הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

פרופיל N-גליקן של גליקופרוטאינים על ידי אינטראקציה הידרופילית כרומטוגרפיה נוזלית עם פלואורסצנציה וזיהוי ספקטרומטרי מסה

1.3K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62751

⸱

25 בספטמבר 2021

 , 
1Department of Biomedical Engineering, Karabuk University, 2Department of Chemistry, Hacettepe University

במאמר זה

סיכום

פרופיל N-גליקן של גליקופרוטאינים חיוני לגילוי סמנים ביולוגיים חדשים ולהבנת תפקודי הגליקן באירועים תאיים. בנוסף, ניתוח N-glycan של ביו-פרמצבטיקה חלבונית חשוב מאוד לשימוש בבני אדם. במאמר הנוכחי הוצגה אסטרטגיה בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי וכימות מבני N-גליקן באמצעות טכניקת HILIC-FLD-MS/MS.

תקציר

גליקוזילציה היא שינוי חיוני שנמצא בחלבונים. פרופיל N-גליקן של גליקופרוטאינים נדרש כדי לזהות מועמדים חדשים לסמנים ביולוגיים ולקבוע שינויים בגליקן במחלות. רוב החלבונים הביו-פרמצבטיים הזמינים מסחרית הם גליקופרוטאינים. יעילותן של תרופות אלו מושפעת מדפוסי גליקוזילציה. לכן, יש צורך בשיטת אפיון מעמיקה עבור ה-N-גליקנים. כאן, אנו מציגים גישה מקיפה לניתוח איכותי וכמותי של N-גליקנים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית של אינטראקציה הידרופילית המצוידת בזיהוי פלואורסצנטי וספקטרומטריית מסה טנדם (HILIC-FLD-MS/MS). N-גליקנים שוחררו מגליקופרוטאינים בשיטה קלה וסומנו על ידי תג פלואורופור פרוקאינאמיד באסטרטגיה. לאחר מכן, הפרוקאינמיד המסומן N-גליקנים נותח בטכניקת HILIC-FLD-MS/MS. בגישה זו, מבני N-גליקן אושרו על ידי ניתוח ספקטרומטרי מסה טנדם, בעוד שזיהוי פלואורסצנטי שימש לניתוח הכמותי. יישום לניתוח נתונים של פסגות ה-N-גליקן שזוהו מתואר במחקר. ניתן ליישם פרוטוקול זה על כל גליקופרוטאין המופק ממינים שונים.

מבוא

גליקוזילציה היא שינוי חיוני לאחר התרגום שנצפה בחלבונים1. תהליכים אנזימטיים מרובים מווסתים את שינוי הגליקוזילציה באורגניזמים תאיים. גליקנים מחוברים לחלבונים על ידי תהליכים אנזימטיים אלה, והחלבונים הנתונים לשינוי זה נקראים גליקופרוטאינים1. שני סוגי גליקוזילציה נצפים בדרך כלל בחלבונים. O-גליקוזילציה היא הצמדה של O-גליקנים לשרשרת הצדדית של שאריות חומצות אמינו סרין או תראונין. N-גליקוזילציה היא הצמדה של N-גליקנים לשרשרת הצד של שאריות חומצות אמינו אספרגין בחלבון.

המבנה, היציבות והקיפול של החלבונים מושפעים מחיבורי גליקן2. תהליך הגליקוזילציה משפיע באופן דרמטי על תפקודי החלבונים, וגליקופרוטאינים מווסתים תפקודים תאיים רבים באורגניזמים 3,4. לדוגמה, חלבונים מגליקוזיליים בכבדות מגנים על הגליקופרוטאינים שלהם מפני פירוק פרוטאוליטי5. דוגמה נוספת היא גליקנים של חלבוני בלוטת התריס המווסתים את הובלת Tg וסינתזת הורמונים 6,7. כדי להסביר את תפקידם באירועים תאיים, נדרש אפיון מעמיק של גליקופרוטאינים8.

פרופילי N-גליקן של הגליקופרוטאינים משתנים במצבי מחלה 9,10,11,12. פרופיל N-גליקנים שמקורם בגליקופרוטאינים חיוניים או נוזלי גוף נדרש כדי לגלות סמנים ביולוגיים חדשים ולהבין את השינויים בפעילות האנזימטית במקרי מחלה. מצד שני, רוב התרופות הביולוגיות של החלבונים הן גליקופרוטאינים, ופרופילי הגליקן שלהם משפיעים על יעילות התרופות13. לכן, יש לבצע שיטה מקובלת של פרופיל N-גליקן בפיתוח ביו-פרמצבטיקה חלבונית מתאימה לשימוש אנושי14.

גליקומיקס היא דיסציפלינה מתפתחת המשמשת לזיהוי וכימות מבני גליקן של מולקולות מגליקוזיל15,16. שיטות רבות שימשו לפרופיל הגליקנים של מינים מסוכררים, כולל NMR17 ו-MS18. כרומטוגרפיה נוזלית אינטראקציה הידרופילית-עם זיהוי פלואורסצנטי (HPLC-HILIC-FLD) היא שיטת תקן הזהב לפרופיל N-גליקנים שמקורם בגליקופרוטאינים19. כאשר אסטרטגיה זו משולבת עם זיהוי ספקטרומטרי מסה, זיהוי מבני N-גליקן יכול להיות קל ואמין יותר. לרוב תגי הקרינה המשמשים בניתוח N-glycan עם ספקטרומטריית מסה יש יעילות יינון נמוכה. לעומת זאת, פרוקאינמיד מגביר את יעילות היינון של N-גליקנים, המשמש להשגת ספקטרום מסה טנדם יעיל של מבני N-גליקן 20,21. ניתן להשיג שברים ספציפיים מאסטרטגיה זו על ידי ספקטרומטריית מסה טנדם לזיהוי מבני של N-גליקנים כגון פוקוסילציה ליבה22 (proc-HexNAc1Fuc1) וסוגי חצייה23 (proc-Hex1HexNAc3, proc-Hex1HexNAc3Fuc1).

מחקר זה מדגים פרוטוקול קל לפרופיל N-גליקן של גליקופרוטאינים עם HILIC-FLD-MS/MS. השיטה המוצגת כוללת ארבעה שלבים: (1) שחרור N-גליקנים מגליקופרוטאינים, (2) תיוג של N-גליקנים על ידי תג פרוקאינמיד, (3) טיהור הפרוקאינמיד המסומן N-גליקנים, ו-(4) ניתוח נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

הערה: הפלזמה האנושית המשמשת זמינה מסחרית (טבלת חומרים). לא נעשה שימוש בדגימות ביולוגיות נוספות שנלקחו מבני אדם.

1. שחרור גליקן

  1. דנטורציה של חלבונים (גליקו-)
    1. הכן את תקני הגליקופרוטאין (למשל, IgG, נוגדן חד שבטי) בריכוז של 10 מיקרוגרם·μL-1 ב-H2O נטול יונים. עבור פלזמה אנושית, הריכוז המשמש הוא 70 מיקרוגרם·μL-1.
      הערה: יש לערבב את הדגימות עד להמסת כל החלבונים המוצקים. פלזמה אנושית (ליופיליזציה) שימשה להכנת דגימות הפלזמה.
    2. קח 20 מיקרוליטר של דגימות גליקופרוטאין (200 מיקרוגרם) ופלזמה אנושית שעברה ליופיליזציה (1.4 מ"ג).
    3. הוסף 40 מיקרוליטר של 2% SDS (נתרן דודציל סולפט) (w/v).
    4. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי לנטרל את החלבונים (גליקו).
      הערה: ניתן לערבב את הדגימות ב-500 סל"ד על ידי תרמו-מערבל במהלך הדגירה. ניתן להשתמש באמבט מים רועדים לחלופין.
  2. שחרור גליקן
    1. הוסף 20 מיקרוליטר של 4% Igepal-CA630 לדגימות משלב 1.1.4.
    2. הוסף 20 מיקרוליטר של 5x PBS (מי מלח מאגר פוספט).
    3. הכן אנזים PNGase F בריכוז של 1 U·μL-1 במים נטולי יונים.
    4. הוסף 1U של אנזים עבור תקני גליקופרוטאין ו-2 U של אנזים עבור דגימות פלזמה אנושיות.
    5. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.
  3. תיוג פרוקאינמיד
    1. הכן תמיסת תיוג באמצעות חומצה הידרוכלורית פרוקאינאמיד (110 מ"ג · מ"ל -1 ב- DMSO / AA (דימתיל סולפוקסיד / חומצה אצטית קרחונית ) 7/3, v/v).
    2. הכן תמיסת אמינציה רדוקטיבית באמצעות נתרן ציאנובורוהידריד (65 מ"ג·מ"ל-1 ב-DMSO /AA, 7/3, v/v).
      זהירות: נתרן ציאנובורוהידריד רעיל מאוד ודליק. ללבוש מגני עיניים. קומפלקס בוראן 2-פיקולין (107 מ"ג·מ"ל-1 ב-DMSO ) יכול לשמש לחלופין.
    3. מערבבים תמיסות אלה ביחס של 1:1, v/v להכנת תערובת התיוג.
    4. הוסף 100 מיקרוליטר מתערובת תיוג זו לדגימת הגליקן ששוחררה משלב 1.2.5.
    5. דגרו את הדגימות בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.

2. טיהור פרוקאינמיד המסומן N-גליקנים על ידי מחסנית מיצוי פאזה מוצקה (SPE)

  1. הכן תמיסה של תאית מיקרו-קריסטלית (100 מ"ג·מ"ל-1) במים נטולי יונים.
  2. קח 300 מיקרוליטר של תאית מיקרו-קריסטלית והכנס אותה לצינורות המיקרו-צנטריפוגה.
  3. שטפו את התאית המיקרו-קריסטלית עם 1 מ"ל של H2O נטול יונים.
  4. שטפו את התאית המיקרו-קריסטלית עם 1 מ"ל ACN/MQ (אצטוניטריל/dH2O), 85/15, v/v למיזוג
    הערה: יש להשתמש במיקרו-צנטריפוגה למשך דקה אחת כדי להשליך תמיסות כביסה בזהירות.
  5. קח 120 מיקרוליטר של תמיסת שחרור גליקן וערבב עם 680 מיקרוליטר ACN כדי להשיג תנאי טעינה נאותים (85/15, v/v, ACN/דגימה).
  6. מערבבים תערובת זו עם תאית מיקרו-קריסטלית בצינורות המיקרו-צנטריפוגה.
  7. דגרו אותו בטמפרטורת החדר בתרמו-מיקסר על ידי ניעור ב-500 סל"ד למשך 15 דקות.
  8. העבר את התרחיץ למחסנית SPE (קיבולת נפח של 1 מ"ל).
    הערה: אל תאפשר כניסת אוויר לאריזת מיכל הדיו.
  9. השליכו את תמיסות הטעינה על ידי מעבר איטי (טיפה אחת לשנייה).
    הערה: ודא שמערכת SPE מחוברת למשאבת הוואקום. ממיסים עשויים לזרום בכוח הכבידה. במידת הצורך, יש למרוח ואקום באמצעות משאבת ואקום. יש לכוונן כראוי את לחץ הוואקום המופעל כדי להעביר נוזלים למטה לאט.
  10. שטפו את הדגימה על ידי העברת 1 מ"ל של תמיסת ACN/MQ/TFA (אצטוניטריל/dH2O/חומצה טריפלואורואצטית) (85/14/1, v/v/v) פעמיים.
  11. שטפו את הדגימה על ידי העברת 1 מ"ל של תערובת ACN/MQ (85/15, v/v) פעמיים.
  12. הסירו את הפרוקאינמיד המסומן N-גליקנים עם 0.75 מ"ל מים.
  13. יבש את תמיסת הפליטה עם רכז למשך הלילה.
    הערה: השתמש בטמפרטורת ריכוז של 45 מעלות צלזיוס לייבוש.
  14. ממיסים את הדגימות המיובשות בתערובת של 100 מיקרוליטר ACN/MQ (75/25, v/v) ומעבירים תמיסה זו לבקבוקונים, כולל תוספת.
    הערה: יש לערבב את הדגימות המומסות מחדש למשך 20 שניות.

3. ניתוח HILIC-FLD-MS/MS

  1. הכנס מתאמי Tee (T) לעמודת HILIC כדי להפריד את הזרימה לשני הנפחים השווים. חבר אחד משניהם לגלאי FLD, השני לגלאי MS.
    הערה: קווי הזרימה חייבים להיות באותם אורכים.
  2. התאם תוכנית שיפוע להפרדות HILIC של פרוקאינמיד המסומנות N-גליקנים כפי שמצוין באיור משלים 1. השתמש בשלב נייד א': פורמט אמוניום של 50 מ"מ (pH: 4.4 ושלב נייד ב': 100% ACN).
    הערה: ניתן לבצע אופטימיזציה נוספת של תוכנית השיפוע בהתאם להטרוגניות הגליקן של הדגימות.
  3. לחץ על כפתור הסמפלר והגדר את עוצמת ההזרקה ל-10 מיקרוליטר.
  4. לחץ על Column Comp והתאם את טמפרטורת העמודה ל-60 מעלות צלזיוס.
  5. לחץ על FLD והתאם את אורכי הגל של עירור FLD ופליטה ל-310 ננומטר ו-370 ננומטר, בהתאמה.
  6. התאם את מקור MS, כוונון ופרמטרים MS/MS כפי שמוצג באיור משלים 2.
    הערה: ניתן לשנות את הפרמטרים MS ו-MS/MS בהתאם לספקטרומטריית המסה המשמשת בניתוח.

4. ניתוח נתונים

  1. זיהוי פרוקאינמיד המסומן N-גליקנים
    1. ייצא נתוני MS/MS בפורמט מתאים לחיפושים במסד נתונים (למשל, .mgf, .xml).
    2. הכנס אותם לכלי חיפוש במסד נתונים לזיהוי N-גליקנים.
    3. בחר את שם המדגם המופיע בתוכנה ולחץ על כפתור חיפוש הגליקן לזיהוי פרוקאינמיד המסומן N-גליקנים באמצעות מסד הנתונים של Carbbank עם פרמטרים נתונים (איור משלים 3).
    4. פתח את כפתור עריכת הכרומטוגרמות בתוכנת ניתוח הנתונים עבור נתונים גולמיים ובחר סוג כרומטוגרמה של יונים שחולצו על ידי סינון בכל MSn.
    5. הוסף מסות ספציפיות עבור שבר פוקוסיל ליבה proc-N1F1 (m/z 587.3+) ושברים חצויים proc-H1N3 (m/z 1009.5+) ו-proc-H1N3F1 (m/z 1155.5+).
    6. קבע את הקודמנים המכילים שברי מבנה N-גליקן מפוקוסילטים וחצויים.
    7. ייצא את מבני ה-N-גליקן שזוהו על ידי התוכנה (טבלה משלימה 1-3).
    8. בדוק את הקודמנים שזוהו באופן ידני לקביעת מבני N-גליקן מפוקוסילטים וחצויים.
  2. כימות של פרוקאינמיד המסומן N-גליקנים על ידי תוכנת קוד פתוח24
    1. בחר כרומטוגרמה FLD בכרומטוגרמות ולחץ על השיטה בתוכנה. פתח שיטה לייצוא כרומטוגרמות כתבנית קובץ .xy.
    2. המר את תבנית הקובץ .xy של כרומטוגרמות מיוצאות לקבצי .txt.
    3. פתח את תוכנת הניתוח הכמותי.
      הערה: ניתן להוריד את התוכנה ששימשה במחקר ממקור Github (https://github.com/Tarskin/HappyTools).
    4. עקוב אחר ההוראות וההדרכות של התוכנית שהוצגה על ידי המפתח.
      הערה: מומלץ להשתמש בתהליך אצווה לייצוא אזורים יחסיים.
    5. התאם את פרמטרי ההגדרה (איור משלים 4). הגדר ארבע פסגות מינימליות ו-27 יחסי אות/רעש לכיול.
    6. פתח את קובץ התוצאות עם תוכנה מתאימה כגון Microsoft Excel להערכה נוספת.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

בגישה המוצגת זו, ה-N-גליקנים שוחררו לראשונה, סומנו על ידי תג הפרוקאינמיד וטוהרו על ידי מחסניות SPE המכילות תאית. לאחר מכן, ניתוח N-glycan של IgG, trastuzumab ופלזמה אנושית בוצע על ידי מערכת HPLC-HILIC-FLD-MS/MS. הכרומטוגרמות MS (שיא הבסיס) וה-FLD של מבני ה-N-גליקן שנקבעו המתקבלים מ-IgG ו-trastuzumab מוצגות באיור 1, בהתאמה. נתוני MS/MS שהתקבלו מניתוחים אלה יובאו לתוכנה וחיפשו מול מסד נתונים של גליקן. הערות MS/MS לדוגמה של מבני גליקן מספקטרום MS/MS ניתנות באי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרופיל N-גליקן של גליקופרוטאינים כולל שלבים מאתגרים. למרות שישנן מתודולוגיות רבות ושונות למטרה זו, יש לבחור גישה מתאימה הן לזיהוי והן לכימות של מבני N-גליקן 14. HILIC-FLD היא גישת תקן הזהב לכימות של N-גליקנים. עם זאת, זיהוי של כל סוגי ה-N-גליקן על ידי זיהוי FLD אינו מושג. לכן, יש צורך בניתוח טרשת נפוצה טנדם לאישור מבני N-גליקן שמקורם בגליקופרוטאינים. על ידי השילוב של זיהוי FLD ו-MS באותה מערכת, ניתוח ה-N-גליקנים

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין מה לחשוף.

תודות

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי משרד הפיתוח-הרפובליקה של טורקיה עם מספר פרויקט: 2016 K121230. בקיר סאלח מודה בהכרת תודה לאקדמיה הטורקית למדעים (TUBA) על התמיכה הכספית החלקית.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
חומצה אצטיתקרלו ארבה ריאגנטים401413קרחוני RS עבור LC/MS
אצטוניטרילMerck1000292500LC-MS LiChrosolv
Agilent 1200 סדרת HPLC עם 1260 סדרה FLD dedectorAgilent Technologies
אמוניום פורמטקרלו ארבה ריאגנטים419741עבור LC/MS
Bruker TIMS-TOF (Q-TOF) ספקטרומטריית מסהBruker Daltonics
CelluloseSigma Aldrich310697מיקרו-קריסטלי, אבקה, 20 μ m
ריאגנטים של מים נטולי יוניםקרלו ארבה412111 עבור LC/MS
דימתיל סולפוקסידסיגמא אולדריץ'41639BioUltra, לביולוגיה מולקולרית, ≥ 99.5% (GC)
צינור SPE פוליפרופילן ריק עם פריטי PESigma Aldrich5422020 μ נקבוביות m, נפח 1 מ"ל
סעפת מיצוי, מים 20 עמדותWAT200607להשלים עם מתלה לצינורות 13 x 100 מ"מ
פלזמה אנושיתסיגמא אולדריץ'P9523ליופיליזציה
IGEPAL CA-630סיגמא אולדריץ'I8896לביולוגיה מולקולרית
IgGSigma AldrichI4506אבקה ליופילית
פוספט חוצץ מלחSigma AldrichP4417טבליה
PNGase F אנזיםPromegaV483A
Procainamide hydrochlorideabcamab120955
נתרן ציאנובורוהידרידSigma Aldrich156159ריאגנט דרגה, 95%
נתרן דודציל סולפטSigma Aldrich71725
trastuzumabRoche Diagnostics
חומצה טריפלואורואצטיתSigma Aldrich302031עבור HPLC, ≥ 99.9%

מקורות

  1. Dwek, R. A. Glycobiology: Toward understanding the function of sugars. Chemical Reviews. 96 (2), 683-720 (1996).
  2. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2016).
  3. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43(2002).
  4. Apweiler, R., Hermjakob, H., Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database. Biochimica et Biophysica Acta. 1473 (1), 4-8 (1999).
  5. Stavenhagen, K., et al. and O-glycosylation Analysis of Human C1-inhibitor Reveals Extensive Mucin-type O-Glycosylation. Molecular & Cellular Proteomics. 17 (6), 1225-1238 (2018).
  6. Ząbczyńska, M., Kozłowska, K., Pocheć, E. Glycosylation in the Thyroid Gland: Vital Aspects of Glycoprotein Function in Thyrocyte Physiology and Thyroid Disorders. International Journal of Molecular Sciences. 19 (9), (2018).
  7. Mallet, B., et al. N-Glycans Modulate in Vivo and in Vitro Thyroid Hormone Synthesis: Study at the N-Terminal Domain Of Thyroglobulin. Journal of Biological Chemistry. 270 (50), 29881-29888 (1995).
  8. Dong, X., et al. Advances in mass spectrometry-based glycomics. Electrophoresis. 39 (24), 3063-3081 (2018).
  9. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  10. Koçak, ÖF., et al. N-glycan profiling of papillary thyroid carcinoma tissues by MALDI-TOF-MS. Analytical Biochemistry. 584, 113389(2019).
  11. Peng, W., et al. Clinical application of quantitative glycomics. Expert Review of Proteomics. 15 (12), 1007-1031 (2018).
  12. Yaman, M. E., Kayili, H. M., Albayrak, M., Kadioglu, Y., Salih, B. Differential N-glycosylation profiling of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) invasive ductal carcinoma tissues using MALDI-TOF-MS. Molecular Omics. 17 (3), 394-404 (2021).
  13. Liu, L. Antibody Glycosylation and Its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (6), 1866-1884 (2015).
  14. Zhang, L., Luo, S., Zhang, B. Glycan analysis of therapeutic glycoproteins. mAbs. 8 (2), 205-215 (2016).
  15. Hart, G. W., Copeland, R. J. Glycomics Hits the Big Time. Cell. 143 (5), 672-676 (2010).
  16. West, C. M., Malzl, D., Hykollari, A., Wilson, I. B. H. Glycomics, Glycoproteomics, Glycogenomics: An Inter-Taxa Evolutionary Perspective. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100024(2021).
  17. Unione, L., et al. Glycoprofile Analysis of an Intact Glycoprotein As Inferred by NMR Spectroscopy. ACS Central Science. 5 (9), 1554-1561 (2019).
  18. Morelle, W., Michalski, J. -C. Analysis of protein glycosylation by mass spectrometry. Nature Protocols. 2 (7), 1585-1602 (2007).
  19. Reusch, D., et al. Comparison of methods for the analysis of therapeutic immunoglobulin G Fc-glycosylation profiles--part 1: separation-based methods. mAbs. 7 (1), 167-179 (2015).
  20. Keser, T., Pavić, T., Lauc, G., Gornik, O. Comparison of 2-Aminobenzamide, Procainamide and RapiFluor-MS as Derivatizing Agents for High-Throughput HILIC-UPLC-FLR-MS N-glycan Analysis. Frontiers in Chemistry. 6, 324(2018).
  21. Kozak, R. P., Tortosa, C. B., Fernandes, D. L., Spencer, D. I. R. Comparison of procainamide and 2-aminobenzamide labeling for profiling and identification of glycans by liquid chromatography with fluorescence detection coupled to electrospray ionization-mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 486, 38-40 (2015).
  22. Nwosu, C., Yau, H. K., Becht, S. Assignment of Core versus Antenna Fucosylation Types in Protein N-Glycosylation via Procainamide Labeling and Tandem Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 87 (12), 5905-5913 (2015).
  23. Kayili, H. M. Identification of bisecting N-glycans in tandem mass spectra using a procainamide labeling approach for in-depth N-glycan profiling of biological samples. International Journal of Mass Spectrometry. 457, 116412(2020).
  24. Jansen, B. C., et al. HappyTools: A software for high-throughput HPLC data processing and quantitation. PLOS ONE. 13 (7), 0200280(2018).
  25. Ruhaak, L. R., et al. Glycan labeling strategies and their use in identification and quantification. Analytical and bioanalytical chemistry. 397 (8), 3457-3481 (2010).
  26. Rojas-Macias, M. A., et al. Towards a standardized bioinformatics infrastructure for N- and O-glycomics. Nature Communications. 10 (1), 3275(2019).
  27. Everest-Dass, A. V., Abrahams, J. L., Kolarich, D., Packer, N. H., Campbell, M. P. Structural feature ions for distinguishing N- and O-linked glycan isomers by LC-ESI-IT MS/MS. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (6), 895-906 (2013).
  28. Li, X., Xu, Z., Hong, X., Zhang, Y., Zou, X. Databases and Bioinformatic Tools for Glycobiology and Glycoproteomics. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6727(2020).
  29. Qing, G., Yan, J., He, X., Li, X., Liang, X. Recent advances in hydrophilic interaction liquid interaction chromatography materials for glycopeptide enrichment and glycan separation. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 124, 115570(2020).
  30. Reiding, K. R., et al. Human Plasma N-glycosylation as Analyzed by Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance-MS Associates with Markers of Inflammation and Metabolic Health. Molecular & Cellular Proteomics. 16 (2), 228-242 (2017).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.