלי כוללים זמן דור קצר, האפקטיביות של הפרעות RNA, גוף שקוף, ואת המפות הושלמו של שושלת התאים שלה ומערכת העצבים.
בעוד שתרומת הנמטודה למדע היא עצומה, הם נוצלו פחות כדי להדגיש את מערכת התמלול האוקריוטית, כאשר רוב הבנתנו לגבי מנגנונים אלה מגיעה ממחקרים המשתמשים בתמצית גרעינית של שמרים, זבובי פירות ותרבות תאי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. הכנות לתקשורת
- הכן צלחות אגר ציר ליסוגניים סטריליות (LB) ומדיה נוזלית בהתאם להוראות היצרן.
- פס Escherichia coli (E. coli) זן OP50 על צלחת אגר LB. לדגור את פס החיידקים ב 37 °C (50 °F) לילה.
- אחסן את צלחת פס E. coli OP50 ב 4 °C (7 °F) לאחר הדגירה. צלחת E. coli OP50 ניתן לאחסן בבטחה ב 4 °C (70 °F) במשך 2 שבועות אם עטוף parafilm כדי למנוע אובדן לחות.
- הכן 2 L של נמטודה צמיחה מדיה (NGM) באמצעות המתכון בטבלה 1.
הערה: Nystatin הוא אופציונלי. Nystatin מסייע במניעת עובש, ומזהמים פטרייתיים אחרים מגידול על לוחות NGM. לוחות גדולים בקוטר 150 מ"מ יש סיכוי גבוה יותר לתפוס נבגים פטרייתיים כ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
בעקבות הצעדים המתוארים אמור להניב תמצית גרעינית תפקודית (איור 1),סטייה בשלבי השחיקה או הכביסה עלולה להוביל לפעילות לקויה או לתפוקות נמוכות. אם תתקבל תמצית גרעינית פונקציונלית C. elegans , זה יהיה לתמלל את האזור במורד הזרם של מקדם CMV על תבנית ה- DNA כאשר נוסף במבחנה שתוארה בעבר במבחנה. ניתן לטהר את תעתיק הרנ"א שנוצר מחלבונים גרעיניים ומתבנית DNA בשיטות קונבנציונליות. ללא ה- DNA של התבנית, שעתוק הפוך ומוצר PCR עוקב יכולים להיות רק תוצאה של ה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
C. elegans הוא אורגניזם מודל מושך ללמוד את מערכת התמלול האוקריוטית בגלל התחזוקה הזולה שלה ואת הקלות של מניפולציה גנטית. כאן פרוטוקול לבידוד עקבי של תמצית גרעינית פעילה מבחינה תפקודית מ L4 C. elegans מתואר. למרות שפרוטוקול זה התמקד בהדמיית פעילות התמלול, ניתן לכמת את ה- cDNA שהופק לאחר שעתוק באמצעות RT-qPCR כדי לקבל מדידה מדויקת יותר של פעילות התמלול8. שיטה זו של בידוד חלבונים גרעיניים מ C. elegans יכול לעזור להרחיב את המחקר של מכונות שעתוק אאוקריוטי. מאז C. elegans
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין אינטרסים מתחרים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענק NIH MIRA (R35GM124678 ל- J. S. ).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| <חזק>חומרים מתכלים וריאגנטים | |||
| 0.2 מ"ל צינורות 8 רצועות & כובעי רצועה שטוחים, Clear | Genesee Scientific | 24-706 | |
| 0.2 מ"ל צינורות PCR בודדים | Genesee Scientific | 24-153G | |
| 1.7 מ"ל מיקרו-צינורות סטריליים | Genesee Scientific | 24-282S | |
| 100% אתנול בדרגה מולקולרית מוחלטת | פישר סיינטיפיק | BP2818 | |
| 100% אתנול, Koptec | Decon Labs | V1001 | |
| פיפט סרולוגי 10 מ"ל | VWR בינלאומי | 89130-898 | |
| לוחות פטרי 150 מ"מ | Tritech Research | T3325 | |
| צינורות צנטריפוגה חרוטיים 15 מ"ל | Genesee Scientific | 28-103 | |
| מזרקי פלסטיק 20 מ"ל | Fisher Scientific | 14955460 | |
| 2 מ"ל מזרקי Norm-Ject | Henke-Sass Wolf GmbH | 4020 | |
| 500 מ"ל מסנן ואקום 0.22 ומיקרו; m PES, Stericup Millipore Express Plus | Millipore Sigma | SCGPU10RE | |
| צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ל | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| 50 מ"ל צינור סרולוגי | VWR בינלאומי | 89130-902 | |
| 5 מ"ל פיפט סרולוגי | VWR בינלאומי | 89130-896 | |
| אגר, קריטריון | VWR International | C7432 | |
| אגרוז | דנוויל סיינטיפיק | CA3510-6 | |
| טוש הוכחת אלכוהול | VWR International | 52877-310 | |
| בקטו פפטון | VWR בינלאומי | 90000-264 | |
| Caenorhabditis elegans | CGC | N2 | |
| סידן דיכלוריד | Millipore Sigma | C4901 | |
| כולסטרול | Millipore סיגמא | C8667 | |
| בקרת פריימרים לשיבוט מקדש DNA, קדימה 5'- ctc atg ttt gac agc tta tcg atc cgg gc -3' | |||
| פריימרים לשיבוט מקדש DNA, קדימה 5'- aca gga cgg gtg tgg tcg cca tga t -3' | |||
| מים | |||
| דיתיותרייטול | אינוויטרוגן | 15508-013 | |
| כתם ג'ל DNA, בטוח SYBR | Invitrogen | S33102 | |
| תערובת סולם DNA, O' שליט הגנים | פישר סיינטיפיק | SM1173 | |
| צבע טעינת DNA, 6x TriTrack | Fisher Scientific | ||
| FERR1161 DNase, Baseline-ZERO | Lucigen | ||
| קרח | |||
| Escherichia coli זן OP50 | CGC | OP50 | |
| חומצה אצטית קרחונית | Fisher Scientific | A38 | |
| גליצרול | מיליפור סיגמא | G6279 | |
| HeLa תמצית גרעינית מערכת שעתוק במבחנה, HeLaScribe | Promega | E3110 | |
| Hepes Solution, 1 M Gibco | Millipore Sigma | 15630080 | |
| חומצה הידרוכלורית 37% | Millipore Sigma | P0662 | |
| אקונומיקה היפוכלוריט | Clorox | ||
| LB מרק | Millipore Sigma | L3022 | |
| מגנזיום דיכלוריד | Millipore Sigma | M8266 | |
| מגנזיום סולפט | Millipore סיגמא | M7506 | |
| כלים במשקל בינוני | פישר סיינטיפיק | 02-202-101 | |
| שקופיות מיקרוסקופ, Vista vision | VWR International | 16004-368 | |
| מים בדרגה מולקולרית, | מעבדות Hypure Hyclone | ||
| Nystatin | Millipore Sigma | מערכת N1638 | |
| PCR, FailSafe עם פרמיקס A | Lucigen | ||
| אשלגן כלורי | Millipore Sigma | P39111 | |
| אשלגן פוספט דו-בסיסי | Millipore Sigma | P3786 | |
| אשלגן פוספט מונו-בסיסי | Millipore Sigma | P0662 | |
| מעכב פרוטאז, קוקטייל הפסקה לשימוש חד פעמי 100x | ThermoFisher Scientific | 78430 | |
| , Qubit | ThermoFisher Scientific | ערכת שעתוק הפוך Q33211 | |
| 205211 | Qiagen Sensiscript | ||
| מיקרו RNeasy Qiagen | 74004 | ||
| מעכב RNase | Applied Biosystems | ||
| סודיום כלוריד | VWR בינלאומי | BDH9286-12 ק"ג | |
| נתרן הידרוקסיד | Millipore סיגמא | 1-09137 | |
| מסנן מזרק סטרילי עם 0.2 ומיקרו; m ממברנת פוליאתרסולפון | VWR בינלאומי | 28145-501 | |
| סוכרוז | VWR בינלאומי | 200-334-9 | |
| פריימרים לשעתוק, קדימה 5'- gcc ggg cct ctt gcg gga tat -3' | |||
| פריימרים לשעתוק, הפוך 5'- cgg cca aag cgg tcg gac agt-3' | |||
| טריס-בייס | פישר סיינטיפיק | BP152 | |
| Tween20 | Millipore Sigma | P2287 | |
| <חזק>ציוד | |||
| -20 ו-deg; חממת C | ThermoFisher Scientific | ||
| 20 & deg; חממת C | ThermoFisher Scientific | ||
| 37 ° חממת C | Forma Scientific | ||
| 4 & deg; מקרר C | ThermoFisher Scientific-80 | ||
| ° C מקפיא | Eppendorf | ||
| Autoclave | Sanyo | ||
| Balch הומוגנייזר, הומוגנייזר תאים איזוביוטק | Isobiotec | ||
| Benchtop Vortexer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| צנטריפוגה, צנטריפוגה Eppendorf 5418 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| , VWR Clinical 50 | VWR International | 82013-800 | |
| מיקרוסקופ דיסקציה, Leica M80 | Leica Microsystems | ||
| פלואורומטר, מערכת הדמיית ג'ל Qubit 2.0 | Invitrogen | Q32866 | |
| , iBright FL1500 | ThermoFisher Scientific | A44241 | |
| מערכת ג'ל | ThermoFisher Scientific | ||
| Heat block | VWR International | 12621-048 | |
| מיקרוצנטריפוגות, Eppendorf 5424 | Eppendorf | 22620401 | |
| PIPETBOY acu 2 | Integra | 155017 | |
| Pipette L-1000 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014382 | |
| Pipette L-10 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014388 | |
| פיפטה L-200 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014391 | |
| פיפטה L-20 XLS+, Pipet-Lite LTS | Rainin | 17014392 | |
| פלטפורמת נדנדה | VWR International | ||
| Thermocycler, Eppendorf Mastercycler Pro | Eppendorf | 950030010 |
מקורות
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Blackwell, T. K., Walker, A. K. Transcription mechanisms. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , Pasadena, CA. 1-16 (2006). ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
