פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים
במאמר זה
סיכום
תקציר
בתאי עצב, אוריינטציה microtubule היה מעריך מפתח לזהות אקסונים שיש להם פלוס סוף החוצה microtubules ו דנדריטים כי בדרך כלל יש אוריינטציה מעורבת. כאן אנו מתארים שיטות לתיוג, תמונה וניתוח הדינמיקה והצמיחה של המיקרוטובלים במהלך הפיתוח וההתחדשות של נוירוני מגע ב- C. elegans. באמצעות כתבים פלואורסצנטיים מקודדים גנטית של טיפים מיקרוטובולים, צילמנו את microtubules האקסוני. ניתן לכמת את השינויים המקומיים בהתנהגות המיקרוטובול היוזם התחדשות אקסון בעקבות אקסוטומיה באמצעות פרוטוקול זה. בדיקה זו ניתנת להתאמה לנוירונים אחרים ורקעים גנטיים כדי לחקור את הרגולציה של דינמיקת microtubule בתהליכים תאיים שונים.
מבוא
לנוירונים יש ארכיטקטורה משוכללת עם תאים מיוחדים כמו דנדריטים, גופי תאים, אקסונים וסינפסות. הציטוסקלטון העצבי מורכב מהמיקרוטובולות, המיקרופילמנטים והנוירופילמנטים והארגון הייחודי שלהם תומך בתאים העצביים מבחינה מבנית ותפקודית1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . במהלך השנים, ארגון microtubule זוהה כגורם מכריע של קוטביות עצבית ותפקוד. כאשר נוירונים עובר....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
1. זן עיתונאי: תרבות ותחזוקה
הערה: כדי למדוד את הדינמיקה microtubule ואת הכיוון נוירונים PLM, השתמשנו בזן התולעת מבטא EBP-2::GFP תחת נוירון מגע ספציפי מקדם mec-4 (juIs338 allele)18,25,26. אנו משתמשים בתרבית תולעים סטנדרטית ושיטות תחזוקה עבור זן זה27.
- הכן את מדיום הצמיחה של נמטודה (3.0 גרם/ליטר נתרן כלורי, פפטונה 2.5 גרם/ל', 20.0 גרם/ליטר אגר, 10 מ"ג/ל' כולסטרול (מדולל מתמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל)) במים ומחלק אוטומטית את התערובת.
- מצננים את התערו....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדוגמה מייצגת, תיארנו בהתבוננות ב- vivo של שביט EBP במצב יציב וחדשות האקסונים של נוירוני PLM. נוירונים PLM ממוקמים באזור הזנב של התולעת עם תהליך ארוך הקדמי היוצר סינפסה ותהליך אחורי קצר. נוירוני PLM גדלים בכיוון הקדמי-אחורי קרוב לאפידרמיס ואחראים לתחושת המגע העדינה בתולעים. בשל המבנה הפשוט שלהם, ואת נוחות הדמיה ומיקרוכירורגיה, נוירונים PLM נחקרו בהרחבה עבור cytoskeleton microtubuleeשלהם, תחבורהאקסונית30,31, והתחדשות19
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
הבנת הדינמיקה של המיקרוטובלים הייתה מוקד מרכזי בתחום חקר הציטוסד לאורך השנים. Microtubules לעבור התגרענות וקטסטרופה יחד עם תהליך מתמשך של חוסר יציבות דינמית44,45,46,47. הרבה מידע זה הושג באמצעות מבינות כמו קריאות פיזור אור של טובולין חופשי לעומת פולימרי, בדיקות צמיחה microtubule מ טובולין פלואורסצנטי, וכו'48. בעוד שהתצפית החיה של מיקרוטובולות.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אינם מצהירים על ניגודי עניינים.
תודות
אנו מודים לישי ג'ין ואנדרו צ'יזהולם על התמיכה הראשונית והמתח ששימש במחקר. זן החיידקים OP50 היה הועיל מסחרית מהמרכז לגנטיקה Caenorhabditis (CGC) במימון משרד NIH של תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). אנו מודים גם לדהרמנדרה פורי על התקינה של ההליכים הניסיוניים. המחקר ממומן על ידי מענק הליבה של המרכז הלאומי לחקר המוח (נתמך על ידי המחלקה לביוטכנולוגיה, הממשלה של הודו), מענק קריירה מוקדמת של ברית הודו DBT/Wellcome Trust India (מענק # IA/E/18/1/504331) ל- S.D., מענק הביניים של ברית ברית הודו של Wellcome Trust-DBT (מענק # IA / IA / I/13/1/500874) ל- A.G.-R ומענק מוועדת המחקר המדעי וההנדסי (SERB: CRG/2019/002194) ל-א.ג.-ר
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| CZ18975 זן תולעת | Yishi Jin מעבדה | CZ18975 | נוצר על ידי Anindya Ghosh-Roy |
| Agarose | Sigma | A9539 | תולעי הרכבה |
| Coverslip (18 מ"מ x 18 מ"מ) | Zeiss | 474030-9010-000 | תולעי הרכבה |
| אמבטיה יבשה עם בלוק חימום | Neolab | תולעי הרכבה | |
| שקופיות זכוכית (35 מ"מ x 25 מ"מ) | כוכב | כחולתולעים הרכבה | |
| תמיסת חרוזי פוליסטירן (4.55 x 10^13 חלקיקים/מ"ל במדיום מימי עם חומר פעילי שטח מינימלי) | Polysciences Inc. | 00876 | תולעים הרכבה |
| מבחנות מבחנות | תולעים הרכבה | ||
| OP50 זן חיידקי | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | OP50 | טיפול בתולעים |
| 60 מ"מ לוחות פטרי | Praveen Scientific | 20440 | שואב טיפול בתולעים |
| / נימי | VWR | 53432-921 | חממה לטיפול בתולעים |
| Panasonic | MIR554E | טיפול בתולעת | |
| חוט | טיפול בתולעת | ||
| סטריאומיקרוסקופ עם חיבור פלואורסצנטי | Leica | M165FC | טיפול בתולעים |
| 0.3% נתרן כלורי | סיגמא | 71376 | גידול נמטודות בינוני |
| 0.25% פפטון | T M מדיה | 1506 | נמטודה גידול בינוני |
| 10 מ"ג/מ"ל כולסטרול | סיגמא | C8667 | גידול נמטודות בינוני |
| 1 מ"מ סידן כלוריד דיהידראט | סיגמא | 223506 | גידול נמטודות |
| בינוני 1 מ"מ מגנזיום סולפט הפטאהידרט | סיגמא | M2773 | גידול נמטודות בינוני |
| 2% אגר | T M מדיה | 1202 | מדיום גידול נמטודה |
| 25 מ"מ מונו-בסיסי אשלגן דימימן פוספט | סיגמא | P9791 | מדיום גידול נמטודות |
| 0.1M מונו-בסיסי אשלגן דימימן פוספט | Sigma | P9791 | 1X M9 מאגר |
| 0.04M נתרן כלורי | סיגמא | 71376 | 1X M9 מאגר |
| 0.1M אמוניום כלוריד | פישר סיינטיפיק | 21405 | 1X M9 מאגר |
| 0.2M דייסודיום מימן פוספט הפטהידראט | Sigma | S9390 | 1X M9 מאגר |
| בקבוקי זכוכית | Borosil | אחסון מאגר | |
| 488 ננומטר לייזר | Zeiss | Imaging | |
| 5X אובייקטיבי | Zeiss | הדמיה | |
| 63X אובייקטיבי | Zeiss | ||
| מצלמת | הדמיה פוטומטריה | Evolve 512 Delta | Imaging |
| Computer System for Spinning Disk unit | HP | Intel ® Xeon CPU E5-2623 3.00GHz | הדמיה |
| מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי | Zeiss | Observer.Z1 | הדמיה |
| מנורת הלוגן | Zeiss | הדמיה | |
| כספית מנורת קשת | Zeiss | הדמיה | |
| יחידת דיסק מסתובב | Yokogawa | CSU-X1 | הדמיה |
| ZEN2 תוכנה | Zeiss | Imaging | |
| Image J (פיג'י גרסה) | ניתוח ועיבוד תמונה | ||
| Adobe Creative Cloud | Adobe ניתוח ועיבוד תמונות | ||
| מערכת מחשב לניתוח תמונות | Dell | Intel ® ליבה ומסחר; i7-9700 מעבד 3.00GHz | עיבוד/ייצוג תמונה |
מקורות
- Bush, M. S., Eagles, P. A. M., Gordon-Weeks, P. R. The neuronal cytoskeleton. Cytoskeleton: A Multi-Volume Treatise. 3, 185-227 (1996).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Building the Neuronal Microtubule Cytoskeleton. Neuron. 87 (3), 492-506 (2015).
- Tas, R. P., Kapitein, L. C.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
