פיתוח רצועה חיסונית של זרימה רוחבית לגילוי מהיר וכמותי של תרכובות מולקולות קטנות

תקציר

רצועות אימונוכרומטוגרפיות זרימה לרוחב מבוססות ממברנה (ICSs) הן כלים שימושיים לאבחון עצמי בעלות נמוכה ויושמו ביעילות על רעלן, אינדקס פיזיולוגי וזיהוי סמנים ביולוגיים קליניים. בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאור מפורט של השלבים לפיתוח אימונואסי מהיר, רגיש וכמותי לרוחב (באמצעות AuNPs כסמן ו- mAbs כגשוש). ההליך מתאר את ההכנה והאפיון של זהב קולואידי, סינתזה של מצומד AuNP-mAb, הרכבה של הרצועה החיסונית, וחקירה מתודולוגית של ההסתה. התוצאות הראו כי ניתן להשתמש ברצועות הסופיות עוד יותר לאבחון עצמי מהיר ונוח של מולקולה קטנה, אשר עשויה לספק כלי חלופי בניתוח מהיר ומדויק של מדדים פיזיולוגיים וביולוגיים.

מבוא

רצועות אימונוכרומטוגרפיות זרימה לרוחב מבוססות ממברנה (ICSs) הן כלים שימושיים לזיהוי בעלות נמוכה ומהירה. קרום הניטרוצלולוז כנשא וזהב קולואידי כסמנים של ריאגנטים אבחון מהיר כרומטוגרפיה חיסונית הם שיטת POCT (נקודת הטיפול) הנפוצה ביותר, ואת היקף הבדיקה של הפרויקט הוא רחב יותר. מהיישום המקורי שלהם בניטור במהלך ההריון, השימוש בהם הוארך כדי לפקח על מצב קרישת הדם^1,2, פגיעה בשריר הלב³,^{תרופה וטרינרית 4}, שאריות חומרי הדברה⁵, מחלות זיהומיות⁶ וריכוזים סמים. ניתן להעריך סוגים נוספים של דגימות, כולל שתן, רוק, דם שלם, סרום ונוזלים אחרים בגוף^7,8,9.

בשנים האחרונות פותחו בדיקות חדשניות רבות לאיתור סמנים ביולוגיים באבחון הפרעות, כולל HPLC, UPLC, LC-MS ו- ELISA, שהם רגישים ומדויקים, אמינים וספציפיים. עם זאת, שיטות אלה דורשות מכשור מתוחכם, עיבוד מקדים מורכב וטיפולים גוזלי זמן⁹. לפיכך, פיתוח אסטרטגיית אבחון מהירה ונוחה יותר של נקודת טיפול לגילוי עצמי ובזמן אמת של תרכובות פעילות מרפא הוא דחוף^10,11.

הפופולריות של ICSs, במיוחד עבור בדיקות נפוצות, מונעת על ידי קלות השימוש שלהם, כפי שהם אינם דורשים אנשי מקצוע או הגדרות אינסטרומנטליות משוכללות¹². במילים אחרות, אנשים שאין להם הכשרה מיוחדת יכולים להפעיל רצועות או בדיקות עצמיות¹³. את תוצאות הבדיקה ניתן להשיג בתוך 5 דקות, מה שאומר שזה יכול לשמש לבדיקות באתר¹⁴. יתר על כן, על פי החישובים שלנו, העלות של רצועות יכול להיות נמוך יותר מ 1 RMB¹⁵, כלומר הבדיקות זולות כדי לקדם¹⁶. לפיכך, ICS הוא מכשיר חד פעמי מדויק יחסית, פשוט וזול. ICSs המבוסס על זהב קולואידי^17,18 מיושמים גם בגילוי מהיר COVID-19.

העיקרון של ICS ניתן לחלק כריך ICS ו- ICS תחרותי. איור 1A הוא תרשים סכמטי של כריך ICS, המשמש בעיקר לאיתור חומרים מקרומולקולריים כגון חלבונים, כולל סמני גידול, גורמים דלקתיים וגונדוטרופין כוריוני אנושי (HCG, אנטיגן הריון מוקדם). בשיטה זו, נוגדנים מזווגים המיועדים לאפיטופים שונים של האנטיגן משמשים, ונוגדן הלכידה מיובש על קרום NC כקו בדיקה. נוגדן שכותרתו מיובש על כרית מצומד, ונוגדן משני משמש כקו הביקורת.

איור 1B הוא תרשים סכמטי של ICS תחרותי, המשמש בעיקר לזיהוי חומרים של מולקולות קטנות (MWCO < 2000 Da). אנטיגן הציפוי קבוע על קרום NC כקו בדיקה, ואת הנוגדן המסומן מיובש על כרית מצומד. במהלך הזיהוי, המדגם והתווג הנוגדנים זורמים דרך קו הזיהוי תחת פעולה נימית, והאנטיגן המצולף קושר באופן תחרותי אנטיגן חינם במדגם ומפתח צבע אדום בקו הזיהוי.

לאחרונה, תיארנו את ההליך של ייצור נוגדנים חד שבטיים נגד מוצרים טבעיים¹⁹. בעבודה זו, פיתחנו אימונואזיה זרימה לרוחב רומן המבוסס על mA²⁰ מוכן נגד SSD לגילוי מהיר באתר. התוצאות מצביעות על כך שבדיקת החיסונים היא כלי חיוני ונוח לאיתור תרכובות טבעיות המופקות ממוצר.

איור 1 תרשים סכמטי של בדיקת החיסונים (A)רצועות בדיקה אימונוכרומטיות של כריך. (B)רצועות בדיקה כרומטוגרפיות חיסון עקיפות. נתון זה שונה מ ג'אנג ואח', 2018²¹. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פרוטוקול

כל ההליכים שבוצעו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לבדיקת אתיקה באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (מספר אישור 2017BZYYL00120).

1. הכנה ואפיון של זהב קולואידי

הערה: עבור סינתזת זהב קולואידי, כמו זהב קולואידי הוא נספג בקלות על הקיר הפנימי של הכלי והוא נוטה משקעים על ידי זיהומים, הכלי עבור סינתזה ואחסון של זהב קולואידי צריך להיות ניקה ביסודיות ספוג בחומצה (40 מ"ל של מים מזוקקים, 360 מ"ל של חומצה גופרתית מרוכזת, 20 גרם של אשלגן dichromate) או נתון לטיפול פסיבציה פני השטח. שיטה להפחתת חומצת לימון שימשה לסנתז זהב קולואידי.

1. מפעילים את המערבב המגנטי ומניחים את הבקבוק (250 מ"ל) על המיקסר.
2. הכן 4% תמיסה חומצת כלוריד זהב ו 1% פתרון נתרן סיטראט, בהתאמה.
3. מוסיפים 120 מ"ל של מים מזוקקים לבקבוקון התחתון העגול ומחממים אותו לרתיחה על מערבב מגנטי תרמוסטטי.
4. שמור רותח, ולהוסיף במהירות 0.5 מ"ל של 4% חומצה כלורוארית ו 5 מ"ל של 1% נתרן ציטוטראט.
5. שים לב לצבע הפתרון. תמיסה חומצה כלורוארית צהובה חיוורת הופכת יין אדום בתוך כמה דקות.
6. ממשיכים לחמם במשך 10 דקות, עד שהפתרון משתנה מיין חסר צבע לאדום שקוף.
7. כבה את העוצמה של המיקסר המגנטי התרמוסטטי, מצננים לטמפרטורת החדר ומעבירים את התערובת לבקבוק נקי. לאחסן אותו ב 4 °C (5 °F).
8. קבע את הגודל והמורפולוגיה של AuNPs על ידי ספקטרוסקופיה אולטרה סגולה והדמיה TEM.
   הערה: בגדלים שונים של חלקיקי זהב קולואיד עבור יישומים שונים ניתן להשיג על ידי שינוי שיעור נתרן ציטוט וחומצה כלורוארית.

2. סינתזה של התזת AuNPs-mAb

הערה: מאז נוגדנים להיקשר זהב קולואידי על ידי ספיחה אלקטרוסטטית, חיובים על פני השטח של חלבונים וזהב קולואידי משפיעים ישירות על עוצמת הכריכה; לכן, ערך ה- pH של המאגר הוא גורם חשוב המשפיע על יציבות ההצתה של הנוגדנים-קולואידיים של זהב. SSD ו- mAbs נגד SSD משמשים כדוגמאות בפרוטוקול זה.

1. הערכה של צימוד pH
   1. הוסף 100 μL של פתרון NaCl (10% m/v) לתוך שמונה צינורות.
   2. התאם את פתרונות AuNP ב- pH 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ו- 12 עם 0.1 M K₂CO₃.
   3. הוסף 100 μL של פתרון זהב קולואידי (pH מותאם 5-12) לשמונה צינורות המכילים NaCl.
   4. אפשר לפתרונות לעמוד מספר דקות לאחר המיזוג. שים לב לשינוי הצבע של כל פתרון צינור, ולתעד את הצינור שנשאר אדום.
   5. בחר את ערך ה- pH עם התוספת הנמוכה ביותר של K₂CO₃ וצבע פתרון יציב כערך pH האופטימלי להכנת מצומדי AuNP-mAb.
      הערה: אין להשתמש במד pH מכיוון שהגשוש עשוי להיהרס על-ידי AuNPs.
2. הערכת כמות הנוגדנים
   1. הוסף 100 μL של פתרון NaCl (10% m/v) לשמונה צינורות.
   2. הוסף 100 μL של פתרון זהב קולואידי עם pH אופטימלי לכל צינור.
   3. הוסיפו את פתרונות הנוגדנים המונוקלונליים (ריכוז חלבונים 0.1 מ"ג/מ"ל-3.2 מ"ג/מ"ל) לשמונה הצינורות הנ"ל.
   4. אפשר לפתרונות לעמוד מספר דקות לאחר המיזוג. שים לב לשינוי הצבע של כל פתרון צינור, ולתעד את הצינור שנשאר אדום.
   5. בחר את כמות הנוגדנים עם הריכוז הנמוך ביותר של mAb וצבע פתרון יציב כמו כמות mAb אופטימלי להכנת מצומדים AuNP-mAb.
3. הכן את מאגר ההשתתפות מחדש: הוסף 1 M Tris-HCl (pH 8.8), 1% (w/v) BSA, 0.5% (v/v) Tween 20 ו- 1% (v/v) PEG 20000 ומיזוג היטב.
4. סינתזה של התקהלות AuNP-mAb
   1. קח 10 מ"ל של פתרון זהב קולואידי והשתמש ב- 0.1 M K₂CO 3 כדי_להתאים את הפתרון לערך ה- pH האופטימלי.
   2. יש להוסיף לאט את ה-SSD mAbs בריכוזים המתאימים ולנער בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
   3. צנטריפוגות התערובת ב 83 x גרם (1,000 סל"ד) במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F). הסר את המשקעים, אשר מכיל זיהומים או זהב קולואידי מזורם.
   4. צנטריפוגות התערובת ב 8,330 x גרם (10,000 סל"ד) במשך 30 דקות ב 4 °C (70 °F). השלך את supernatant, ואת המשקעים הוא קולואידי זהב-mAb ההמולה.
   5. הוסף את מאגר ההפצה מחדש כדי לנתק את המשקעים.

3. כינוס הרצועה

הערה: עבור חיסוני זרימה מאוחרים יותר, הבחירה והטיפל הממברנה ישפיעו ישירות על הבדיקה, אשר יש לחקור. הרצועה החיסונית מורכבת משטח דגימה, כרית מצומדת, קרום ניטרוצלולוז (NC), כרית סופגת ולוח PVC(איור 1). חומר הממברנה צריך להיבדק ולהעריך על ידי סטריאומיקרוסקופיה כדי לחסל את האינומוגניות.

1. הדבק את קרום NC על לוח PVC 2 ס"מ מלבד קצה קצה היניקה של הלוח.
2. הוסף SSD-BSA (2 מ"ג / מ"ל) טיפה לקרום NC (2 ס"מ מלבד הקצה העליון) כקו בדיקה (1 מ"מ רוחב), ולהוסיף עז נגד עכבר IgG (1.5 מ"ג / מ"ל) טיפה על קרום NC (2 ס"מ מלבד הקצה התחתון) כקו בקרה (1 מ"מ רוחב). לשלוט בכמות החלבון שנוסף.
3. חבר את כרית הספיגה לגיליון PVC מעל קרום NC וחפוף אותו עם קרום NC על ידי 2 מ"מ.
4. שקועים בקרום סיבי הזכוכית לתוך פתרון מצומד AuNPs-mAb. יבש את הממברנה הרטובה באינקובטור ב 37 °C (50 °F).
5. חותכים את קרום סיבי הזכוכית לאורך 5 ס"מ ורוחב 2 ס"מ ומשתמשים בו כרפידה מצומדת.
6. הדבק את כרית מצומד מטופל מראש מתחת לקרום NC. אורך החפיפה עם קרום NC צריך להיות 0.1 ס"מ.
   הערה: קרום סיבי הזכוכית יש יכולת חזקה לקשור ולשחרר חלבונים.
7. חותכים את ההיתוך 3 ממברנה ל 1.8 ס"מ ארוך 3.5 ס"מ רוחב ולהשתמש בו כמו כרית מדגם.
8. הדבק את משטח המדגם על לוח PVC וחפיפת אותו עם כרית מצומד על ידי 2 מ"מ.
9. חותכים את לוח הנייר המורכב לרצועות ברוחב 3.5 מ"מ באמצעות מכונת חיתוך וקומפצים אותו באמצעות מערכת למינציה אצווה.
10. לבסוף, מניחים את רצועות הבדיקה לתוך הקליפה, אוטמים אותן בשקית רדיד אלומיניום המכילה חיטוי, ומאחסנים אותן הרחק מהאור. ICSs מורכבים כעת.
    הערה: האמור לעיל הוא הליך המעבדה. בייצור, ציוד ריסוס זהב ומכשירים ממברנה צולבת משמשים לרסס זהב ולעשות את קווי T ו- C.

4. זיהוי כמותי

1. זרוק 50 μL של פתרון מדגם על חור המדגם כדי לצפות בתהליך הכרומטוגרפיה.
   הערה: כתוצאה מהפעולה הנימית המונעת על ידי כרית הספיגה, הפתרון לדוגמה עובר לקצה השני של הרצועה. כאשר פתרון המדגם מגיע למשטח מצומד, ה- SSD (אנטיגן) במדגם מגיב כאשר AuNPs-mAb נטען מראש על הפנקס. כאשר הפתרון נודד ומגיע לקו ה- T, ניתן ללכוד את AuNPs-mAb ללא SSD באופן סלקטיבי על-ידי SSD-BSA (מצומד חלבון נושא אנטיגן), המוצג כצבע אדום בקו T. לאחר מכן, הפתרון עובר לקו C, שבו AuNPs-mAb נלכדים על ידי עז אנטי עכבר IgG באזור, ובכך מוצג כצבע אדום על קו C.
2. נתח את הרצועות באמצעות קורא רצועות נייד. המכונה יכולה לספק את היחס בין קו הבדיקה לקו הבקרה (T/C).
3. להעריך את הספציפיות, הרגישות, החזרה והיציבות של מבחן ICS.
   הערה: תחת זיהוי איכותי, קו אדום אחד מציין תוצאה חיובית (קו בקרה). שני קווים אדומים מציינים תוצאה שלילית (קווי בדיקה ובקרה). אם שורת הביקורת אינה קיימת, הבדיקה נחשבת ללא חוקית.

תוצאות

אפיון של זהב קולואידי
פתרונות הזהב הקולואידיים המוכנים היו אדומים קלארט. ניתוחי TEM שימשו לקביעת המורפולוגיה והצורה של AuNPs(איור 2A-D). איור 2A ואיור 2B חושפים שהחלקיקים הם בעלי צורה פוליהדרלית ומופצים באופן אחיד. הקוטר הממוצע של AuNPs נמצא כ 14 ננומטר(איור 2C). תמונת TEM ברזולוציה גבוהה (HRTEM) של AuNPs מוצגת באיור 2D

דיון

בעבודה זו, אנו מציגים פרוטוקול להכנת mAbs נגד מולקולות קטנות טבעיות המופקות ממוצר. הצעדים החיוניים והעניינים הזקוקים לתשומת לב בהליך תוארו, והדגמנו את התועלת של פרוטוקול זה באמצעות המולקולה הקטנה SSD כדוגמה. ספקטרום לדוגמה, תמונות TEM, תוצאות כמותיות וחקירות מתודולוגיות מוצגים בנתונים מייצגים. לפיכך, הוכחנו כי ייצור הזהב הקולואידי, הטיות AuNP-mAb ואסטרטגיית הרכבת רצועה המוצגת כאן גורמות ליצירת אימונואזיה חדשנית שניתן להשתמש בה כדי לזהות במהירות את מולקולת היעד.

קל לתפעול רצועות אימונוכרומטיות,...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
תמיסת חומצה כלורואורית (HAuCl4)	טיאנג'ין פו צ'ן ריאגנטים כימיים מפעל	JY-SJ102
סרום בקר אלבומין	AMRESCO	332
צינור צנטריפוגה 15 מ"ל			קורנינג
50 מ"ל	קורנינג	430828
צלחות ELISA, 96 באר	NUNC	655101
נייר סינון	Sinopharm	H5072
ממברנות סיבי זכוכית	Jieyi	XQ-Y6
עז אנטי עכבר נוגדן IgG	applygen	C1308
ממברנות ניטרוצלולוזה	Millipore	millipore 180
ovalbumin	בייג'ינג BIODEE	5008-25g
PEG20000	סיגמא אולדריץ'
פיפטה 10 מ"ל	COSTAR	4488
פיפטה 25 מ"ל	FALCON	357525
יריעות PVC חצי קשיחות	Jieyi	JY-C104
נתרן ציטראט	בייג'ינג עבודות כימיות	C1034
נתרן פריודאט	סינופארם כימי	BW-G0008
סולפו-GMBS	Perbio Science גרמניה	22324
טיפ וואן טיפים 1,000 ומיקרו; L	Starlab	S1111-2021
Tris-HCl	Solarbio	77-86-1
TWEEN 20	Solarbio	9005-64-5