מאמר שיטה

הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור

5.4K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62726

⸱

26 באוגוסט 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

אנו מתארים שיטה להבדיל בין אסטרוציטים ונוירונים שמקורם בחוט השדרה לבין אסטרוציטים ותאי עצב שמקורם בחוט השדרה, ואת התרבות המשותפת שלהם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.

תקציר

אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSC-A) ונוירונים (hiPSC-N) מספקים כלי רב עוצמה למידול פתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) במבחנה. רישומי מערך מרובה אלקטרודות (MEA) הם אמצעי להקליט פוטנציאלים של שדות חשמליים מאוכלוסיות גדולות של תאי עצב ולנתח את פעילות הרשת לאורך זמן. בעבר הוכח כי נוכחותם של hiPSC-A המובחנים באמצעות טכניקות לקידום פנוטיפ אסטרוציטים של חוט השדרה שיפרה את ההבשלה ואת הפעילות האלקטרופיזיולוגית של נוירונים מוטוריים hiPSC-motor (MN) ספציפיים לחוט השדרה בהשוואה לאלה שגודלו בתרבית ללא hiPSC-A או בנוכחות אסטרוציטים מכרסמים. מתוארת כאן שיטה לתרבית משותפת של חוט השדרה hiPSC-A עם hiPSC-MN ולהקליט פעילות אלקטרופיזיולוגית באמצעות רישומי MEA. בעוד שפרוטוקולי ההתמיינות המתוארים כאן הם ייחודיים לאסטרוציטים ונוירונים ספציפיים לאזור חוט השדרה, פלטפורמת הרבייה המשותפת יכולה להיות מיושמת על אסטרוציטים ונוירונים המובחנים בטכניקות ספציפיות לגורלות אחרים, כולל hiPSC-A קליפת המוח ו- hiPSC-N. פרוטוקולים אלה נועדו לספק בדיקה אלקטרופיזיולוגית כדי ליידע על אינטראקציות גליה-נוירון ולספק פלטפורמה לבדיקת תרופות עם פוטנציאל טיפולי ב- ALS.

מבוא

אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSC-A) ונוירונים (hiPSC-N) הם כלים רבי עוצמה למידול פתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) במבחנה ומספקים פרדיגמה תרגומית לאסטרטגיות גילוי תרופות1. חוקרים הוכיחו כי התרבית המשותפת של hiPSC-A עם hiPSC-N משפרת את ההבשלה המורפולוגית, המולקולרית, האלקטרופיזיולוגית והפרמקולוגית של שני סוגי התאים, ויוצרת רשתות עצביות מורכבות ואינטראקציות אסטרוציטים-נוירונים הדומות לעמיתיהם in vivo 2,3. ניסויים דומים בתרבית משותפת יכולים לשחזר סימני היכר של פתולוגיה של ALS כגון רעילות עצבית בתיווך אסטרוציטים 4,5 ורגישות יתר עצבית6. בנוסף, עם התקדמות בפרוטוקולי התמיינות, ניתן להתמיין לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) לתת-סוגים עצביים ספציפיים לאזור, כולל hiPSC-A בקליפת המוח ובחוט השדרה ו-hiPSC-N 7,8. אסטרטגיות אלה מספקות את הפוטנציאל למידול פתולוגיה של נוירונים מוטוריים בקליפת המוח ובעמוד השדרה ב- ALS, כמו גם את ההשפעה האסטרוציטית על שניהם. עם זאת, זה דורש כי יש בדיקה פונקציונלית לשחזור כדי לקבוע השפעות אלה.

לאחרונה הוכח כי רישום מערך רב-אלקטרודות (MEA) מתאים במיוחד לאפיון אלקטרופיזיולוגי של תרביות משותפות נוירון-אסטרוציטים2. בניגוד לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים חד-תאיים, מערכי אלקטרודות בצפיפות גבוהה אלה רושמים באופן פסיבי פוטנציאלים של שדות חוץ-תאיים מאוכלוסיות גדולות של תאי עצב מבלי להפריע לתנאי התרבית ולשמור על שלמות קרום התא. פלטפורמות אלה שימושיות במיוחד לתיעוד הפעילות הסלולרית והרשתית של תרביות לאורך זמן ובתגובה למניפולציה פרמקולוגית. לבסוף, כאשר נוכחות אסטרוציטים היא משתנה תרבית, רישומי MEA יכולים לספק תובנות תפקודיות לגבי אינטראקציות דו-כיווניות בין אסטרוציטיםלנוירונים 2,9.

מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי להבחנה של hiPSC לחוט השדרה hiPSC-A ונוירונים מוטוריים hiPSC (MN) שאומת בעבר2. פרוטוקול התמיינות hiPSC-A של חוט השדרה מביא באופן עקבי לתרביות אסטרוציטים, שהן חיוביות עבור חלבון קושר סידן S100 B (S100β), חלבון חומצי גליה פיברילרי (GFAP) והומיאובוקס B4 (HOXB4) בעד 80%, 50% ו-90% מהתאים, בהתאמה, מה שמצביע על מפרט גליה וחוט שדרה מבשיל 2,10 . פרוטוקול התמיינות hiPSC-MN מייצר נוירונים חיוביים >90% עבור אצטילטרנספראז כולין (ChAT), המרמז על זהות נוירון אלפא-מוטורי בוגר2. בנוסף, הפרוטוקול מתאר טכניקות ליצירת תרביות משותפות של hiPSC-A/MN שהוכחו בעבר כגורמות לנוירונים בעלי מורכבות מורפולוגית משופרת על ידי ניתוח שול ומיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי בהשוואה לתרביות עצביות ללא אסטרוציטים או עם אסטרוציטים מכרסמים2. בעוד תיאורים אלה ספציפיים לחוט השדרה hiPSC-A ו- hiPSC-N, יתרון ייחודי הוא שניתן לתרגם את התרבית העצמאית הראשונית של אסטרוציטים ונוירונים ואחריה צעדים לתרבות משותפת בנקודות זמן מאוחרות יותר כדי לחקור את ההשפעות של אינטראקציות נוירון-אסטרוציטים מאזורים ספציפיים אחרים, כמו גם תאים ספציפיים למחלה 7,8 . לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל תרביות אלה על לוחות MEA כך שניתן יהיה לחקור את הפעילות הפונקציונלית כגורם של הרכב תרבית משותפת לאורך זמן עם היכולת להשפיע על הרכב התא כמו גם על תנאי התרבית.

מטרת פרוטוקולים אלה היא לספק בדיקה פונקציונלית לחקר אינטראקציות אסטרוציטים-נוירונים, לבחון שינויים ספציפיים למחלה ולבחון תרופות בעלות פוטנציאל טיפולי בתחום ה-ALS. הוראות וידאו מסופקות עבור השלבים המאתגרים ביותר של פרוטוקול זה.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

1. הכנת מדיה לתרבית תאים

  1. הכן את המדיה הבודדת של תרבית תאים באמצעות ההרכבים המוזכרים בטבלה 1.
  2. יש לערבב ולסנן סטרילית את המדיה בבקבוקים מסוננים במינון 500 מ"ל, ולאחסן מוגן מפני אור בטמפרטורה של 4°C למשך עד שבועיים.

2. שמירה והעברה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם שאינם שוטפים (hiPSC)

  1. הפשירו את מטריצת קרום המרתף (מאוחסנת באליציטוטים בטמפרטורה של -80°C) במקרר של 2-8°C למשך הלילה.
  2. דללו את מטריצת קרום המרתף בקנ"מ 1:100 (v/v) במי מלח חוצצי פוספט קר (PBS) או במדיום הנשרים המתוקנים (DMEM) של דולבקו.
  3. הוסף מספיק מטריצת קרום מרתף כדי לצפות את תחתית צלחת תרבית הרקמה (5 מ"ל עבור צלחת 10 ס"מ, 2 מ"ל עבור בארות בודדות של צלחת 6 בארות) ולדגור ב 37 ° C במשך מינימום של 30 דקות לילה או בטמפרטורת החדר במשך מינימום של 1 שעות.
  4. שאפו את מטריצת קרום המרתף המדוללת ושטפו את הצלחת פעם אחת עם PBS לפני הוספת מצע תרבית ותאי זריעה.
  5. בחנו את הצלחות מדי יום כדי לקבוע ולצפות מתי הן מוכנות למעבר. לוחות מעבר של hiPSC לאחר שרוב המושבות הפכו צפופות מספיק כך שמרכז המושבות מציג אזורים לבנים מפוזרים. אל תאפשרו לצלחות להבשיל מעבר לנקודה זו. הוא יגרום להתמיינות עודפת שתוביל להופעת אזור צהוב במרכז המושבות עקב ריבוי שכבות תאים, שפע של תאים מוארכים בקצוות, קומפקטיות רופפת בתוך מושבות, או מוות תאי מוגבר.
  6. ביום המעבר, ציירו קווי רשת על המשטח החיצוני התחתון של הלוחות עם טוש כדי להקל על כיסוי מדויק של הצלחת כולה.
  7. נתק מושבות מובחנות במכסה מנוע תרבית באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה (הגדלה פי 10) באופן ידני עם קצה פיפטה 200 μL.
  8. שטפו את הצלחות פעמיים עם PBS (5 מ"ל לשטיפה עבור צלחות של 10 ס"מ).
  9. מוסיפים 5 מ"ל של פרוטאז דיסוציאציה רקמתי שחומם מראש (טבלת חומרים) ודגרים על התאים בטמפרטורה של 37°C עד ששולי המושבות מתחילים להתעגל כלפי מעלה (4-7 דקות), אך לפני שהמושבות מתרוממות מהצלחת.
  10. בזהירות לשאוף את פרוטאז דיסוציאציה. שטפו בעדינות את הצלחת פעמיים עם PBS, נזהרים לא לעקור את המושבות.
  11. הוסיפו 5 מ"ל של מדיום hiPSC שחומם מראש (טבלה 1) לצלחת התרבית.
  12. הרימו את המושבות תוך פירוקן לצברי תאים קטנים יותר על ידי גירוד הצלחת כולה עם קצה פיפטה של 5 מ"ל באמצעות תנועה קדימה ואחורה מלמעלה למטה.
  13. סובב את הצלחת 90° וחזור על השלב לעיל.
  14. לשלש את צברי התא בעדינות על ידי פיפטציה למעלה ולמטה עם פיפטה 5 מ"ל ולבדוק את גודל האגרגטים מעת לעת תחת מיקרוסקופ עד שרוב צברי התא הם כ 50-100 תאים.
  15. זרעו את צברי התא לתוך לוחות מטריצת קרום המרתף המצופים מראש, תוך שימוש בתווך hiPSC נוסף כדי לשטוף את הצלחת המקורית. אספו והעבירו את רוב צברי התאים ללוחות החדשים באמצעות פיפטה של 5 מ"ל.
    הערה: אם הפרוטוקול מוחל באופן עקבי, הלוח המקורי צריך להכיל מושבות iPSC המכסות כ-50% משטח התרבית לפני המעבר. במקרה זה, יחס הפיצול צריך להיות מצלחת אחת לחמש צלחות חדשות. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להתאים זאת בהתאם לתנאי הגידול ושיעורי הגידול הספציפיים לקו התא.
  16. נערו את הצלחות החדשות שנזרעו קדימה ואחורה כדי לפזר את האגרגטים באופן שווה.
  17. מעבירים את הלוחות לאינקובטור (37°C ו-5%CO2), ומשאירים אותם ללא הפרעה למשך הלילה כדי לאפשר הידבקות תאים תקינה.
  18. בצע שינוי בינוני מלא כל יום עם 10 מ"ל של מדיום hiPSC. אם יש עודף פסולת תאית ביום שלאחר המעבר, יש לשטוף פעם אחת עם 5 מ"ל של המדיום לפני החלפת המדיה.
  19. תכננו לעבור בשלב הבא כאשר אזורים לבנים יופיעו במרכז רוב מושבות iPSC (שלב 2.5). זה יקרה 4-6 ימים לאחר כל קטע.

3. הקפאת hiPSC

  1. בצע את השלבים הראשוניים כמו בשלבים 2.5-2.14 עבור מעבר hiPSC.
  2. לאסוף את צברי התא לתוך צינור 15 מ"ל ולסובב ב 200 x גרם במשך 2 דקות.
  3. שואפים את הסופרנטנט, משעים מחדש את הגלולה בתווך הקפאה, ומעבירים לצינורות קריו-צינור באמצעות פיפטה של 5 מ"ל.
    הערה: בדומה לשלבי המעבר, יחס הפיצול הרגיל הוא לוח iPSC אחד לחמישה צינורות קריו, בהתאם לצפיפות המושבות. השתמש בנפח כולל של 1 מ"ל של מדיום הקפאה עבור כל cryotube.
  4. הכניסו את הצינורות הקריופוביים למיכל הקפאה צונן והעבירו אותו לטמפרטורה של -80°C למשך הלילה.
  5. מעבירים את התאים לחנקן נוזלי לאחר 24 שעות.

4. הפשרת hiPSC

  1. מצפים צלחת בקוטר 10 ס"מ במטריצת קרום המרתף (ראו 2.1-2.3).
  2. הסר צינור קריו-PSC מחנקן נוזלי והנח אותו מיד באמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך עד 2 דקות כדי להפשיר במהירות. נערו את הבקבוקון באמבטיה עד שהוא מופשר חלקית ומכיל חתיכת קרח קטנה מוקפת נוזל.
  3. העבר את צברי התא מצינור ההקפאה לצינור חרוטי של 15 מ"ל באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר. הוסף עד 15 מ"ל של תווך hiPSC שחומם מראש כדי לדלל את dimethyl sulfoxide (DMSO) במדיה הקפאה.
  4. צנטריפוגה את הצינור החרוטי 15 מ"ל ב 200 x גרם במשך 2 דקות.
  5. שאפו את הסופרנאטנט והשתמשו בפיפט של 5 מ"ל כדי להשהות מחדש את כדורית התא בתווך hiPSC המכיל 20 מיקרומטר של חלבון סרין/מעכב תראונין קינאז הקשור ל-Rho (ROCK-I, תרכובת Y-27632) כדי למנוע טריטורציה נוספת של צברי תאים.
  6. מעבירים את אגרגטי התא לפלטה מצופה מטריצה בקרום מרתף בקוטר 10 ס"מ באמצעות פיפטה בנפח 5 מ"ל.
    הערה: אם הפרוטוקול מוחל באופן עקבי, ניתן להעביר תאים בצינור קריו-צינור אחד לצלחת יחידה של 10 ס"מ.
  7. נערו את הצלחת כדי לפזר את האגרגטים באופן שווה.
  8. מעבירים את אינקובטור הצלחת ומשאירים אותו ללא הפרעה למשך הלילה כדי לאפשר היצמדות תאים תקינה.
  9. בצע שינוי בינוני מלא יום לאחר ההפשרה עם 10 מ"ל של מדיום hiPSC ללא ROCK-I.

5. התמיינות hiPSC לתאי אב עצביים בחוט השדרה (NPC)

  1. ודא כי לוחות 6 בארות מצופות מטריצת קרום המרתף מוכנים לשימוש לפני תחילת הבידול.
  2. התחילו עם iPSC שעבר לפחות פעם אחת ורצוי פעמיים לאחר ההפשרה ועם לפחות ארבע פלטות בקוטר 10 ס"מ (ראו הסבר בשלב 5.11).
  3. בצע את השלבים הראשוניים כמו בשלבים 2.5-2.14 עבור מעבר hiPSC.
  4. מעבירים את צברי התא משני לוחות בקוטר 10 ס"מ לפחות לצינור של 15 מ"ל באמצעות פיפטה של 5 מ"ל.
  5. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 2 דקות.
  6. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא עם 10 מ"ל של תווך hiPSC באמצעות פיפטה של 10 מ"ל, ולאחר מכן צנטריפוגה שוב ב 200 x גרם למשך 2 דקות כדי לשחרר את הידבקויות התא לתא בכל צבירה.
  7. שאפו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של תווך hiPSC המכיל 20 מיקרומטר ROCK-I באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר.
  8. פיפטה למעלה ולמטה עם פיפטה 1000 μL כדי triturate את צברי התא. בדוק את גודל הצברים תחת מיקרוסקופ מעת לעת עד שרוב תרחיף התא מורכב מתאים בודדים או צברים קטנים של <10 תאים.
  9. ספור את התאים עם המוציטומטר (מועדף) או מונה תאים אוטומטי וחשב את צפיפות התא בתרחיף התא.
  10. צלחת 3.0 x 10 6 תאים בכל באר של צלחת6 בארות מצופה מראש במטריצת קרום מרתף. השתמש פיפטה 1000 μL כדי להעביר את תרחיף התא.
    הערה: אם הפרוטוקול מיושם באופן עקבי, זה מתאים ליחס של שתי צלחות של 10 ס"מ לבאר אחת של 6 בארות/צלחת.
  11. חזור על שלבים 5.3-5.10 עם אצווה שנייה של שתי צלחות 10 ס"מ וצלחת את המוצר הסופי לתוך מטריצת קרום מרתף מצופה היטב של צלחת שנייה 6 בארות. השתמש פיפטה 1000 μL כדי להעביר את תרחיף התא.
    הערה: השלמה אידיאלית של פרוטוקול NPC של חוט השדרה דורשת שתי בארות השוות לארבע פלטות של 10 ס"מ. כדי להקל על זרימת העבודה, להשלים את שלבים 5.3 - 5.10 עם שתי אצוות של שתי צלחות, כל אחד עם המוצר הסופי להיות שתי צלחות נפרדות 6 באר וכל אחד עם באר אחת המכילה 3.0 x 106 תאים בו.
  12. שמור על חד-שכבה iPSC אנושית המתקבלת בתווך hiPSC המכיל 20 מיקרומטר ROCK-I עד שהמפגש מגיע ל ->90%, בדרך כלל ביום שלמחרת אך לא יותר מ -3 ימים לאחר הציפוי הראשוני כדי למנוע התמיינות ספונטנית (בלתי מבוקרת).
  13. אם לא ניתן להתחיל בהתמיינות ביום שלאחר ציפוי התא, שטפו את התאים פעם אחת עם PBS והשנו את המדיה מדי יום למדיום hiPSC טרי המכיל 20 מיקרומטר ROCK-I. אם הוא אינו מתמזג >90% תוך 3 ימים מהציפוי, השליכו את התאים והתחילו את הפרוטוקול מחדש.
  14. ברגע שמגיעים למפגש של >90%, מתחילים בידול. זהו יום במבחנה 1 (DIV1) של פרוטוקול הבידול.
  15. ב-DIV 1, יש להשליך את מדיום hiPSC המכיל 20 μM ROCK-I ולשטוף פעמיים עם PBS כדי להסיר את גורם הגדילה העוברי (FGF) ואת גורם הגדילה-בטא (TGFβ) הקיים בתווך תאי הגזע.
  16. שנה את המדיום למדיום WiCell (טבלה 1) בתוספת 0.2 מיקרומטר של LDN193189 (LDN) ו- 10 מיקרומטר של SB431542 (SB) למשך 48 שעות.
  17. ב-DIV 3, יש לשטוף פעם אחת עם PBS ולשנות את המדיום למדיום WiCell בתוספת LDN (0.5 מיקרומטר) + SB (10 מיקרומטר) + חומצה רטינואית (RA; 1μM) למשך 48 שעות.
  18. ב-DIV 5, שטפו פעם אחת עם PBS והשנו את המדיה ל-WiCell: Neural induction medium (NIM) base (טבלה 1) (50%:50%, v/v) בתוספת LDN (0.5 μM) + SB (10 μM) + RA (1 μM) למשך 48 שעות.
  19. ב- DIV 7, בצע החלפה בינונית עם אותו מדיום כמו בשלב 5.18.
  20. ב-DIV 8, יש לשטוף פעם אחת עם PBS ולשנות את המדיום ל-WiCell:בסיס NIM (50%:50%) בתוספת RA (1 מיקרומטר) + פורומורפאמין (PMN) (1 מיקרומטר) + גורם נוירוטרופי רקומביננטי ממוח אנושי (BDNF) (10 ננוגרם/מ"ל) + חומצה אסקורבית (ASAC) (0.4 מיקרוגרם/מ"ל) למשך 48 שעות.
  21. ב-DIV 10, יש לשטוף פעם אחת עם PBS ולשנות את הבסיס הבינוני לבסיס NIM (100%) בתוספת כאמור בשלב 5.20 למשך 48 שעות.
  22. ב- DIV 11 או 12, מצפים בקבוק תרבית סטריליתבגודל 25 ס"מ עם מטריצת קרום מרתף כהכנה למעבר.
  23. שאפו את המדיום מכל באר של צלחת 6 בארות l ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS.
  24. הוסף 2 מ"ל של 0.05% טריפסין לכל באר ודגר ב 37 ° C במשך 5-15 דקות; טלטול הצלחות לסירוגין עשוי לסייע בניתוק תאים.
  25. אם התאים עדיין לא נמצאים בהשעיה, התנתקו מכנית על ידי פליטת מדיית NIM מקצה פיפטה של 1000 μL אל התאים בתנועה מעגלית (הקפידו לכסות את כל פני השטח), או על ידי גירוד עם מגרד תאים (לא מועדף).
  26. מעבירים את התאים מ-2 בארות לצינור של 15 מ"ל ומוסיפים מעכב טריפסין ביחס המתאים לכמות הטריפסין המשמשת באמצעות פיפטה של 5 מ"ל.
  27. צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 2 דקות, לשאוף את supernatant, ולאחר מכן resuspend עם 10 מ"ל של בסיס NIM באמצעות פיפטה 10 מ"ל.
  28. צנטריפוגה שוב ב 200 x גרם במשך 2 דקות כדי לשחרר את הידבקויות תא לתא.
  29. לאחר שלב הצנטריפוגה השני, הסר את הסופרנטנט, והשהה מחדש את הגלולה עם 1 מ"ל של NIM בינוני (100%) בתוספת RA (1 מיקרומטר) + PMN (1 מיקרומטר) + BDNF (10 ננוגרם/מ"ל) + ASAC (0.4 מיקרוגרם/מ"ל) ו-ROCK-I (20 מיקרומטר). באמצעות קצה פיפטה של 1000 μL, טריטורציה של התאים למעלה ולמטה כחמש פעמים עד לקבלת תרחיף עכור.
  30. זרעו מחדש את האגרגטים בתווך זה למטריצת קרום המרתף המצופה 25 ס"מ 2 בקבוק תרבית סטרילי כך שהתוצאה הסופית היא שילוב התאים משתי בארות של צלחת 6 בארות לממברנת מרתף אחת מצופה מטריצה 25 ס"מ 2 בקבוק תרבית סטרילית (מעבר2:1). השתמש פיפטה 1000 μL כדי להעביר את תרחיף התא.
    הערה: התאים צריכים להיות >90% ב- DIV 13, ואין צורך בצעדים נוספים עד היום ה- 14. אם התאים אינם חופפים, שמור את ROCK-I במדיה למשך יום או יומיים נוספים.
  31. ב- DIV 14, שנה את המדיה הבינונית לרעננה של NIM + RA (1 מיקרומטר) + PMN (1 מיקרומטר) + BDNF (10 ננוגרם/מ"ל) + ASAC (0.4 מיקרוגרם/מ"ל).
  32. ב- DIV 15, שנה את התווך ל- NIM: בסיס בינוני התמיינות עצבית (NDM) (טבלה 1) (50%:50%) עם RA (1 מיקרומטר) + PMN (1 מיקרומטר) + ASAC (0.4 מיקרוגרם/מ"ל) + תוסף B (50x) + BDNF (10 ננוגרם/מ"ל) + נוירוטרופי נגזר קו תאי גליה (GDNF) (10 ננוגרם/מ"ל) + גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) (10 ננוגרם/מ"ל) + גורם נוירוטרופי ריסני (CNTF) (10 ננוגרם/מ"ל). החליפו עם מדיה חדשה כל יומיים.
  33. ב- DIV 21, שנה את בסיס המדיום ל- NDM (100%) בתוספת כמו בשלב 5.32, והחלף עם מדיום טרי כל יומיים.
  34. ב- DIV 25-30, לאסוף את NPC ולהקפיא אותם או להעביר אותם לצלחת 10 ס"מ עבור הבחנה טרמינלית.
  35. שטפו את בקבוק T-25 עם PBS והוסיפו 0.05% טריפסין.
  36. יש לדגור במשך 5 דקות בטמפרטורה של 37°C.
  37. שוטפים את הטריפסין ואת התאים עם בסיס NDM ומעבירים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. הוסף את מעכב הטריפסין ביחס המתאים לטריפסין ולצנטריפוגה ב 300 x גרם למשך 5 דקות.
  38. השהה מחדש את כדורית התא עם נוירון מוטורי או מדיום התמיינות אסטרוציטים (טבלה 1) והשתמש בפיפט של 1000 מיקרוליטר כדי לטשטש מעלה ומטה כדי להשיג תרחיף תא יחיד (בדרך כלל עד 5 פעמים).
  39. ספרו את התאים והעבירו לצלחת בקוטר 10 ס"מ המצופה כמתואר בסעיף 6, תוך שימוש באמצעי התמיינות +Rock-I, כדי להבדיל בין hiPSC-MN ל-hiPSC-A.
  40. לחלופין, יש להקפיא את התרביות על ידי השהיה מחדש בתווך הקפאה המורכב מ-90% NDM בינוני עם גורמי גדילה (כמו בשלבים 5.32-5.33) ו-10% DMSO, לבצע טריטורציה באופן דומה, ולאחר מכן להעביר לצינור הקפאה. Aliquot 6 x 106 NPC לכל cryotube.

6. הפשרת תרבויות NPC

  1. מצפים צלחות בקוטר 10 ס"מ בפוליאורניתין (אש"ף) ולמינין יום לפני הפשרת התאים.
    1. הוסיפו 5 מ"ל אש"ף מדולל ל-100 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS או מים מזוקקים (dH2O) לצלחות. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה לפחות עד לילה.
    2. שאפו את תמיסת אש"ף ושטפו את הצלחות שלוש פעמים עם PBS. (אש"ף רעיל אם לא נשטף כראוי.)
    3. הוסיפו למינין מדולל ב-PBS לריכוז של 10 מק"ג/מ"ל ללוחות המצופים באש"ף. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת לפחות, רצוי למשך הלילה. לאחר הדגירה, שאפו את תמיסת הלמינין ללא שטיפה כדי לשפר את הידבקות התא.
      הערה: ניתן לצפות את הצלחות באש"ף מראש, לשטוף שלוש פעמים במים, לייבש במכסה מנוע סטרילי ולאחסן בטמפרטורה של 4°C.
  2. הפשיר בקבוקון NPC אחד (כלומר, DIV 25 או 30) המכיל 6 x 106 תאים/בקבוקון עבור כל צלחת תרבית תאים בגודל 10 ס"מ.
  3. הסר את צינור הקריו-צינור NPC מחנקן נוזלי והכנס מיד לאמבט מים בטמפרטורה של 37°C למשך עד 2 דקות. הפשירו במהירות על ידי ניעור הבקבוקון עד שיש חתיכת קרח קטנה מוקפת נוזל.
  4. העבר צברי תאים לחרוט של 15 מ"ל באמצעות פיפטה של 1000 μL והוסף עד 15 מ"ל של NDM שחומם מראש או תוסף Medium Eagles Medium (DMEM) / Ham's F21 F12 של Dulbecco כדי לדלל את ה- DMSO.
  5. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
  6. שאפו את הסופרנטנט, השעו מחדש את גלולת התא עם אסטרוציטים או עם מדיום התמיינות MN (טבלה 1) + ROCK-I (20 מיקרומטר) והשתמשו בפיפט של 1000 μL כדי למחות מעלה ומטה עד לקבלת תרחיף תא בודד (עד 5 פעמים).
  7. מעבירים את המתלה החד-תאי לצלחת מצופה אש"ף-למינין בקוטר 10 ס"מ.
  8. מעבירים את הצלחת לאינקובטור ומשאירים אותה ללא הפרעה למשך הלילה כדי לאפשר היצמדות תקינה של התא.

7. הבחנה בין NPC חוט השדרה לנוירונים מוטוריים

  1. בצע שלבים ראשוניים כפי שהוזכר בשלבים 6.1-6.8, כאשר התווך הסופי הוא MN differentiation medium + ROCK-I (20 μM).
  2. יום לאחר הציפוי, בצע החלפה מלאה של המדיום עם מדיום בידול MN ללא ROCK-I, ולאחר מכן שנה את המדיה כל יומיים. במהלך סוף השבוע, תאי הזנה ביום שישי ואז שוב ביום שני. שטפו את התאים עם PBS בעת הצורך כדי להסיר פסולת תאים.
  3. שנה את התווך עם מדיום התמיינות MN + ציטוזין ארבינוזיד (ARA-C) (0.02 מיקרומטר) ודגור במשך 48 שעות כאשר אבות גליה מחויבים מופיעים כתאים שטוחים בודדים המתרבים תחת אבות MN פוסט-מיטוטיים המצטברים בצברי תאים.
    הערה: בדרך כלל, זה קורה בתוך 7 הימים הראשונים לאחר ציפוי ראשוני, אם כי עשויה להיות שונות בהתאם לקו התא.
  4. לאחר 48 שעות, שאפו את המדיום המכיל ARA-C, שטפו תרביות בעדינות עם PBS שלוש פעמים, והחליפו את המדיום למדיום MN טרי ללא ARA-C.
  5. לאחר הטיפול ב- ARA-C, בצע החלפות בינוניות כל יומיים (או שני, רביעי ושישי) על ידי הסרת המדיום הישן עם פיפטה ידנית במקום שואב ואקום כדי למנוע ניתוק מוקדם מדי של אשכולות עצביים. בנוסף, להעשיר את המדיום MN עם Laminin 1 מיקרוגרם / מ"ל פעם בשבוע כדי לשפר עוד יותר את ההתקשרות העצבית ללוחות התרבית.

8. הבחנה בין NPC לאסטרוציטים של חוט השדרה

  1. הפשירו תרביות NPC כמו בסעיף 6, באמצעות Astrocyte Differentiation Medium (טבלה 1) בתוספת סרום בקר עוברי (FBS) עם נפח לריכוז נפח של 1% (NS + 1% FBS) וכן ROCK-I (20 מיקרומטר) לציפוי.
    הערה: ניתן להחליף תחליף סרום זמין מסחרית (טבלה 1) ב- FBS באמצעות אותם גורמי דילול.
  2. ביום שלאחר הציפוי, שנה את מדיום התרבית עם מדיום NS + 1% FBS ללא מעכב ROCK, ולאחר מכן שנה את המדיום כל יומיים. במהלך סופי שבוע, תאי הזנה ביום שישי ואז שוב ביום שני. שטפו את התאים עם PBS בעת הצורך כדי להסיר פסולת תאים. אם התאים ממשיכים למות, יש להוסיף מדיה עם ROCK-I (10 מיקרומטר) כדי לקדם את הישרדות התא. היזהר לא להשתמש ב- ROCK-I לעתים קרובות מדי או זמן רב מדי, בהתחשב בפוטנציאל לבחור תאים בני אלמוות.
  3. אפשרו לאסטרוציטים להתלכד לפני שעברו אותם.
    הערה: גודל התא יגדל עם הזמן, כך שאין מספר מוגדר למעבר. יחס המעבר האופייני הוא 1:2 או 1:3. במקרה של הישרדות לקויה או מעבר ליותר מדי צלחות, ערבבו שתי צלחות (או יותר, לפי הצורך) של 10 ס"מ לצלחת אחת של 10 ס"מ כדי לשמור על המפגש.
  4. כדי לעבור תרביות אב אסטרוציטים, לשטוף את הצלחות פעם אחת עם PBS (כדי להסיר FBS), לדגור עם 0.05% טריפסין במשך 5 דקות, לאסוף את התאים ב NS בינוני + 1% FBS (FBS יהיה להשבית טריפסין), ולאחר מכן צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות. לשאוף את supernatant, להשעות מחדש את התאים ב NS בינוני + 1% FBS, ולאחר מכן triturate כדי השעיה תא יחיד. פיזור תאים ב- NS + FBS 1% ללוחות חדשים של 10 ס"מ.
    הערה: בנוסף להרחבת תרביות אסטרוציטים, העברה חוזרת ונשנית של לוחות משרתת את המטרה של הריגת תאי אב שנותרו שבחרו גורל עצבי. לכן, גם אם אין קצב מיטוטי גבוה מאוד, ניתן להעביר צלחות ביחס של 1:1 אם נראה שיש זיהום עצבי.
  5. שנו את הציפוי במהלך הבידול כדי לשפר את התשואה באופן הבא.
    1. צלחת את תרבויות NPC מופשרות בתחילה ואת המעברים הראשונים לאחר ציפוי ראשוני על אש"ף / Laminin.
    2. צלחת את האסטרוציטים הלא בשלים על לוחות מטריצת ממברנה מרתף.
    3. לוחות אסטרוציטים בוגרים יותר (כלומר, לאחר יום 90) על מטריצת קרום מרתף, לוחות מצופים אש"ף/למינין (בדרך כלל עבור תרבית משותפת עם נוירונים), או על לוחות לא מצופים.
  6. להקפיא את אבות האסטרוציטים בכל נקודת זמן במהלך תקופת ההבשלה בת 60 הימים כדי לסנכרן תרביות או לשמור לניסויים מאוחרים יותר. כאשר מפשירים מעבר לשלב NPC, הפשירו את אבות האסטרוציטים על לוחות מטריצת ממברנת המרתף במקום אש"ף/למינין.
  7. ב- DIV 90 ואילך, העבר את המדיום מ- NS + 1% FBS ל- NS + 5% FBS כדי לקדם הישרדות אסטרוציטים ולהקטין את התפשטותם.

9. תרבית משותפת של אסטרוציטים MN וחוט השדרה בלוחות מערך מרובי אלקטרודות

  1. להבדיל וללוח את הנוירונים המוטוריים והאסטרוציטים כאשר הם מוכנים לשימוש באותו יום והתיישנו עד DIV 60 עבור הנוירונים המוטוריים ו- DIV 90 עבור האסטרוציטים.
  2. צפו את לוחות MEA ביום שלפני או ביום הציפוי כדלקמן אם אתם עובדים עם לוחות פלסטיק של 24 בארות (Table of Materials).
  3. לדלל אש"ף במים או PBS ל 100 מיקרוגרם / מ"ל.
    1. מוסיפים 15-20 μL לכל באר (תלוי ברמת הנוחות של פיפטה), ויוצרים טיפה במרכז הבאר המכסה את שטח האלקטרודות והסביבה אך לא את כל הבאר.
    2. היזהר לא לפגוע אלקטרודות עם קצה פיפטה. היו עקביים עם נפח מבאר לבאר כדי להבטיח כיסוי של אותו שטח פנים בכל באר.
    3. לדגור אש"ף ב 37 ° C במשך מינימום של 1 שעה (רצוי 2 שעות).
      הערה: הכרכים הקטנים יתייבשו אם אין מספיק לחות בצלחות. הוסיפו מים לתאים המקיפים בארות כדי להבטיח לחות מספקת במהלך הציפוי וההקלטות.
  4. שאפו כמה שיותר אש"ף באמצעות קצה מיקרופיפטה מפלסטיק. יש להקפיד לא לגעת באלקטרודות. יש לשטוף עם 250 מיקרוליטר מים שלוש פעמים. אם אתם משתמשים בשואב ואקום לשטיפות, אל תאפשרו את הקצה ליד מערך האלקטרודות. לאחר השטיפה השלישית, להסיר כמה שיותר מים, באמצעות קצה פיפטה לפי הצורך. הניחו למשטח להתייבש מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים עם הסרת המכסה.
  5. לאחר שמשטחי הצלחת יבשים, הוסיפו למינין מדולל ל-10 מיקרוגרם/מ"ל ב-PBS. השתמש ב- 15-20 μL כדי לכסות כל מערך אלקטרודות. הוסיפו מים לתאי הלחות, החליפו את המכסה והחזירו את הצלחת לדגירת 37°C למשך שעתיים לפחות עד לילה.
  6. ביום הציפוי, שטפו את תרביות MN ואסטרוציטים פעם אחת עם PBS והוסיפו טריפסין 0.05% ב-37°C כדי להרים תאים (5 דקות). יש לאסוף לתוך צינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל מעכב טריפסין ולשטוף צלחות עם מדיום או בסיס כדי להבטיח שכל התאים נאספים. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות ו resuspend עם פיפטה 1000 μL כדי לייצר 1 מ"ל של תא בודד השעיה. בעת השעיה מחדש של MN ואסטרוציטים, עבור למדיום התרבית המשותפת (טבלה 1), עם תוספת של 20 מיקרומטר ROCK-I.
  7. לספור את MN ואת האסטרוציטים במקביל באמצעות hemocytometer. תוך כדי ספירה וחישובים, מכסים את מתלי התאים ומניחים אותם במדף קלקר בטמפרטורה של 4°C.
  8. חשב את הנפח הדרוש כדי להשעות מחדש את התרביות לריכוז של 5 x 10 4 תאים לכל 5 μL עבור נוירונים מוטוריים ו 2.5 x 104 תאים לכל 5 μL עבור אסטרוציטים. צנטריפוגה את מתלי התא 1 מ"ל ב 300 x גרם במשך 5 דקות והשהיה מחדש בנפח מחושב.
  9. חשב את מספר הבארות הרצוי להיות זרע ולהכפיל אותו ב 5 μL של כל השעיה התא. ערבבו את הנפח הנדרש של מתלי נוירונים ואסטרוציטים ביחס של 1:1 וערבבו על ידי פיפטינג עד לשילוב יסודי (בדרך כלל פעמיים), אך הימנעו מלהיות אגרסיביים מדי.
  10. מוציאים את הלמינין מכל באר של צלחת MEA באמצעות קצה פיפטה. מעבירים 10 μL של תרחיף התא המשולב הסופי לכל באר, ויוצרים טיפה קטנה המכסה את מערך האלקטרודות כדי לספק צפיפות תאים של 5 x 10 4 MN ו 2.5 x 104 אסטרוציטים לכל באר.
    הערה: צפיפות תאים גבוהה בתרחיף המשולב דורשת השעיה תכופה בין בארות במהלך שלב הזריעה כדי להבטיח ספירת תאים מדויקת ועקבית.
  11. מחזירים את הצלחות לאינקובטור למשך 20-30 דקות. היזהר לא להפריע טיפת התא ולאפשר לתאים ליצור קבצים מצורפים ראשוניים על הלוחות.
  12. לאחר 20-30 דקות, הוסף מדיה חמה של תרבות משותפת + ROCK-I לכל באר על ידי הנחת 250 μL למטה על הקיר של כל באר, ולאחר מכן 250 μL נוספים במורד הקיר של אותה באר בצד הנגדי. מחזירים את הצלחת לאינקובטור.
  13. בחנו את הצלחות יום לאחר הזריעה (יום התרבות המשותפת 1). אם יש פסולת תאים משמעותית או תאים מתים, החליפו את התווך עם מדיום תרבית משותפת טרי המכיל ROCK-I. אחרת, שנו את המדיום ביום השני לאחר הזריעה (יום התרבות המשותפת 2) למדיום התרבות המשותפת ללא ROCK-I. בצעו החלפות חצי בינוניות (שאפו 50% והוסיפו 60% מהנפח הסופי כדי להתחשב באידוי) פעמיים בשבוע.
  14. אם משתמשים במערכות MEA עם לוחות זכוכית 30 מ"מ באר אחת (טבלה של חומרים), הכנת הצלחת עשויה להימשך יומיים או יותר. בצע את השלבים הבאים כדי לבצע זאת.
  15. הרימו את התאים ואת פסולת התאים מתרביות MEA קודמות עם 0.05% טריפסין למשך 5-15 דקות.
  16. שאפו טריפסין ושטפו שלוש פעמים במים.
  17. יש לעקר על ידי הוספת 70% אתנול ולדגור במכסה המנוע למשך 10 דקות. שאפו את האתנול, ולאחר מכן שטפו במים שלוש פעמים.
  18. יש למרוח במים חומר ניקוי 1% אניוני עם אנזים פרוטאז. מכסים את הצלחות במכסה ועוטפים בסרט תרמופלסטי ובנייר אלומיניום, ואז משאירים אותן על נדנדה בטמפרטורת החדר למשך הלילה.
  19. שאפו את חומר הניקוי, ולאחר מכן שטפו שלוש פעמים במים.
  20. אם מתכננים לאחסן את הצלחות, להוסיף נפח מספיק של מים. מכסים את הצלחות במכסה ועוטפים אותן בסרט תרמופלסטי ובנייר אלומיניום, ומשאירים במקרר עד לשימוש הבא.
  21. אם אתם מתכננים לצפות, תנו למשטח להתייבש מתחת למכסה המנוע של תרבית התא.
  22. אם יש צורך בעיקור נוסף (למשל, זיהום קודם או שימוש לא לאחרונה), בשלב זה בלבד, יש לחשוף את לוחות MEA לאור אולטרה סגול (UV) מתחת למכסה המנוע למשך 30-60 דקות.
    הערה: הימנעות מאור UV תכוף תמנע נזק לאלקטרודות. השימוש באור UV כאשר על צלחות יש סרום יגרום לאלקטרודות לא פונקציונליות, ולכן יש להשתמש בו רק על צלחות ניקוי.
  23. כאשר הצלחות יבשות לחלוטין, המשיכו בניקוי פלזמה למשך דקה אחת כדי לטעון את משטח הזכוכית של לוחות MEA ולשפר את יעילות הציפוי. פלזמה לנקות לפחות פעם אחת כל 4-5 מחזורים של ציפוי ציפוי צלחת MEA.
    1. כחלופה, כאשר ניקוי פלזמה אינו אפשרי או לא מוצדק, הוסף נפח מספיק של מדיום המכיל FBS כדי לכסות את פני השטח של לוחות MEA ולהחזירם לאינקובטור למשך הלילה.
  24. השתמש בציפוי אש"ף/למינין כמתואר לעיל בסעיף 6. יש להוסיף תמיסת אש"ף (100 מיקרוגרם ב-PBS) מיד לאחר ניקוי פלזמה או שאיפה ושטיפה של המדיום המכיל FBS.
  25. לוחית את התאים כנ"ל בצפיפויות הבאות: 1 x 10 5 hiPSC-A / צלחת ו- 5 x 105 hiPSC-MN / צלחת.

10. הקלטת מערך מרובה אלקטרודות

  1. חלץ את נתוני המתח הגולמי בתדר דגימה של 12.5 קילוהרץ, באמצעות מסנן Butterworth עם מעבר גבוה של 200 הרץ ומסנן מעבר נמוך של 3 קילוהרץ. הגדר זיהוי ספייק כנקודות זמן מיידיות של מתחים ≥6 סטיות תקן מקו הבסיס. זהה התפרצויות כפעילות עם קפיצות של >5 ב-100 אלפיות השנייה. הגדר את פעילות הרשת כאשר יותר מ- 35% מכלל האלקטרודות הפעילות יורות בטווח של 100 אלפיות השנייה, עם מינימום של 50 קפיצות בכל פרץ רשת.
  2. התחל להקליט בהקדם האפשרי לאחר יום 1 של Co-Culture (CC).
    הערה: פעילות חשמלית תצוין לעתים רחוקות לפני יום CC 3.
  3. לוחות מקבילים בצפיפות דומה ומשכפלים בתרבית המתאימה לוחות או כיסויים לבדיקות ביוכימיות, אימונוציטוכימיה (ICC), או qPCR.
  4. בצע הקלטות כאשר הטמפרטורה מוגדרת ל 37 ° C ad CO2 ב -5%. העבירו את הצלחות למכונה ואפשרו להן להתאזן לפחות 5 דקות לפני ההקלטה.
  5. הקלט פעילות בסיסית אחת ליומיים או מדי שבוע, במשך 1-15 דקות, בהתאם לתכנון הניסוי. אל תקליט לפחות שעה אחת לאחר חילופי דברים בינוניים, ורצוי להמתין 24 שעות לאחר כל חילופי מדיה.
  6. כדי למנוע זיהום, שנה את התווך (כלומר, חצי חילוף בינוני כמו בשלב 9.14) לאחר כל הקלטה שבה יש לפתוח את מכסה הצלחת הסטרילית מחוץ למכסה המנוע הסטרילי (כלומר, יישום של תרכובות סמים). בצע החלפות בינוניות מלאות ושטיפות כדי לשטוף תרופות אם צלחות הולכים להמשיך לשמש מעבר לטיפול תרופתי.
  7. למטרות ניתוח, השתמש לפחות בשלושה עותקים טכניים וביולוגיים עבור כל מצב. לבטא נתונים אלקטרופיזיולוגיים באמצעות n ≥ 3 משוכפלים.

11. בדיקות פרמקולוגיות על מערך רב אלקטרודות

  1. השתמשו בשילוב שונה של תרביות משותפות בהתאם לשאלת הניסוי: נוירוני ALS עם אסטרוציטים בקרה, נוירוני בקרה עם אסטרוציטים של ALS, נוירוני ALS ואסטרוציטים, נוירוני בקרה ואסטרוציטים.
  2. בעת חקירת השפעות אלקטרופיזיולוגיות חולפות של תרכובות המכוונות לנוירונים או לאסטרוציטים, רשום פעילות בסיסית למשך דקה אחת לפחות כאשר מכסה הצלחת הוסר אך מכסה המכונה סגור.
  3. פתח ידנית את המכסה למכונה מבלי לעצור את ההקלטה האלקטרופיזיולוגית והחליף 25 מיקרוליטר של מדיום עם רכב התרופה המתאים (בדרך כלל מדיום טרי) באמצעות פיפטה רב ערוצית אם מטפלים במספר בארות. סגור את המכסה באופן ידני.
  4. הקלט למשך דקה אחת נוספת (או יותר אם ישנם שינויים משמעותיים הנגרמים על ידי הרכב שמהם התרבות צריכה להתאושש).
  5. פתח ידנית את המכסה שוב והחלף 25 μL של מדיום עם התרופה של עניין באותו רכב. סגור את המכסה למכונה והמשך בהקלטה.
    הערה: משך ההקלטה והנפח של התרופה/הרכב הניתן עשויים להשתנות או שיש צורך למטב אותם בהתאם לשאלת הניסוי.
  6. למטרות ניתוח, ודא כי תוספת הרכב אינה מעוררת שינויים משמעותיים בפרמטרים אלקטרופיזיולוגיים. חישוב אחוזי השינוי בפעילות לאחר התרופה לעומת לאחר הוספת רכב והשווה בין התנאים.
  7. כדי לחקור השפעות אלקטרופיזיולוגיות אורכיות, כגון תרופות משנות מחלה מועמדות, רשום את הפעילות הבסיסית המתוארת בשלב 11.2. לשם כך, השתמש במדיום התרבות המשותפת המכיל את הסם (ים) המעניין ברכב המתאים או במדיום המכיל את הרכב בלבד.
  8. למטרות ניתוח, השוו את הקלטות נקודת הזמן מ-ALS או תרביות ביקורת שטופלו בתרופות זו לזו ובדקו את התנאים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול דפוס חוט השדרה ליצירת hiPSC-MN וחוט השדרה hiPSC-A מתואר באיור 1. בפרוטוקול הזה, hiPSCs מתוחזקים ומועברים כמושבות לא מתמזגות (איור 2A). נוירוגנזה מתחילה (אינדוקציה עצבית) באמצעות עיכוב SMAD כפול על ידי תוספת של LDN193189 ו- SB431542, השבתת החלבון המורפוגנטי של העצם (BMP) ומסלולי גורם הגדילה המשתנה בטא (TGF-β), בהתאמה. שיטה מבוססת חד-שכבות משמשת לשלב זה שבו hiPSC מצופים על מטריצה דבקה, כלומר מטריצת קרום מרתף, כדי ליצור תרבית דו-ממדית דמוית נוירואפיתל. מבח...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

עד כה, שיטות מבוססות hiPSC ו-MEA לרישומים אלקטרופיזיולוגיים של תרביות משותפות של אסטרוציטים-נוירונים מצאו יישום מוגבל בתחום ALS6 ועדיין לא בפלטפורמות אנושיות לחלוטין, בניגוד לשימוש הנפוץ יותר שלהן למידול חוץ גופי של אפילפסיה9. עם זאת, לפלטפורמה זו יש פוטנציאל לענות על שאלות רלוונטיות מבחינה פתופיזיולוגית בחקר ALS, כגון מנגנונים של רגישות יתר עצבית, תרומת אסטרוציטים לרעילות עצבית, או תפקיד פעילות הרשת בהתקדמות המחלה. בנוסף, פלטפורמה זו מאפשרת איסוף נתונים אלקטרופיזי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

כתב יד זה נתמך על-ידי הגורמים הבאים: MSCRFF 5119 (AT) 2019. K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 פרס פיתוח הקריירה של Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). אנו מודים לד"ר ראהא דסטגייב ולד"ר נורמן הוהי על אספקת פלטפורמת MEA ותוכנת ניתוח הנתונים בה השתמשנו כדי לאמת את הפלטפורמה האלקטרופיזיולוגית המתוארת. ברצוננו להודות לחליל רוסט על עזרתם בהדגמת פרוטוקול ובצילומים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות תרבית סטריליות 10 ס"מפלקון353003
25 ס"מ2 צלוחיות תרבית סטריליותFalcon353136
2-Mercaptoethanol (β-ME)Thermofisher21985023ריכוז עבודה 110 µ M
500 מ"ל 0.2 ומיקרו; m CA מערכת סינוןקורנינג430769
5 מ"ל פיפטהפלקון357543
6 צלחות תרבית סטריליות היטבFalcon3046
Amphotericine BGibco15290018 ריכוז עבודה 2.0 μ גרם/מ"ל
חומר ניקוי אניוני עם אנזים פרוטאז - Terg-A-ZymeSigma-AldrichZ273287ריכוז עבודה 1% m/v
חומצה אסקורבית (ASAC)SigmaA4403ממיסים 100 מ"ג ל-250 מ"ל של dH2O כדי לקבל מלאי של 0.4 מ"ג/מ"ל. מסנן סטרילי דרך 0.22 ומיקרו; מסנן M, מקפיא ומקפיא ב -80 ºC. מדלל ב -1:1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 0.4 ומיקרו; גרם/מ"ל).
Axion CytoView MEA 24 לוחות (M384-tMEA-24W)AxionOPT-24
Axion Edge MEA פלטפורמת AxionMaestro Edge
Basement Membrane Matrix - MatrigelCorning354277פרטים בפרוטוקול
מיקרוסקופ ספסל (סטרילי מתחת למכסה המנוע של תרבית תאים)Zeiss415510-1100-000Primo Vert
BicucullineSigma Aldrich14340ריכוז עבודה10 μ M
גורם נוירוטרופי ריסי (CNTF)פרוטק450-13ממיס 100 ומיקרו; g ב-1 מ"ל של PBS סטרילי, ולאחר מכן הוסף 9 מ"ל של 0.1% BSA-PBS סטרילי ל-10 ומיקרו; גרם/מ"ל. יש להקפיא ולהקפיא ב -80 ºC. לדלל ב -1: 1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 10 ננוגרם/מ"ל).
מיכלי CO2 ווסת עבור Axion EdgeAirGas/Harris9296NC
Compound EAbcamab142164ממיסים 250 ומיקרו; g ב-2.0387 מ"ל של DMSO כדי לקבל 250 ומיקרו; מלאי M. יש להקפיא ולהקפיא ב-80 ºC. לדלל 1:2000 לשימוש. (ריכוז עבודה 125 ננומטר).
ציאנקוויקסלין  (CNQX)סיגמא אולדריץ'C239ריכוז עבודה 50 μ M
חומצה דיהידרוקיאנית (DHK)Tocris111ריכוז עבודה 50 μ M ו-300 μ M
DMEM/F12Thermofisher113300ריכוז עבודה 1x
Essential 8 Medium + Essential 8 תוסףThermofisherA1517001לשלב 10 מ"ל של Essential 8 (10x)  תוסף עם 500 מ"ל של Essential 8 Growth Medium (1x)
סרום בקר עוברי (FBS)Thermofisher16140071ריכוז עבודה 1x
נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF)Peprotech450-10ממיסים 100 ומיקרו; g ב-1 מ"ל של PBS עד 100 ומיקרו; גרם/מ"ל, ולאחר מכן הוסף 9 מ"ל של 0.1% BSA-PBS סטרילי ל-10 ומיקרו; גרם/מ"ל. יש להקפיא ולהקפיא ב -80 ºC. לדלל ב -1: 1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 10 ננוגרם/מ"ל).
מדעי מיקרוסקופיה של בחירותהמוציטומטר63510-20
HeparinMillipore-sigmaH3149-100KUממיסים 200 מ"ג ב-100 מ"ל של PBS כדי לקבל תמיסת מלאי של 2 מ"ג/מ"ל. Aliquot את המלאי ב -15 מ"ל ו -500 & מיקרו; צינורות L. יש לדלל 1:1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 2 ומיקרו; גרם/מ"ל).
חממת תרבית תאים מבוקרת לחותThermoFisher370מוגדרת ל-37 º C, 5% CO2
גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1)מו"פ מערכות D291-G1-200ממיסות 200 ומיקרו; g ב-2 מ"ל של PBS עד 100 ומיקרו; גרם/מ"ל, ואז הוסף 18 מ"ל של 0.1% BSA-PBS כדי ליצור 10 ומיקרו; גרם/מ"ל מלאי ואחסון ב-80 ºC. Aliquot והקפאה ב-80 ºC. לדלל 10 & מיקרו; מלאי גרם/מ"ל ב-1: 1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 10 ננוגרם/מ"ל).
חומצה KaincAbcamab144490ריכוז עבודה 5 μ
החלפת סרום נוקאאוט M (KSR)Thermofisher10828ריכוז עבודה 1x
LamininThermofisher23017-015תמיסת מלאי 1 מ"ג/מ"ל, ריכוז עבודה 10 ומיקרו; גרם/מ"ל (ציפוי), 1 ומיקרו; גרם/מ"ל (מדיה סלולרית)
LDN193189Stemgent04-0074ממיסים 2 מ"ג של LDN לתוך 500 ומיקרו; ליטר של כלורופורם כדי לקבל מלאי של 10 מ"מ. ציטוט זה והקפיא ב-80 ºC. לשימוש, יש לדלל תחילה את המלאי 1 עד 10 ל-DMSO [ל-1 מ"מ], ולאחר מכן לדלל 1:5000 של 1 מ"מ לתוך המדיה הרצויה כדי לקבל 0.2 ומיקרו; M פתרון עבודה
L-גלוטמיןThermofisher25030ריכוז עבודה 100x
לוחות זכוכית MEAמערכות רב ערוציות60MEA200/30iR-Ti-gr
רב ערוצי Pipet P200גילסוןPJ22224
NeurobasalThermofisher21103049ריכוז עבודה 1x
חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)Thermofisher11140050ריכוז עבודה 100x
Pencillin/StreptomycinThermofisher15140122 ריכוז עבודה 100x
פוליאורניתין (PLO)Sigma-AldrichP3655ממיסים 100 מ"ג ב-1 מ"ל של ddW כדי לקבל תמיסת מלאי של 100 מ"ג/מ"ל. Aliquot את המניה ב-100 ומיקרו; צינורות L. (ריכוז עבודה 100 ומיקרו; גרם/מ"ל)
אשלגן כלורי (KCl)NANA ריכוז עבודה100 מ"מ
פורמורפמין (PMN)Millipore-Sigma540223להמיס 5 מ"ג ב-9.6 מ"ל של DMSO כדי לקבל תמיסה של 1 מ"מ. יש להקפיא ולהקפיא ב-80 ºC. לדלל 1:1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 1 ומיקרו; M).
גורם נוירוטרופי רקומביננטי שמקורו במוח אנושי (BDNF)Peprotech450-02זמן קצר לפני הרכבה מחדש. ממיסים 100 ומיקרו; g ב-1 מ"ל PBS עד 100 ומיקרו; גרם/מ"ל, ולאחר מכן הוסף 9 מ"ל של 0.1% BSA-PBS סטרילי ל-10 ומיקרו; גרם/מ"ל. יש להקפיא ולהקפיא ב -80 ºC. לדלל ב -1: 1000 לשימוש. (ריכוז עבודה 10 ננוגרם/מ"ל).
חומצה רטינואית (RA)SigmaR2625ממיסים 100 מ"ג ל-3.3 מ"ל של DMSO כדי לקבל תמיסת מלאי של 100 מ"מ. Aliquot המניות 100 µ L / צינור והקפאה ב -80 º C. יש ליטול 200 ומיקרו; L של מלאי 100 מ"מ ולדלל פי 10 (הוסף 1.8 מ"ל של DMSO) כדי ליצור מלאי של 10 מ"מ. Aliquot 50 µ L/צינור  ולאחסן ב-80 ºC. לדלל ב-1:10000 לשימוש. (ריכוז עבודה 2 ומיקרו; M).
מעכב ROCK-IPeprotech1293823להמיס 5 מ"ג ב-1480 ומיקרו; L של dH2O כדי לקבל מלאי של 10 מ"מ, יש להקפיא ולהקפיא ב-80 &C. לדלל ב-1: 500 לשימוש. (ריכוז עבודה 20 ומיקרו; M).
SB431542SigmaS4317ממיסים 5 מ"ג ל-1.3 מ"ל של DMSO כדי לקבל תמיסת מלאי של 10 מ"מ. יש להקפיא ולהקפיא ב-80 ºC. לדלל ב-1:1000 לשימוש. (עבודה 10 ומיקרו; M)
קולטי אדים סטריליים לתרבית תאיםחברת בייקרSG-600
תוסף B - B27 תוסףThermofisher21985023 ריכוז עבודה 50x
תוסף N - N2 תוסףThermofisher17502048ריכוז עבודה 100x
צנטריפוגה תרבית תאים שולחניתThermoFisher75004261Sorvall Legend X1R
תרמופלסטי  סרט - ParafilmPARAFILM P7793
פרוטאז דיסוציאציה של רקמות - DispaseStemCellTechnologies 7923ריכוז עבודה 1x
מעכב טריפסיןSigmaT6522-1Gממיסים 1 גרם ב-100 מ"ל ddH2O כדי לקבל מלאי של 10 מ"ג/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 ºC. לדלל 1:10 מנפח הטריפסין לשימוש. (ריכוז עבודה 1 מ"ג/מ"ל).
Trypsin-EDTA (0.05%)Thermofisher2530054ריכוז עבודה 1x
אמבט מיםThermoFisher2332Isotemp
צנטריפוגה

מקורות

  1. Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911(2021).
  2. Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
  3. Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
  4. Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
  5. Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
  6. Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
  7. Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
  8. Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
  9. Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416(2018).
  10. Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
  11. Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
  12. Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
  13. Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
  14. Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
  15. Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
  16. Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
  17. Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
  18. Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

ALSSMADJAK STAT

מאמרים קשורים