כאן, אנו מציגים פרוטוקול לביצוע נוקאאוטים של גנים שהם in vivo קטלניים עובריים בגידולים שמקורם במודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ולאחר מכן מעריכים את ההשפעה שיש לנוקאאוט על צמיחת הגידול, התפשטותו, הישרדותו, הגירה, פלישה, והתעתיק in vitro ו- in vivo.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הגדרת תפקודי גנים בגידולים סרטניים על ידי אבלציה Ex vivo של אללים פלוקסים בתאי גידול מעטפת עצב היקפית ממאירה
במאמר זה
סיכום
תקציר
פיתוח תרופות חדשות המכוונות במדויק לחלבונים מרכזיים בסרטן האדם משנה באופן יסודי את הטיפולים בסרטן. עם זאת, לפני שניתן יהיה להשתמש בתרופות אלה, חלבוני המטרה שלהן חייבים להיות מאומתים כמטרות טיפוליות בסוגי סרטן ספציפיים. אימות זה מבוצע לעתים קרובות על ידי דחיקת הגן המקודד את המטרה הטיפולית המועמדת במודל עכבר מהונדס גנטית (GEM) של סרטן וקביעת איזו השפעה יש לכך על צמיחת הגידול. למרבה הצער, סוגיות טכניות כמו קטלניות עוברית בנוקאאוטים קונבנציונליים ופסיפסיזם בנוקאאוטים מותנים מגבילים לעתים קרובות את הגישה הזו. כדי להתגבר על מגבלות אלה, פותחה גישה לניצול גן קטלני עוברי מרופט בעל עניין בתרביות קצרות טווח של גידולי מעטפת עצבים היקפיים ממאירים (MPNSTs) שנוצרו במודל GEM.
מאמר זה מתאר כיצד לבסס מודל עכברים עם הגנוטיפ המתאים, להפיק תרביות גידול קצרות טווח מבעלי חיים אלה, ולאחר מכן להפוך את הגן הקטלני העוברי הפגום באמצעות וקטור אדנובירלי המבטא את Cre recombinase וחלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (eGFP). לאחר מכן מפורט טיהור של תאים שעברו התמרה באמצעות אדנו-וירוס באמצעות מיון תאים המופעלים על-ידי פלואורסצנציה (FACS) וכימות ההשפעות שאבלציה גנטית מפעילה על התפשטות התאים, הכדאיות, השעתוק וצמיחת האלוגרפט האורתוטופי. מתודולוגיות אלה מספקות גישה יעילה וניתנת להכללה לזיהוי ואימות של מטרות טיפוליות במבחנה וב-in vivo. גישות אלה מספקות גם מקור מתחדש של תאים שמקורם בגידולים בעלי מעבר נמוך עם תוצרי גדילה מופחתים במבחנה . זה מאפשר לחקור את התפקיד הביולוגי של הגן הממוקד בתהליכים ביולוגיים מגוונים כמו הגירה, פלישה, גרורות ותקשורת בין-תאית המתווכת על ידי הסוד.
מבוא
לפני שני העשורים האחרונים, הטיפול בסרטן אנושי הסתמך במידה רבה על הקרנות וחומרים כימותרפיים שהתמקדו באופן נרחב באוכלוסיות תאיות המתרבות במהירות על ידי פגיעה בדנ"א או עיכוב סינתזת DNA. אף על פי שגישות אלה אכן עיכבו את צמיחת התאים הסרטניים, היו להן גם תופעות לוואי מזיקות על סוגי תאים נורמליים המתרבים במהירות, כגון תאי אפיתל במעיים ותאי זקיק שיער. לאחרונה, הטיפול בסרטן החל להשתמש בחומרים כימותרפיים המכוונים במדויק לחלבונים בתוך מסלולי איתות שהם בעלי חשיבות קריטית לצמיחת הניאופלזמה של המטופל הבודד. גישה זו, המכונה בדרך כלל "רפואה מדויקת", הובילה לפיתוח רפרטואר הולך ומתרחב של נוגדנים חד שבטיים ומעכבים מולקולריים קטנים. חומרים אלה מעכבים ביעילות את התפשטותם והישרדותם של תאי ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
לפני ביצוע הליכים כלשהם עם עכברים, כל ההליכים חייבים להיבדק ולאשר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים. הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית של דרום קרוליינה. פרוטוקול זה בוצע על ידי צוות מיומן כראוי בהתאם להנחיות המוסדיות של MUSC לטיפול בבעלי חיים.
1. דור של עכברים שמפתחים MPNSTs הומוזיגוטיים עבור אללים Erbb4 flox
- לייצר את הדור F1 של P 0-GGFβ3; Trp53+/-; Erbb4fl/+ בעלי חיים על ידי הזדווגות P 0-GGFβ3; Trp53+/- עכברים7 עם
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 4 ממחיש תוצאה אופיינית המתקבלת בעת התמרות P 0-GGFβ3; Trp53-/+; תאי MPNST מסוג Erbb4fl/fl עם אדנו-וירוס Ad5CMV-eGFP או אדנו-וירוס Ad5CMV-Cre/eGFP (איור 4A). תרביות נצפות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לזהות תאים המבטאים eGFP ועל ידי מיקרוסקופיה של ניגודיות פאזה כדי לקבוע את המספר הכולל של תאים הנמצאים באותו שדה ב-10x (למעלה) וב-40x (למטה). לאחר מכן ניתן לחשב את אחוז התאים המבטאים eGFP אם תרצה בכך. נתונ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
השיטות המפורטות שהוצגו כאן פותחו באמצעות מודל GEM של MPNSTs. עם זאת, אם ניתן לפזר את רקמת הגידול המעניינת לתאים בודדים, מתודולוגיות אלה ניתנות להתאמה בקלות לסוגי גידולים שונים הנובעים מ- GEMs. חשוב לוודא כי אלל floxed לא לגרום i) ירידה בהישרדות שיכולה להקשות על השגת עכברים מספיקים כדי לסנן גידולים, או ii) חביון גידול מוגבר שיכול להקשות על השגת מספיק עכברים נושאי גידול. אם האלל המנומר אינו משפיע על ההישרדות, ההישרדות של שתי הקבוצות תהיה שקולה. אם אין לו השפעה על חביון הגידול, מספרים שווים של עכברים נושאי גידול צריכים להופ.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכון הלאומי למחלות נוירולוגיות ושבץ מוחי (R01 NS048353, R01 NS109655), המכון הלאומי לסרטן (R01 CA122804), משרד ההגנה (X81XWH-09-1-0086, W81XWH-11-1-0498, W81XWH-12-1-0164, W81XWH-14-1-0073, ו- W81XWH-15-1-0193), והקרן לגידול ילדים (2014-04-001 ו-2015-05-007).
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Ad5CMV-eGFP | , אוניברסיטת איווה | VVC-U של איווה-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | ליבת וקטור העברת גנים, אוניברסיטת איווה | VVC-U של איווה-1174 | |
| alexa 568 נוגדן משני | תרמו/פישר | GaR A11036 | |
| תוכנת קוד פתוח ביו-מוליכים לביוקונפורמטיקה | http://www.bioconductor.org | כלי ניתוח סטטיסטי חלופי המשמש לשלב 4.4 | |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | תערובת של כלאטורים |
| ערכת צביעה DAB | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (מסד נתונים להערות, הדמיה וגילוי משולב) | DAVID https://david.ncifcrf.gov תוכנת ניתוח העשרה פונקציונלית המשמשת לשלב 4.5 | ||
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq ו-Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 ו-K1072 | |
| erbB4 נוגדנים | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 נוגדנים | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 נוגדנים | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace כלים ומקורות נתונים | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | משאב כללי למספר סוגים של כלים ביואינפורמטיים בקוד פתוח לשלב 4.5 |
| גלוטמין | קורנינג | 25-005- | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizTool | Gorilla | N/A, | תוכנת ניתוח העשרה פונקציונלית http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il המשמשת לשלב 4.5 |
| GSEA ניתוח העשרה של ערכת | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | תוכנת ניתוח העשרה פונקציונלית המשמשת לשלב 4.5 |
| HSD: עכברי Athymic Nude-FOxn1nu | Envigo (לשעבר Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (הדור הבא של רצף DNA) | Illumina | Hi Seq 2500 | רצף DNA המשמש לשלב 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar ביטוי גנים וניתוח וריאנטים | תוכנת DNAStar LaserGene | N/A | ניתוח סטטיסטי ונורמליזציה המשמש לשלב 4.4 |
| Lasergene: מכלול יישור רצף SeqMan NGen | יישור תוכנה המשמש לשלב 4.3 | יישור תוכנה N/A | המשמש לשלב 4.3 |
| Matrigel, מטריצת ממברנה בסיסית עם גורם צמיחה נמוך | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | בבית | נוצר על ידי SLC, זמין גם מסחרית מ- R & D מערכות (396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | תוכנת ניתוח העשרה פונקציונלית המשמשת לשלב 4.5 |
| Partek (מיישר ומנתח BWA) | Partek, Ver 7 | N/A | יישור תוכנה וסטטיסטיקה/נורמליזציה המשמשת לשלב 4.3 |
| Pen/ | Strep Corning | 30-002-Cl | |
| פריימר 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ | Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product ו-350 bp מוצר Floxed ErbB4; | |
| פריימר 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ | Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product ו-350 bp מוצר Floxed ErbB4; | |
| פריימר 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA | Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 מוצר ErbB4 מסוג פרא bp. | |
| פרופידיום יוד | פישר | 51-351-0 | |
| פרופיל פרוטאום מערכי פוספו-קינאז | R& D Systems | ARY003B | |
| בזמן אמת גלו | Promega | G9712 | בדיקת כדאיות תאים ביולומינסנט |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | תוכנת ניתוח העשרה פונקציונלית המשמשת לשלב 4.5 |
| טריזול (חומצה-קוונידיניום-פנול וריאגנט מבוסס כולורופורם) | Invitrogen | ||
| Tyramide | פרקין אלמר | NEL721001EA |
מקורות
- Ricciuti, B., et al. Antibody-drug conjugates for lung cancer in the era of personalized oncology. Seminars in Cancer Biology. 69, 268-278 (2019).
- Litak, J., Mazurek, M., Grochowski, C., Kamieniak, P., Rolinski, J. PD-L1/PD-1 axis in glioblast....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
