הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

ויסות תאי גזע מזנכימליים של מקרופאג' פאגוציטוזיס; כמות והדמיה

2.6K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62729

⸱

16 ביולי 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Molloy College

במאמר זה

סיכום

מוצג כאן פרוטוקול לכמת ולייצר תמונות דינמיות של תאי גזע מזנכימליים (MSC) רגולציה מתווכת של מקרופאגים (MΦ) פאגוציטוזיס של חלקיקי שמרים לא אוסונים (זימוסן) המצומדים למולקולה פלואורסצנטית רגישה ל- pH.

תקציר

תאי גזע Mesenchymal (MSC) נחקרו באופן מסורתי עבור תכונות התחדשות שלהם, אבל לאחרונה, המאפיינים החיסוניים שלהם היו בחזית. הם מתקשרים ומווסתים את פעילות תאי החיסון. המוקד של מחקר זה הוא הרגולציה MSC של פעילות פגוציטית מקרופאג '. פאגוציטוזיס מקרופאג' (MΦ) הוא חלק חשוב מהתגובה המולדת של מערכת החיסון לזיהום, והמנגנונים שבאמצעותם MSC לווסתים תגובה זו נמצאים תחת חקירה פעילה. מוצג כאן היא שיטה לחקור MΦ phagocytosis של חלקיקי זימוסן לא אוזונסה מצומדים למולקולה פלואורסצנטית רגישה ל- pH בזמן שהם נמצאים בתרבית משותפת עם MSC. ככל שהפעילות הפגוציטית גדלה וחלקיקי הזימוסן המסומנים סגורים בסביבה החומצית של הפגוליסום, עוצמת הפלואורסצנטיות של המולקולה הרגישה ל- pH עולה. עם אורכי הגל המתאימים של עירור ופליטה, פעילות פאגוציטית נמדדת באמצעות ספקטרופוטומטר פלואורסצנטי ונתונים קינטיים מוצגים כשינויים ביחידות פלואורסצנטיות יחסית על פני תקופה של 70 דקות. כדי לתמוך בנתונים כמותיים אלה, השינוי בפעילות הפאגוציטית מוצג באופן חזותי באמצעות הדמיה דינמית. תוצאות בשיטה זו מראות כי כאשר בתרבות משותפת, MSC לשפר MΦ phagocytosis של זימוסן לא opsonized של נאיבי ו IFN-γ מטופל MΦ. נתונים אלה מוסיפים לידע הנוכחי של ויסות MSC של המערכת החיסונית המולדת. שיטה זו יכולה להיות מיושמת בחקירות עתידיות כדי לתוות באופן מלא את המנגנונים התאיים והמולקולריים הבסיסיים.

מבוא

תאי גזע מזנכימליים (MSC) הם תאי אבות המעוררים תאי רקמת חיבור. MSC נמצאים ברקמות יונקים בוגרים וניתן לבודדם ממח העצם1. בשל תכונות האימונומודולטוריות שלהם, תאים אלה נחקרים באופן נרחב2. מחקרים מוקדמים התמקדו בוויסות MSC של תאי T3,4,5,6 אבל לאחרונה, הרגולציה שלהם של תאי מקרופאגים (MΦ), מרכיב תאי מרכזי של חסינות מולדת, קיבל תשומת לב מוגברת7,8,9,10,11,12,13,14 . החשיבות של אינטראקציה MSC-MΦ בטיפול במחלות דלקתיות מודגמת על ידי העובדה כי דלדול של מונוציטים / מקרופאגים שולל את ההשפעות הטיפוליות של MSC במודלים בעלי חיים8. כאן, המוקד הוא אינטראקציית הקשר הסלולרי של MSC עם MΦ. MSC יש את היכולת לווסת את הפנוטיפ של MΦ על ידי קידום המעבר מתגובות דלקתיות לאנטי דלקתיות, המוביל לפעילויותתיקון רקמות 8,9,10,11, והרבה נעשה כדי להדגים מנגנוני רגולציה אלה. בנסיבות אחרות, MSC יכול לתמוך או להחמיר תגובה דלקתית מונעת MΦ12,13 ולשפר את הפעילות הפאגוציטית MΦ14,15. עם זאת, קיים מחסור קריטי בנתונים קיימים המזהים את המנגנונים לפיהם ואת התנאים שבהם MSC מסדיר את הפעילות הפאגוציטית MΦ.

MΦ יש משפחות של קולטנים המזהים אופוסונום (נוגדן או משלים מצופה) או פתוגנים שאינם אובזוניים המובילים phagocytosis16. ההפעלה והפעילות של האחרון הוא פחות נחקר היטב17. בסביבה לא דלקתית במבחנה, MSC לשפר MΦ phagocytosis של פתוגנים שאינם אוסוניסטים13. עם זאת, זיהוי של פתוגנים שאינם opsonized על ידי MΦ עשוי להיות מופחת לאחר חשיפה לסביבה דלקתית המיוצר על ידי לימפוציטים במהלך תגובה חיסונית אדפטיבית. IFN-γ, שוחרר על ידי תאי רוצח טבעי לימפוציטים אפקט, יש השפעה מעכבת על MΦ phagocytosis של חלקיקים לא opsonized18. מודל תרבות משותפת פותח כדי ללמוד את המנגנונים של MSC רגולציה מגע ישיר של MΦ phagocytosis. מטרת הניסוי המוצג כאן היא לקבוע אם MSC לווסת MΦ phagocytosis של פתוגנים שאינם אוסוניסטים לאחר MΦ נחשפו IFN-γ (איור 1).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: כל ההכנה הבינונית וטכניקות תרביות התא מתבצעות בתנאים אספטיים באמצעות ארון בטיחות ביולוגית עם זרימת למינאר. כל שלבי הדגירה התרבותית המתוארים מתבצעים באמצעות אינקובטור שנועד לשמור על אווירה של 37 °C (5 °F), 5% CO2ו-95% לחות.

1. תרבות התא

  1. הכנת מדיום צמיחה
    1. עבור MSC ו- LADMAC, הוסף 50 מ"ל של FBS ו 5 מ"ל של תערובת אנטיביוטית/אנטי-ממיקוטית 100x ל-500 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה.
    2. עבור MΦ, להוסיף 50 מ"ל של FBS, 100 מ"ל של מצב LADMAC בינוני (מוכן בעקבות השלבים של סעיף 1.2), ו 5 מ"ל של תערובת אנטיביוטית 100x ל 500 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה.
      הערה: תאי LADMAC מייצרים גורם מגרה מושבה (CSF-1) הדרוש כדי לתמוך בצמיחה של תאי MΦ.
  2. הכנת מדיום ממוזג LADMAC
    1. כדי לזרוע תאי LADMAC מן המלאי קפוא, להוסיף 19 מ"ל של בינוני צמיחה מסעיף 1.1 בכל אחד מחמשת T75 ס"מ2 צייצנים שטופלו בתרבית התאים ומניחים בחממה תרבית התא במשך 15 דקות כדי שיווי משקל ל 37 °C (77 °F).
    2. בינתיים, להפשיר במהירות aliquot אחד של 106 תאים קפואים על ידי דגירה באמבט מים 37 °C במשך 2-3 דקות או עד שהוא מופשר. הוסף את התאים ל 9 מ"ל של מדיום צמיחה MSC טרי בצינור חרוט סטרילי 15 מ"ל או 50 מ"ל וצנטריפוגה ב 125 x g ברוטור דלי מתנדנד במשך 5 דקות.
    3. שאפו או הדקו את הסופר-נט, הוסיפו 5 מ"ל של מדיום צמיחה טרי, ופיפטו בעדינות מעלה ומטה כדי לשפץ את גלולה התא.
    4. הוסף 1 מ"ל של מתלה התא לכל אחד מחמשת T75 ס"מ2 צלוחיות באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית ומניחים אותם בחממה תרבית התא.
    5. כל 2-3 ימים, להוסיף 10 מ"ל נוספים של בינוני על פני תקופה של 7-10 ימים. לאחר מכן, לאסוף את התאים ואת supernatant לתוך צינורות חרוט סטריליים 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית צנטריפוגה ב 125 x g במשך 5 דקות.
    6. הפרד את supernatant מן גלולה התא מסנן סטרילי supernatant באמצעות יחידת מסנן ואקום סטרילי 0.2 מיקרומטר חד פעמי.
      1. מוציאים את הרכבת השאיפה מהחבילה ומתחברים באמצעות צינורות ואקום למשאבת השאיפה. יוצקים את supernatant לתוך התא העליון ולהחליף את הכיסוי. הפעל את משאבת השאיפה כדי לסנן לתא התחתון.
      2. הכן aliquots על ידי צנרת לתוך צינורות חרוט סטריליים 50 מ"ל ולאחסן ב -20 °C (50 °F).
    7. כדי להקפיא את גלולה התא, resuspend בינוני קפוא ב 106 תא / מ"ל, למקם במיכל הקפאה, ולאחר מכן למקם אותם במקפיא -80 °C .C. לאחר השעה 24 שעות, העבר לאחסון LN2.
  3. הפצת תאים כהכנה לתרבות משותפת
    1. כדי לזרוע תאי MSC ו- MΦ מהמלאי הקפוא, יש לשוות 9 מ"ל של מדיום צמיחה מתאים שהוכן בסעיף 1.1 בכל אחד מארבעת תאי 100 מ"מ שטופלו בכל סוג תא ומקום בחממת תרבית התא למשך 15 דקות.
    2. בינתיים, להפשיר במהירות את aliquots של 106 תאים קפואים על ידי דגירה אותם באמבט מים 37 °C במשך 2-3 דקות או עד רק הפשרה. לאחר מכן, להוסיף את תאי MSC מופשרים 9 מ"ל של מדיום צמיחה MSC טרי ולהוסיף את תאי MΦ מופשרים 9 מ"ל טרי MΦ בינוני צמיחה ב 15 או 50 mL צינורות חרוט סטרילי וצנטריפוגה ב 125 x גרם רוטור דלי מתנדנד במשך 5 דקות.
    3. שאפו או דקו את supernatant ו resuspend כל גלולה ב 4 מ"ל של מדיום הצמיחה הטרייה המתאים על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה. הוסף 1 מ"ל של השעיית התא לכל אחת מארבע מנות 100 מ"מ עבור כל סוג תא כי כבר שיווי משקל בשלב 1.3.1.
    4. מחזירים את הכלים עם תאים לאינקובטור. לשנות את המדיום כל 2-3 ימים עד 70%-80% confluent.

2. זרע MSC במנות ניסיוניות, יום 1

הערה: לפני זריעת ה- MSC, עצב את פריסת הלוח הניסיונית 96 באר עבור ספקטרופוטומטריה פלואורסצנטית ואת השקופית התאית להדמיה דינמית. עבור צלחת 96-well, לאגף בארות ניסיוניות עם בארות המכילות תאים אבל לא להשתמש בהם בבדיקה. סמן לפחות ארבע בארות שישמשו עבור ריק ריאגנט (RBL). ראה טבלה 1 לקבלת תבנית 96-well לדוגמה וטבלה 2 לדוגמה של תבנית שקופית תאית בעלת 4 בארות. מומלץ צלחות שחור או לבן 96-באר עם תחתונים שקופים. שקופית תא זכוכית בורוסיליקט 1.5 מ"מ היא אופטימלית, אך ניתן להתאים את מספר התאים בהתאם לעיצוב המחקר. תרשים זרימת סיכום של השיטות הבאות כלול באיור 2.

  1. ב 70%-80% השפעה, לשאוף את מדיום הצמיחה מן התרבויות ב 100 מ"מ מנות ולהוסיף 5 מ"ל של PBS כדי לבודד את MSC.
  2. שאפו את ה-PBS, הוסיפו 2 מ"ל של 0.05% טריפסין/EDTA, והכניסו אותו לחממה התרבותית למשך 3-5 דקות.
  3. לאחר 3 דקות, בדוק את ניתוק התא באמצעות מיקרוסקופ הפוך. אם התאים מנותקים, המשך לשלב הבא; אם לא, להמשיך דגירה עוד 1-2 דקות. אין לדגור יותר מ-5-6 דקות.
  4. מוסיפים 5 מ"ל של מדיום צמיחה טרי למנה עם התאים המנותקים. שוטפים את המנה באמצעות תערובת טריפסין /בינוני ולאסוף תאים לתוך צינור חרוטי נקי, סטרילי 50 מ"ל באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית.
  5. צנטריפוגה ל-5 דקות ב-125 x גרם. שאפו את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 10 מ"ל של בינוני צמיחה טרי על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה.
  6. כדי לספור את התאים, להוסיף 10 μL של השעיית התא ל 30 μL של 0.4% פתרון כחול טריפן בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. לאחר מכן, pipette 10 μL של התערובת תחת כיסוי של תא ספירת hemocytometer.
  7. באמצעות מיקרוסקופ שדה הפוך או בהיר, עם המטרה 10x, לספור את התאים שאינם נגועים (קיימא) בארבעה מתוך 1 מ"מ2 ריבועים. חשב את מספר התא באמצעות הנוסחה: תאים/מ"ל = ספירת תאים/# 1 מ"מ2 ריבועים x גורם דילול x 104.
    הערה: לדוגמה זו, מספר הריבועים 1 מ"מ2 שנספרו הוא ארבעה, ומקדם הדילול הוא 4.
  8. השתמש במשוואה C1V1 = C2V2 כדי לחשב ולהכין השעיה של 1 x 105 תא /mL. הכן 1 מ"ל של מתלה תא / mL עבור כל עמודה של צלחת 96-well להיות מלא ו 0.75 מ"ל עבור כל תא של שקופית תא 4-טוב להיות מלא על פי עיצוב הצלחת.
    הערה: C1 = ספירת תאים, V1 = מה מחושב, C2 = 1 x 105, V2 = 5.50 מ"ל.
  9. קבע V1, הפחת אותו מן הרצוי 5.50 מ"ל של הנפח הכולל כדי לקבוע את הנפח של המדיום הטרי הדרוש כדי להכין את ההשעיה. הוסף את נפח התאים (V1)מההשעיה המקורית לנפח של מדיום טרי בסך הכל 5.50 מ"ל עם 1 x 105 תאים /mL.
  10. הוסף 100 μL של 1 x 105 תא / mL מתלה לכל באר של צלחת 96-well על פי עיצוב הצלחת באמצעות micropipettor רב ערוצית 530 μL לכל אחת מהבארות של שקופית התא באמצעות micropipette על פי עיצוב הצלחת. דגירה בן לילה.
    הערה: לניסוי זה, MSC מצופים בעמודות 1, 2, 3 ו- 6 של צלחת 96-well(טבלה 1)ובארות 1 ו -2 של שקופית תא 4-well(טבלה 2). לכן, לפחות 5.50 מ"ל של השעיה 1 x 105 תא / מ"ל מוכן. MΦ ב 80% מפגש מטופלים עם מתווכים דלקתיים באותו היום MSC הם זרעים בלוחות הניסוי.

3. הפעל את MΦ עם IFN-γ, יום 1

  1. הכן את מלאי מדיום ההפעלה ואת מלאי Γ IFN.
    1. עבור 200 מ"ל של מדיום הפעלה, להוסיף 40 מ"ג של BSA ל 200 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה ללא סרום ומסנן סטרילי באמצעות יחידת מסנן ואקום סטרילי 0.2 מיקרומטר חד פעמי.
    2. להכנת 0.1% BSA/PBS, יש להוסיף 20 מ"ג BSA ל-20 מ"ל של PBS. מערבולת להתמוסס. השתמש מסנן מזרק סטרילי 0.2 מיקרומטר כדי לסנן לתוך צינור חרוט נקי, סטרילי 50 מ"ל.
    3. הוסף 1 מ"ל של פתרון עקר 0.1% BSA / PBS ל 100 מיקרוגרם של Γ IFN-γ ליופילי כדי להשיג 100 מיקרוגרם / mL של פתרון מלאי. יש לאחסן 50 μL aliquots ב -20 °C (50 °F).
  2. הפעל את ה- MΦ באמצעות IFN-γ
    1. הוסף 2.5 μL של 100 מיקרוגרם / מ"ל של מלאי IFN-γ עבור כל 1 מ"ל של המדיום הדרוש. עבור כל צלחת 100 מ"מ להיות מופעל, להכין 10 מ"ל של אמצעי הפעלה המכיל IFN-γ בריכוז של 250 ננוגרם / מ"ל.
    2. שאפו את מדיום הצמיחה מתרבויות MΦ והחליפו אותו ב-5 מ"ל של מדיום ההפעלה ללא Γ IFN לשטיפה.
    3. שאפו את המדיום המשמש לשטיפה והחליפו אותו ב-10 מ"ל של IFN- γ מדיום הפעלה נוסף למנה הניסיונית ועם 10 מ"ל של מדיום הפעלה ללא תוספת לשליטה. לדגור על התרבויות במשך 16-24 שעות.

4. לבודד את MΦ ולהכין את התרבויות המשותפות, יום 2

  1. הסר את אמצעי ההפעלה מתאי MΦ והחלף אותו ב- 5 מ"ל של מדיום צמיחה טרי. לגרד בעדינות עם מרים תא ולאסוף את התאים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
  2. ספירת התאים באמצעות אי-הכללה כחולה של טריפן והמוציטומיה כמתואר עבור MSC ב, שלבים 2.6-2.7.
  3. באמצעות המשוואה בשלבים 2.8-2.9, להכין שתי השעיות נפרדות של 2 x 105 תאים / מ"ל, אחד עם תאים מהבקרה ואחד עם תאים מתרביות MΦ המטופלות.
    הערה: הכן 1 מ"ל של מתלה תא / mL עבור כל עמודה של צלחת 96-well להיות מלא ו 0.75 מ"ל עבור כל תא של שקופית תא 4-טוב להיות מלא על פי עיצוב הצלחת.
  4. שאפו בעדינות את המדיום מהבארות הניסיוניות של הלוח בן 96 הבאר המכיל MSC. באמצעות מיקרופיפט רב ערוצי, להוסיף 100 μL של מטופלים ואת השליטה MΦ התא השעיות בבארות הניסוי המתאים עם ובלי MSC על פי עיצוב הצלחת. דגירה בן לילה.
  5. שאפו בעדינות את המדיום מהגלישה התאית בעלת 4 הטובות המכילה MSC, ובאמצעות מיקרופיפט, הוסיפו 530 מיקרו-אל של מתלה תאי MΦ לבארות המתאימות בהתאם לעיצוב. דגירה בן לילה.

5. Phagocytosis אסאי, פלורסנט קינטי 96-טוב צלחת לקרוא, יום 3

  1. הגדר את הפרמטרים של ההסתה
    1. ביום של בדיקת, להפעיל את קורא צלחת פלורסנט ומחשב להגדיר את הטמפרטורה על המערכת ל 37 °C (7 °F).
    2. פתח את תוכנת System Pro ובדוק את סמל המכשיר בפינה הימנית העליונה כדי לקבוע אם המכשיר מחובר למחשב. אם העיגול האדום עם קו גלוי, לחץ על סמל הכלי ובחר את הכלי בחלון המוקפץ כדי ליצור את החיבור.
    3. בחר 'ניסוי חדש' כדי לגשת לחלון הנפתח 'עוזר הגדרת לוח'. מתפריט מסייע הגדרת לוחיות, בחר קבע את תצורת הגדרות הרכישה שלך.
    4. בחר מונוכרומט מתפריט ההגדרות עבור התצורה האופטית. בחר FL (פלואורסצנטיות) עבור מצב הקריאה וקינטי עבור סוג הקריאה.
    5. באותו חלוןתצורות, תחת קטגוריה , לחץ על אורכי גלולאחר מכן הגדר רוחב פס ל- 9 ננומטר עבור עירור ו- 15 ננומטר לפליטה.
    6. הגדר את מספר זוגות אורך הגל ל- 1. הגדר את אורכי הגל LM1 עד 510 ננומטר עבור עירור ו 540 ננומטר עבור פליטה.
    7. המשך בקטגוריות ובחר באפשרות 'סוג לוחית' הבא. בחר באפשרות התואמת לסוג הלוח הנמצא בשימוש.
      הערה: חשוב שהבחירה תתאים לסוג הלוח. גבהי הקריאה מוגדרים על-ידי המערכת בהתאם לבחירה.
    8. לאחר מכן, בחר קרא אזור והדגש את האזור של לוחית 96 הבאר הכלולה בעיצוב הניסיוני.
    9. בחר PMT ואופטיקה, הגדר רווח PMT גבוה והבזקים לקריאה ל 6. סמן את התיבה לצד קרא מלמטה אם אתה משתמש בלוח תחתית שקופה.
    10. בחר תזמון והגדר למרווחי זמן של 10 דקות על פני תקופה של 70 דקות.
    11. בחר שייק, סמן את התיבה לפני קריאה ראשונה והגדר עבור 5 s. סמן את התיבה בין קריאות והגדר עבור 3 s. הגדר את עוצמת הרעידות הן לנמוך והן ליניארי.
    12. סגור את החלון. כשחלון מסייע הגדרת לוחיות קופץ, בחר קבע את תצורת פריסת הלוח שלך. הדגש את בארות BL של עיצוב הצלחת ולחץ על צלחת ריקה.
    13. סמן כל אחת מהשורות הניסיוניות, לחץ על הוסף, תן שם לקבוצה ולאחר מכן בחר צבע.
    14. תחת אפשרויות הקצאה מתחת לעיצוב הלוח, בחר סידרהולאחר מכן הגדר את הסידרה בחלון ולחץ על אישור. חזור על הפעולה עבור כל קבוצה.
  2. הכן את ההשעיה הזימוסנית
    1. בזמן ההמתנה לטמפרטורת המערכת להגיע 37 °C (5 °F), resuspend 1 מ"ג של חלקיקי זימוסן ב 5 מ"ל של מדיום הדמיה של תאים חיים.
      1. הוסף 1 מ"ל של מדיום הדמיה של תאים חיים ל בקבוקון המכיל את החלקיקים ולאסוף אותם לתוך צינור תרבות זכוכית. לשטוף את בקבוקון עם 1 מ"ל נוסף של פתרון הדמיה ולהעביר לאותו צינור זכוכית כדי להבטיח כי כל החלקיקים מועברים. הוסף 3 מ"ל של פתרון הדמיה נוסף כדי להשיג 0.2 מ"ג / מ"ל של השעיית חלקיקים.
    2. מערבולת עם פולסים מהירים ל-30-60 שניות. לאחר מכן, השתמש sonicator בדיקה sonicate עם 60 פולסים מהירים.
      הערה: חשוב מאוד ליצור השעיה הומוגנית של חלקיקים ולא לתת את ההשעיה לשבת זמן רב מדי לפני הוספת בארות הניסוי. התגבשות חוזרת על הספירה במהירות. החלקיק לכל צפיפות התא עשוי להיות ממוטב בהתאם למקור, טיפול, וצפיפות של MΦ בשימוש. במחקרים שהוצגו, חלקיקי זימוסן מצומדים שימשו. עם זאת, ניתן גם כן. קולי ו- S. aureus מצומדים.
  3. מוסיפים זימוסן וקוראים את הצלחת
    1. שאפו את המדיום מהבארות הניסיוניות ושטפו 1x עם 100 מיקרול של פתרון הדמיית התא החי. יש לשטוף את בארות ה-RBL עם פתרון הדמיית התאים החיים גם כן.
    2. שאפו את פתרון הדמיית התאים החיים מבארות ניסיוניות ו-RBL והחליפו אותו ב-100 מיקרו-אל של השעיית החלקיקים הזימוסאנית שהוכנה בסעיף 5.2.
    3. פתח את מגש הלוחות של קורא הפלואורסצנטי באמצעות ממשק לוח המגע. הגדר את הצלחת, ללא המכסה, במגש עם באר A1 בפינה השמאלית העליונה. סגור את המגש באמצעות לוח המגע ולחץ על לחצן קרא הירוק בתפריט העליון.
    4. לאחר השלמת הקריאה, שמור את הקובץ בתיקיה המתאימה וייצוא את הנתונים בתבנית גיליון אלקטרוני על-ידי לחיצה על קובץ ובחירה באפשרות יצא.
    5. חשב את הפלואורסצנטיות היחסית הממוצעת ± SEM עבור כל קבוצת שכפול בכל נקודת זמן (10 דקות, 20 דקות, 30 דקות וכו ') בגיליון האלקטרוני (קובץ משלים 1) והעבר את הנתונים לתוכנת גרפים.
    6. השתמש בתבנית גרף קו כדי להציג את הנתונים ולהחיל ANOVA דו-כיווני (Time x Treatment/MSC כגורמים) ואחריו בדיקת ההשוואות המרובות של Tukey כדי לקבוע הבדלים בין קבוצות בודדות.
      הערה: בעוד קריאת לוחית 96-well מתבצעת, הכינו את לוח ההדמיה הדינמי לרכישת תמונה בזמן.. ודא כי ההדמיה הדינמית ממשיכה עם ניתוח של באר ניסיונית אחת בכל פעם.

6. Phagocytosis אסאי, הדמיה דינמית, יום 3

  1. הפעל את מערכת ההדמיה ואת המחשב. לחץ פעמיים כדי לפתוח את התוכנה. בחר את מצב התוכנית Pro.
  2. בדוק את אזור הבמה כדי לוודא שאין דגימות ושום דבר לא פוגע בתנועת הבמה. לאחר מכן, לחץ על כיול עכשיו.
  3. תחת תפריט הדגירה בסרגל הצד מימין, סמן את התיבה לצד H Unit XL והגדר אותה ל- 37 °C (70 °F).
    הערה: המתן עד שהשלב הדגירה יהיה כמעט לטמפרטורה לפני הכנת הדגימות להדמיה.
  4. לשטוף את הבאר הניסיונית הראשונה עם 750 μL של מדיום הדמיה ולהחליף אותו עם 400 μL של השעיית חלקיקי זימוסן מוכן בסעיף 5.2. השאר את שאר בארות במדיום הצמיחה.
    הערה: ייתכן שיהיה צורך מערבולת sonicate השעיית החלקיקים שוב בקצרה אם זה התיישב במשך יותר מ 15 דקות.
  5. הנח את השקופית על השלב הדגירה של מערכת ההדמיה. הגדר שעון זמן ל-10 דקות.
  6. השתמש בתוכנת ההדמיה, בחר ברייטפילד תחת הכרטיסיה איתור ולאחר מכן לחץ על סמל העין בחלון תצורת המערכת שלהלן. עם המטרה 10x במקום, להשתמש בעין ואת הידית התמקדות להתמקד בתאים.
  7. בחר בכרטיסיה רכישה, השתמש בתפריט הנפתח Experiment ולאחר מכן בחר קבוצה של אורכי גל הכוללת מסנן EGFP המוגדר כך שיכיל 509 ננומטר עירור 533 ננומטר אורכי גל פליטה של הצבע הרגיש ל- pH.
  8. כאשר נותרה ~ 2 דקות על שעון השעון, השתמש בתוכנה כדי לשנות את המטרה ל- 20x על ידי לחיצה על סמל 20x בתפריט האובייקטיבי.
    1. לחץ על תפריט ערוצים, בחר מסנני EGFP והשתמש בתפריט חשיפה כדי להגדיר את זמן החשיפה ל 400 ms כדי לזהות את פלואורופור ירוק רגיש ל- pH לאחר שהוא היה מוקף phagolysosome.
    2. לחץ על Live והתאם את המוקד באמצעות ידית המיקוד.
  9. לחץ על עצור כדי לכבות את האור ולסמן את התיבה לצד ההגדרה הניסיונית של זמן לשגות בחלק העליון.
  10. בתפריט אסטרטגיית מיקוד בחר מיקוד אוטומטי של תוכנה. מהפריט הנפתח בתפריט פוקוס אוטומטי, בחר הגדרות חכמות ו- גסות כדי לקצר את זמן החשיפה לאור בזמן שהמיקוד האוטומטי פועל.
  11. בתפריט Time-Lapse, הגדר את מספר הרכישות הרצוי ל- 30-60 ואת זמן המרווח לדקה אחת.
  12. לאחר שהפרמטרים של זמן לשגות מוגדרים ואחרי 10 דקות של תוספת של חלקיקים לבאר הראשונה, לחץ על כפתור התחל ניסוי כדי להתחיל ברכישה.
  13. כאשר הרכישה הושלמה באמצעות הבאר הניסיונית הראשונה, חזור על שלבים 6.4-6.12 עבור כל אחת מהבארות הניסיוניות הנותרות.
  14. שמור את כל קבצי הניסוי עם התאריך והפרמטרים בכותרת בתיקיה המתאימה.
  15. סגור את התוכנה. פתח מחדש את התוכנה במצב עיבוד וייצוא הקבצים בתבנית MP4 באמצעות תפריט ייצוא.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

לאחר חישוב ממוצע ± SEM עבור כל קבוצה בכל נקודות הזמן, הנתונים מוצגים בתבנית גרף קו עם ציר ה- Y כעוצמה פלואורסצנטית יחסית וציר ה- X כזמן. קובץ משלים 1 מספק דוגמה לנתונים גולמיים מקריאה קינטית של לוחית 96-well בתבנית גיליון אלקטרוני.

במחקר זה, התוצאות האופטימליות המוצגות באיור 3A, וטבלה 3 מדגימות כי 1) תרבות משותפת עם MSC משפרת את הפעילות הפגוציטית של המקרופאג', 2) טיפול IFN-y מפחית את הפעילות של המקרופאג', ו -3) תרבות משותפת עם MSC...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

ניתוח של פאגוציטוזיס באמצעות חלקיקים ביולוגיים הצומדים לצבע רגיש ל- pH הוא כלי חדש יחסית שהוכיח יתרון על פני חלקיקים מסורתיים המסומנים פלואורסצנטית12,19,20. עם חלקיקים מסורתיים המסומנים בפלואורסצנט, רק ניתוח נקודת קצה אפשרי. הזיהוי מתבצע באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית ו/או ספקטרופלואורומטריה לאחר כביסה או מרווה חלקיקים שלא נלקחו על ידי הפאגוציט. לנתונים כמותיים הנגזרים מספקטרופלואורומטריה יש פוטנציאל לזהות חלקיקים שאינם נבלעים...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים להצהיר עליהם.

תודות

עבודה זו נתמכה על ידי מנגנון מכשיר המחקר העיקרי של NSF תחת מספרי מענקים 1626093 1919583.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
96 בארות פוליסטירן שחור מיקרופלייטMilliporeSigmaCLS3603-48EA
0.4% תמיסה כחולה טריפאןMilliporeSigmaT8154-20ML
15 מ"ל 15 מ"ל ו-50 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן סטריליים חרוטייםThermoFisher339653
4 בארות כיסוי עם בארות שאינן ניתנות להסרהThermoFisher155382PK
אנטיביוטיקה-אנטי-פטריית (100X)  GibcoThermoFisher15240096
Axiobserver 7 מערכת הדמיהZeiss
סרום בקר אלבומין (BSA)MilliporeSigmaA8806-1G
מרים תאיםMilliporeSigmaCLS3008-100EA
צלוחיות תרבית, תרבית רקמות מטופלות, שטח פנים 75  cm2, צוואר משומר, עם מכסה,MilliporeSigmaC7231-120EA
D1 ORL UVA [D1]ATCCCRL-12424עכבר MSC Cell Line
DMEM, סרום בקר עוברי ThermoFisher 11965092
, מוסמך, מומת בחוםThermoFisher16140071
HemocytometerFisherScientific02-671-51B
I-11.15ATCCCRL-2470עכבר MΦ קו תאים
LADMAC קו תאיםATCCCRL-2420תאי LADMAC מפרישים את הגורם המגרה של מושבת גורם הגדילה 1 (CSF-1).
פתרון הדמיה של תאים חייםThermoFisherA14291DJ
PBS, pH 7.4ThermoFisher10010031
pHrodo Green Zymosan Bioparticles מצומדThermoFisherP35365
עכברים רקומביננטיים IFN-γPreprotech315-05
Spectramax i3Xמולקולריים
יחידות מסנן ואקום לשימוש חד פעמי, 250 מ"ל, 0.2 ומיקרו; mThermoFisher568-0020
מסנני מזרק סטריליים, 0.2 מיקרומטרThermoFisher723-2520
כלי תרבית שטופלו בתרבית רקמות, 100 מ"מ x 20 מ"מMilliporeSigmaCLS430167-100EA
Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדוםThermoFisher25300054
עם גלוקוז גבוה מכשירים סטריליים

מקורות

  1. Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair--current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
  2. Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
  3. Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
  4. Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988(2011).
  5. Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
  6. Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65(2013).
  7. Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088(2010).
  8. Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
  9. Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252(2010).
  10. Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
  11. Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
  12. Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56(2015).
  13. Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70(2014).
  14. Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257(2017).
  15. Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
  16. Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), Suppl 2 3-23 (2010).
  17. Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
  18. Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
  19. Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
  20. Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
  21. Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

ויסות תאי גזע מזנכימליים של מקרופאג' פאגוציטוזיס; כמות והדמיה
צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.