הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

בידוד של RNA כולל מ-Pseudomonas aeruginosa בתוך ביופילמים למדידת ביטוי גנים

2.7K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62755

⸱

24 בספטמבר 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto, 3Microbiology, Department of Pediatric Laboratory Medicine, Hospital for Sick Children, 4Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Hospital for Sick Children

במאמר זה

סיכום

פרוטוקול זה מציג שיטה לבידוד RNA מביופילמים של Pseudomonas aeruginosa הגדלים בשקופיות תא לריצוף תפוקה גבוהה.

תקציר

Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן חיידקי אופורטוניסטי הגורם לזיהומים בדרכי הנשימה של חולי סיסטיק פיברוזיס (CF). P. aeruginosa ידוע ביכולתו ליצור ביופילמים המוגנים על ידי מטריצה של אקסופוליסכרידים. מטריצה זו מאפשרת למיקרואורגניזמים להיות עמידים יותר בפני גורמים חיצוניים, כולל טיפול אנטיביוטי. אחת השיטות הנפוצות ביותר לגידול ביופילם למחקר היא בלוחות מיקרוטיטר או בשקופיות תאיות. היתרון של מערכות אלו הוא בכך שהן מאפשרות בדיקה של תנאי גידול מרובים, אך החיסרון שלהן הוא שהן מייצרות כמויות מוגבלות של ביופילם למיצוי RNA. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד, כיצד לחלץ RNA כולל מכמויות קטנות של ביופילם באיכות ובכמות מספיקות לריצוף תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה מאפשר לחקור את ביטוי הגנים בתוך מערכות ביופילם אלה.

מבוא

רוב הזיהומים החיידקיים הכרוניים, כגון זיהומים ריאתיים בחולי סיסטיק פיברוזיס (CF) וזיהומים הקשורים לתותבות, מאופיינים בגדילה של אורגניזמים בתוך ביופילמים. ביופילמים1 הם קהילות של חיידקים עטופים במטריצה המורכבת בעיקר מפוליסכרידים2. חיידקים בתוך ביופילמים יכולים להיות איטיים, רדומים מבחינה מטבולית ובתנאים אנאירוביים והיפוקסיים. ביופילמים עמידים יותר לאנטיביוטיקה בשל גורמים כמו ירידה בחדירת אנטיביוטיקה, ביטוי מוגבר של משאבות פליטת תרופות וירידה בחלוקת התאים3. מסיבות אלה ואחרות, הם מעוררים עניין מחקרי רב.

על מנת לחקור במדויק זיהומים מתמשכים כגון זיהומים כרוניים של Pseudomonas aeruginosa בחולי CF, תנאי הגידול הנראים עם היווצרות ביופילם צריכים להשתקף במדויק במבחנה. שיטה נפוצה בעלת תפוקה גבוהה היא לגדל אותם בשקופיות תא או בלוחות מיקרוטיטר ולנטר את היווצרות הביופילם על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית4. ידוע כי מווסת מפתח במעבר מפלנקטוני, או צף חופשי, לאורח חיים חיידקי ביופילם הוא השליח המשני, cyclic-di-GMP5. רמות מחזוריות מוגברות של GMP מגבירות את הביטוי של גנים ספציפיים המקדמים צמיחת ביופילם. רנ"א רגולטורי קטן שאינו מקודד וחישת מניין ממלאים גם תפקידים חשובים בוויסות היווצרות ביופילם5. מדידת ביטוי גנים של ביופילם על ידי ריצוף RNA חיידקי שחולץ יכולה להיות מאתגרת. P. aeruginosa, למשל, מייצר שלושה אקסופוליסכרידים (Psl, Pel ואלגינט), המיוצרים בכמויות משמעותיות בביופילמים 6,7. פוליסכרידים אלה יכולים להפריע למיצוי וטיהור RNA ולהוביל לתכשירים לא טהורים המכילים רמות נמוכות של mRNA8 חיידקי. ערכות מיצוי RNA זמינות מסחרית מסוגלות לייצר RNA באיכות גבוהה מתרביות חיידקים פלנקטוניות, אך עשויות שלא לעבוד טוב עם תרביות ביופילם 9,10,11. ישנן כמה ערכות מיצוי רנ"א מסחריות שמתיימרות לעבוד עבור ביופילמים, שאחת מהן אנו משתמשים בשיטה זו.

בכתב יד זה, אנו מתארים את ההליכים לגידול ביופילמים של P. aeruginosa בשקופיות תא וחילוץ mRNA חיידקי לריצוף תפוקה גבוהה12,13. תוך שימוש בבידוד קליני שנאסף מדגימות כיח מחולי CF, אנו מדגימים כי ניתן להשתמש בשיטות אלה עבור מבודדים בעלי מאפייני גדילה משתנים. בהשוואה לפרסומים קודמים, פרוטוקול זה מתואר בפירוט כדי לאפשר הצלחה טובה יותר בחקר ביטוי גנים של ביופילם חיידקי 11,14,15,16.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

מועצת האתיקה של המחקר (REB) נדרשת לאיסוף ועיבוד דגימות כיח מנבדקים אנושיים. מחקר זה אושר על ידי בית החולים לילדים חולים (REB#1000019444). מועצת האתיקה של המחקר (REB) נדרשת לאסוף ולאחסן דגימות ליחה מנבדקים אנושיים. מחקרים אלה אושרו על ידי בית החולים לילדים חולים REB#1000058579.

1. היווצרות ביופילם

  1. לגדל מבודדי Pseudomonas aeruginosa שהתקבלו מדגימות כיח של חולי CF ששימשו במחקר זה על צלחות אגר מרק לוריא (LB) באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    הערה: טכניקת פסים נכונה חשובה להשגת מושבות חיידקים בודדות. פסים תוך כדי סיבוב הצלחת ידללו את תאי החיידקים מספיק כדי שמושבות בודדות יוכלו לגדול.
    1. פס חיידקים באמצעות לולאת חיסון בתבנית זיגזג בקצה העליון של צלחת LB טרייה עד לכסות כ-1/4 מהצלחת.
    2. סובב את הצלחת בערך 60°. קח לולאת חיסון חדשה והעביר אותה פעם אחת דרך האזור המפוספס לאזור שני ונקי של הצלחת, תוך חזרה על דפוס הזיגזג.
    3. חזור על שלב 1.1.2 עם לולאה טרייה לאזור שלישי של הצלחת. החזר את המכסה והפוך את הצלחת בעת הנחתו בחממה.
  2. השתמש בלולאת חיסון סטרילית כדי לבחור מושבת חיידקים בודדת מצלחת אגר (המכילה זן חיידקי יחיד) ולחסן צינור תרבית מלא ב-5 מ"ל של חומר LB סטרילי. באמצעות לולאה חדשה בכל פעם, חסנו שני צינורות תרבית נוספים מלאים ב-5 מ"ל של מדיה LB מאותה צלחת.
  3. חזור על אותו הליך חיסון עבור זני החיידקים השונים. יש לגדל את התרביות למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור בטמפרטורה של 220 סל"ד.
    הערה: כל צלחת אגר המכילה זן חיידקי בודד משמשת לחיסון 3 צינורות תרבית עצמאיים. שלושת הצינורות מייצגים שכפולים ביולוגיים בשלושה עותקים עבור זן אחד ומטופלים כדגימות נפרדות. זה שונה משכפולים טכניים שהיו כרוכים בחילוץ RNA 3 פעמים מצינור תרבית יחיד.
  4. הכן דילול של 1:100 של תרביות הלילה על ידי העברת 50 מיקרוליטר של תרבית לילה לתוך צינור תרבית חדש המכיל 4.95 מ"ל של מדיה חדשה של LB.
  5. גדל את התרביות המדוללות למשך 3 שעות נוספות ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור ב-220 סל"ד או עד שה-OD600 הוא 0.1 ומעלה. מדוד את צפיפות התאים בספקטרופוטומטר ב-OD600.
  6. בצינור מיקרופוגה חדש של 1.7 מ"ל, כוונן את ה-OD600 ל-0.1 (שלב יומן מוקדם) בנפח כולל של 1.5 מ"ל עם LB טרי.
  7. מערבבים בעדינות על ידי היפוך. העבירו 300 מיקרוליטר מכל תרבית מותאמת ל-4 בארות של מגלשת תא של 8 בארות כדי להגיע ל-2 דגימות שונות לכל שקופית (איור 1).
  8. הנח את המגלשות, ללא הפרעה, באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה למשך 24 שעות. כדי למנוע אידוי, הניחו את השקופיות על גבי מגבת נייר לחה במגש פלסטיק קטן.

2. שחזור ביופילם

הערה: כל מגלשת זכוכית מכילה שמונה בארות נפרדות. דגימה אחת מורכבת מארבע בארות עם ביופילמים שיאוגדו17. פרוטוקול מיצוי זה מיועד לדגימה אחת (4 בארות) שבה הביופילמים נשאבים מ-2 בארות בכל פעם. מיצוי RNA מבוצע באמצעות ערכת מיצוי RNA מסחרית הכוללת שלב הכאת חרוזים וניקוי מבוסס עמודות, עם שינויים. עקוב אחר הוראות היצרן להכנת ריאגנטים.

  1. במכסה זרימה למינרית, הסר לאט את המדיה מ-2 מתוך 4 בארות באמצעות קצה פיפטה. הטה את המגלשה בזווית של 45 מעלות והוציא את המדיה החוצה מהפינה התחתונה של הבארות כדי למנוע ניתוק של הביופילמים.
  2. תוך שמירה על המגלשה מוטה, שטפו את תאי הפלנקטון על ידי פיפטינג עדין של 300 מיקרוליטר מים נטולי RNase לפינה התחתונה של שתי הבארות המרוקנות. הסר את המים על ידי פיפטינג בעדינות החוצה, כמתואר בשלב 2.1. חזור על שלב הכביסה והסר כמה שיותר מים.
  3. הוסף 300 מיקרוליטר של מגיב הגנת RNA (ראה טבלת חומרים) לכל אחת משתי הבארות המרוקנות עם ביופילמים בבסיסן. הנח את מגלשת התא על צלחת זכוכית כדי למנוע את שבירת הבארות, ולאחר מכן גרד את הביופילמים ב-2 הבארות בעזרת מרית מתכת סטרילית קטנה ונטולת נוקלאז כדי להשעות מחדש את חיידקי הביופילם. הניחו לשבת עד שהביופילמים יתאוששו מ-2 הבארות הנותרות שלא נגעו בהן מאותה דגימה.
    הערה: תוספת של מגיב הגנת RNA מבטיחה את יציבות דגימות הביופילם בבארות המגורדות בטמפרטורת הסביבה תוך עיבוד שתי הבארות הנותרות של אותה דגימה. מגיב הגנת ה-RNA משבית תאים ומנטרל נוקלאזות וגורמים זיהומיים, וכתוצאה מכך משמר את ה-RNA.
  4. כדי לשחזר ביופילמים מ-2 הבארות הנותרות עבור דגימה (תזכורת: דגימה אחת מורכבת מ-4 בארות), הסר את מדיית ה-LB מ-2 הבארות החדשות הנותרות באותו אופן כמתואר בשלב 2.1. חזור על שלב 2.2 כדי לשטוף את התאים הפלנקטוניים במים נטולי RNase משתי הבארות החדשות, כמו קודם.
  5. חזור לשתי הבארות הראשונות עם ביופילמים מגורדים במגיב הגנה, שנוצר בסוף שלב 2.3, ולאט לאט לערבב את 300 מיקרוליטר של ביופילם מושעה מחדש מבאר אחת מגורדת, בניסיון לא ליצור יותר מדי בועות.
    1. העבירו את כל התכולה מהבאר לאחת הבארות שנשטפו לאחרונה והתרוקנו. מערבבים ומעבירים 300 מיקרוליטר של ביופילם מושעה מחדש מהבאר השנייה שנגרדה בבאר הנותרת, שנשטפה לאחרונה, מרוקנת.
      הערה: במקום להוסיף מגיב הגנת RNA חדש ל-2 הבארות שנשטפו לאחרונה עם ביופילמים, העבירו את הביופילמים שכבר גרדו בעבר לבארות הטריות הללו. זה ישמור על נפח הדגימה המשולב נמוך מספיק כדי לעמוד בדרישות הקלט עבור ערכת מיצוי ה-RNA המסחרית. ראה איור 1 לסכמה.
  6. חזור על גירוד הביופילמים בבארות החדשות כמו בשלב 2.3, על ידי הנחת מגלשת התא על צלחת זכוכית וגירוד הביופילמים ב-2 הבארות החדשות עם מרית מתכת סטרילית קטנה ונטולת נוקלאז כדי להשעות מחדש את חיידקי הביופילם.
  7. שלב את כל הביופילם המושעה מחדש מ-2 הבארות החדשות לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה יחיד נטול RNase וקשר נמוך בנפח 1.5 מ"ל. מדוד את עוצמת הקול, שצריכה להיות ~500 - 600 מיקרוליטר בסך הכל.
    הערה: תרחיף הביופילם המשולב מזוג הבארות החדשות השני הזה יכיל את כל חומר הביופילם מ-4 הבארות המקוריות של דגימה.

3. בידוד RNA כולל והערכת איכות

הערה: מיצוי RNA מתבצע באמצעות ערכת מיצוי RNA מסחרית המתיימרת לעבוד על ביופילמים. הרכיבים הבודדים כלולים בטבלת החומרים, במידת האפשר. הסברים על המנגנונים מאחורי כל שלב טיהור ניתנים במידת האפשר.

  1. הוסף מספיק ריאגנט להגנת RNA כדי לסכם 750 מיקרוליטר בצינור. העבירו את כל הנפח לצינור ליזה מכה חרוזים של 2 מ"ל המכיל חרוזים של 0.1 ו-0.5 מ"מ (ראה טבלת חומרים). מקציפים 2 1/2 דקות במקצף חרוזים במהירות מרבית.
    הערה: השילוב של חרוזים בצפיפות גבוהה של 0.1 מ"מ ו-0.5 מ"מ בתוספת ערבוב מהיר על מקצף חרוזים מבטיח הומוגניזציה יסודית של דפנות התאים המיקרוביאליים.
  2. צנטריפוגה ב 16,000 x גרם למשך דקה אחת לכדור החרוזים. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש, תוך מזעור העברת כל החרוזים, מה שיקל על שלב 3.3. מדוד את עוצמת הקול.
  3. הוסף נפח שווה של מאגר ליזה RNA (~450 מיקרוליטר) וערבב היטב. העבירו עד 800 מיקרוליטר של דגימה, הימנעו מהעברת חרוזים כלשהם, לעמוד סיליקה בצינור איסוף וצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 30 שניות. שמור את הזרימה מכיוון שהיא מכילה את ה-RNA בזמן שה-DNA קשור לעמודה.
    הערה: מאגר הליזה של RNA מכיל גואנידיניום תיוציאנט ואת חומר הניקוי N-lauroylsarcosine לתאי ליז. גואנידיניום תיוציאנט הוא חומר כאוטרופי שגם משבית נוקלאזות, ובנוכחות סיליקה, שנמצא בעמוד הספין, מקדם את קשירת ה- DNA לסיליקה18. היעדר אתנול מאפשר קשירה מועדפת של DNA ולא RNA לעמודת ספין הסיליקה19. מטרת שלב 3.3 היא לקשור ולהסיר DNA גנומי. אנו רוצים לשמור על ה-RNA, הכלול בחלק הזרימה.
  4. אם נותרה דגימה נוספת, העבירו את העמודה לצינור איסוף חדש וטענו מחדש עם שאר הדגימה. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 30 שניות. שמור על הזרימה עם ה-RNA ושלב עם ה-aliquot הראשון.
  5. מדוד את נפח הזרימה המשולב והוסף נפח שווה של 100% אתנול וערבב היטב. העבירו עד 800 מיקרוליטר מהתמיסה לעמודת ספין סיליקה שנייה חדשה בצינור איסוף וצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 30 שניות. השליכו את הזרימה.
    הערה: הוספת אתנול לתמיסת המלח הכאוטרופית המכילה את ה-RNA משפרת את קשירת ה-RNA לעמודת ספין הסיליקה19.
  6. עבור פתרונות > 800 μL, טען מחדש את עמודת הספין והצנטריפוגה עד לסיבוב התמיסה כולה. השליכו את הזרימה לאחר כל סיבוב.
  7. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר כביסה לעמוד ולצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 30 שניות כדי להסיר חלק מהמלחים. השליכו את הזרימה.
  8. הכן את תערובת התגובה של DNase I בהתאם להוראות היצרן ובצע את הטיפול ב-DNase בעמודה כדי להסיר שאריות DNA.
  9. השעו מחדש את ה-DNase I הליופילי ב-275 מיקרוליטר של מים נטולי RNase כדי ליצור תמיסה של 1 U/μL. מערבבים על ידי היפוך עדין.
  10. שלב 5 מיקרוליטר של DNase I מדולל עם 75 מיקרוליטר של מאגר העיכול של DNase המסופק. מערבבים בעדינות על ידי היפוך.
  11. הוסף 80 מיקרוליטר מהתמיסה המוכנה ישירות על מטריצת העמודה. דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
  12. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר הכנת RNA לעמודה ולצנטריפוגה ב-16,000 x g למשך 30 שניות. השליכו את הזרימה.
  13. הוסף 700 מיקרוליטר של מאגר שטיפת RNA לעמודה וחזור על הצנטריפוגה. השליכו את הזרימה.
  14. הוסף 400 מיקרוליטר של מאגר שטיפת RNA וצנטריפוגה את העמודה למשך 2 דקות כדי להסיר לחלוטין כל מאגר שיורי.
    הערה: ישנם 2 שלבי כביסה שונים להסרת זיהומים על העמוד. מאגר ההכנה מכיל מלח כאוטרופי חלש מעורבב עם אתנול על מנת להסיר שאריות חלבונים. לאחר מכן, מאגר הכביסה משמש לביצוע שטיפות אתנול להסרת מלחים. יש להסיר את כל האתנול שנותר כדי לאפשר פליטה יעילה של ה-RNA19,20.
  15. העבירו בזהירות את העמוד לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בעל קשירה נמוכה.
  16. הוסף 50 מיקרוליטר מים נטולי RNase ישירות למטריצת העמודה ודגירה למשך 5 דקות. צנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך דקה אחת כדי לחסל את ה-RNA.
  17. לניקוי נוסף להסרת מעכבי PCR, הנח מסנן מעכב PCR בצינור איסוף חדש. הוסף 600 מיקרוליטר מתמיסת ההכנה למעכב המסופקת (ראה טבלת חומרים).
  18. צנטריפוגה ב-8,000 x גרם למשך 3 דקות לשטיפת המסנן. העבירו את המסנן השטוף לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש בעל קשירה נמוכה.
  19. העבירו את ה-RNA המנומק משלב 3.13 למסנן השטוף, וצנטריפוגה ב-16,000 x גרם למשך 3 דקות.
    הערה: ניתן להשתמש ב-RNA באופן מיידי או לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  20. קבע את ריכוז ה-RNA באמצעות מערכת פלואורומטרית ברגישות גבוהה21.
    הערה: מערכות אלו מאפשרות כימות רגיש של כמות קטנה של RNA בתמיסה הספציפית ליעד המבוקש.
    1. העריכו את איכות ה-RNA באמצעות מערכת אלקטרופורזה אוטומטית שיכולה לספק RIN (מספר שלמות RNA), שהוא מדד לאיכות RNA 22,23.

4. דלדול RNA ריבוזומלי וריצוף תפוקה גבוהה

  1. הגש RNA למרכז לניתוח אבולוציה ותפקוד גנום (CAGEF) במרכז הגנום באוניברסיטת טורונטו (טורונטו, קנדה) (https://www.cagef.utoronto.ca/) לדלדול rRNA חיידקי והכנת ספריית RNA כיוונית RNA (ראה טבלת חומרים).
    הערה: דלדול rRNA חיידקי מכוון ל-5S, 16S ו-23S rRNAs להסרה24.
  2. לדלל rRNA באמצעות ערכת דלדול חיידקי rRNA מסחרית. עקוב אחר הפרוטוקול להזנת 10 ננוגרם - 1 מיקרוגרם RNA כולל שלם או מפורק חלקית.
  3. בנה ספריות ריצוף RNA באמצעות ערכת הכנת ספריית RNA כיוונית עם אינדקסים שונים המצורפים לכל ספרייה.
  4. אסוף כמויות שוות ערך של כל ספריית RNA ובצע רצף תפוקה גבוה עם קריאות קצה זוגיות של 100 בסיסים25.

5. הערכת איכות של קריאות רצף

הערה: בדוק את איכות קריאות הרצף באמצעות התוכנית הזמינה בחינם, FastQC26, הזמינה דרך פלטפורמת הקוד הפתוח החינמית, Galaxy27.

  1. עבור אל https://usegalaxy.org/. לחץ על תפריט התחברות או הרשמה והיכנס עם אישורים או צור חשבון.
  2. לחץ על הקישור העלה נתונים בפינה השמאלית העליונה של הדף, תחת תפריט כלים, והעלה את קבצי הרצף fastq.gz. המתן עד ששמות הקבצים יופיעו בצד ימין של הדף, תחת החלונית History.
  3. בחר בקרת איכות FASTQ בתפריט כלים כדי לחשוף רשימה של תוכניות. בחר FastQC, שיאכלס את הפאנל האמצעי של המסך.
  4. תחת נתוני קריאה קצרים מההיסטוריה הנוכחית שלך, בחר את קבצי fastq.gz שהועלו מהתפריט הנפתח.
  5. בחר Execute כדי להפעיל את התוכנית.
  6. הצג את התוצאות בחלונית History (טבלה 2).
    הערה: להוראות מפורטות יותר על אופן השימוש ב-Galaxy, בקרו בדף התמיכה בכתובת https://galaxyproject.org/support/.

6. מיפוי קריאות רצף

הערה: רשום צינור בסיסי לחיתוך מתאם ומיפוי קריאה עבור נתוני RNA-seq. רצפי המתאמים נחתכים מהקריאות באמצעות Trimmomatic28. הקריאות החתוכות ממופות לגנום הייחוס P. aeruginosa PAO1 (NC_002516.2), שהתקבל מ-NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)29באמצעות BWA30 ו-Samtools31. לשם הפשטות, זוג קריאות נקרא PA_1.fq ו-PA_2.fq; קובץ הקריאה של המתאם שיש לחתוך נקרא adapter.fa; ורצף הייחוס PAO1 נקרא PAO1.fasta. כל הכלים הם קוד פתוח ופועלים בסביבת UNIX/LINUX. מומלץ בחום להכיר את היסודות של UNIX/LINUX על מנת לבצע פקודות אלה.

  1. פתח חלון ב-UNIX/LINUX.
  2. התקן את Java, Trimmomatic, BWA ו-Samtools.
  3. נווט אל התיקיה שבה נמצא trimmomatic-0.39.jar הקובץ.
  4. חתוך את כל רצפי המתאמים מהקריאות על-ידי הקלדת הפקודה:
    Java -jar PA_1.fq PA_2.fq PA_1_paired.fq PA_1_unpaired.fq PA_2_paired.fq PA_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP: adapters.fa
    הערה: רק רצפי מתאמים מוסרים. הקריאות לא קוצצו לאיכות32.
  5. העבר את קובץ ההפניה PAO1.fasta לאותה תיקיה.
  6. צור אינדקס של ההפניה באמצעות BWA עם הפקודה:
    מדד Bwa PA01.fasta
  7. מפה את הקריאות הזוגיות לגנום הייחוס על ידי הקלדת 4 הפקודות הבאות. הקלד כל פקודה לאחר סיום הפקודה הקודמת.
    Bwa -mem PA01.fasta PA_1_paired.fq PA2_2_paired.fq > PA_R1R2_map.mem.sam
    Samtools view -S -b PA_R1R2_map.mem.sam > PA_R1R2.bam
    Samtools sort PA_R1R2.bam -o PA_R1R2_sorted.bam
    אינדקס Samtools PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam
  8. הצג את סטטיסטיקת המיפוי על-ידי הקלדת הפקודה:
    Samtools flagstat PA_R1R2_sorted.bam
    הערה: השורההשלישית של הסטטיסטיקה מדווחת על שיעור הקריאות הממופות לגנום הייחוס.
  9. חשב את עומק הקריאה הממוצע ואת רוחב הכיסוי עם 2 הפקודות הבאות33, בהתאמה:
    Samtools עומק -A PA_R1R2_sorted.bam | awk '{C++; s+=$3}END{print s/c}'
    Samtools עומק -A PA288_Rep1_R1R2_sorted.bam | awk '{c++; if($3>0) total+=1}END{print (total/c)*100}'

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

הסקירה הכללית של השיטה מוצגת באיור 1. בעבר השתמשנו במגלשות עם 8 בארות כדי לגדל ביופילמים של P. aeruginosa ולחשוף אותם לאנטיביוטיקה לפני שבדקנו אותם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בנקודות זמן שונות12,13. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחלץ את סך ה-RNA ישירות מביופילמים הגדלים במערכת זו על מנת לחקור שינויים בביטוי גנים לאחר הטיפול. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה עבור P. aeruginosa, אך ניתן להתאים אותו בקלות למיני חיידקים אחרים....

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

סה"כ RNA מופק בהצלחה מ-17 דגימות ביופילם חיידקיות שונות בשלוש עותקים, ומניב בסך הכל 51 דגימות. ארבעים ותשע ספריות ה-RNA מאוגדות ומרוצפות בהצלחה. בסך הכל, זה מאמת את קריטריוני האיכות שלנו עם שיעור הצלחה של 96% למרות שיותר ממחצית הדגימות נחשבות לשפע נמוך ובאיכות תת-אופטימלית 34,35,36,37.

משמעות
פרוטוקול מיצוי RNA זה...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין גילוי נאות להצהיר.

תודות

תרומת המחברים: P.W., Y.Y. ו-V.W היו מעורבים בהמשגת המחקר. K.G., L.J., A.M. ו-P.W. ביצעו אופטימיזציה של פרוטוקולי המעבדה. המימון ל-KG נתמך על ידי סבסוד תוכנית ההשמה לעבודה לסטודנטים באמצעות BioTalent Canada.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
Agilent 2100 BioanalyzerAgilentG2939BAאלקטרופורזה אוטומטית של ביומולקולות
ערכת פיקו RNA 6000Agilent5067-1513שבב אלקטרופורזה RNA ברגישות גבוהה ליצירת
מאגר ליזה RIN DNA/RNA ZymoResearchD7001-1-50מאגר ליזה מבוסס גואנידיניום תיוציאנט ו-N-Lauroylsarcosine הנמכר כחלק מערכת לטיהור חומצות גרעין
מאגר הכנה ל-DNA/RNAZymo ResearchD7010-2-10מאגר גואנידין הידרוכלוריד ואתנול המשמש לטיהור DNA ו-RNA
DNA/RNA ShieldZymo ResearchR1100-50מגיב שימור/הגנה על DNA ו-RNA
מאגר שטיפת DNA/RNAZymo ResearchD7010-3-6מאגר מלח ואתנול המשמש לטיהור DNA ו-RNA
DNBSEQ G-400RSMGIG-400RSרצף תפוקה גבוהה
MGIEasy RNA Directional Library Prep SetMGI1000006386צור ספריות עבור פלטפורמות ריצוף בתפוקה גבוהה של MGI מסך ה-RNA.
Mini-Beadbeater-96BioSpec1001משבש תאים באנרגיה גבוהה ותפוקה גבוהה
NEBNext ערכת דלדול rRNA (חיידקים)ניו אינגלנד BiolabsE7850Xדלדול יעיל וספציפי של rRNA חיידקי (5S, 16S, 23S)
מערכת שקופיות קאמרית Nunc Lab-Tek IIThermo Fisher Scientific154534מגלשת תא 8 בארות עם בארות נשלפות
קיוביט פלואורומטרThermo Fisher ScientificQ33238פלואורומטר ל-DNA, RNA וחלבונים
ערכת בדיקה Qubit RNA HS ThermoFisher ScientificQ32852בדיקה פלואורומטרית ברגישות גבוהה למדידת ריכוז RNA
מסנני ספין-אווייZymo ResearchC1006-50-Fעמודת ספין מבוססת סיליקה המשמשת בעיקר לקשירת או הסרה של DNA גנומי
לולאות חיסון סטריליות, 1 uLSarstedt86.1567.050לולאות חיסון סטריליות וחד פעמיות למניפולציה של מיקרואורגניזמים
ZR BashingBead צינורות ליזהZymo ResearchS6003-50צינורות 2 מ"ל המכילים מטריצת ליזה חרוזים של 0.1 ו-0.5 מ"מ להומוגניזציה של דגימות ביולוגיות
Zymo Spin IIICG עמודותZymo ResearchC1006-50-Gעמודת ספין מבוססת סיליקה לטיהור DNA ו-RNA
מסנני Zymo-Spin III-HRCמחקרZymoC1058-50הסר מעכבים כגון תרכובות פוליפנוליות, חומצות הומיות/פולביות, טאנינים, מלנין וכו'.
ערכת Zymobiomics DNA/RNA MiniprepZymo ResearchR2002ערכת מיצוי כפולה DNA ו-RNA
Zymobiomics HRC Prepsolution Zymo ResearchD4300-7-30לשימוש עם מסנני Zymo-Spin III-HRC להסרת מעכבי PCR

מקורות

  1. Beaudoin, T., Waters, V. Infections With Biofilm Formation: Selection of Antimicrobials and Role of Prolonged Antibiotic Therapy. The Pediatric Infectious Disease Journal. 35 (6), 695-697 (2016).
  2. Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
  3. Folsom, J. P., et al. Physiology of Pseudomonas aeruginosa in biofilms as revealed by transcriptome analysis. BMC Microbiology. 10, 294(2010).
  4. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  5. Bjarnsholt, T., Ciofu, O., Molin, S., Givskov, M., Hoiby, N. Applying insights from biofilm biology to drug development - can a new approach be developed. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (10), 791-808 (2013).
  6. Colvin, K. M., et al. The Pel and Psl polysaccharides provide Pseudomonas aeruginosa structural redundancy within the biofilm matrix. Environmental Microbiology. 14 (8), 1913-1928 (2012).
  7. Hentzer, M., et al. Alginate overproduction affects Pseudomonas aeruginosa biofilm structure and function. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5395-5401 (2001).
  8. Cury, J. A., Koo, H. Extraction and purification of total RNA from Streptococcus mutans biofilms. Analytical Biochemistry. 365 (2), 208-214 (2007).
  9. Francavilla, M., et al. Extraction, characterization and in vivo neuromodulatory activity of phytosterols from microalga Dunaliella tertiolecta. Current Medicinal Chemistry. 19 (18), 3058-3067 (2012).
  10. Atshan, S. S., et al. Improved method for the isolation of RNA from bacteria refractory to disruption, including S. aureus producing biofilm. Gene. 494 (2), 219-224 (2012).
  11. Franca, A., Melo, L. D., Cerca, N. Comparison of RNA extraction methods from biofilm samples of Staphylococcus epidermidis. BMC Research Notes. 4, 572(2011).
  12. Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide. The Journal of Visusalized Experiments. (47), e2481(2011).
  13. Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the effects of sputum on biofilm development using a chambered coverglass model. The Journal of Visusalized Experiments. (118), e54819(2016).
  14. Cockeran, R., et al. Biofilm formation and induction of stress response genes is a common response of several serotypes of the pneumococcus to cigarette smoke condensate. The Journal of Infection. 80 (2), 204-209 (2020).
  15. Bisht, K., Moore, J. L., Caprioli, R. M., Skaar, E. P., Wakeman, C. A. Impact of temperature-dependent phage expression on Pseudomonas aeruginosa biofilm formation. npj Biofilmsand Microbiomes. 7 (22), (2021).
  16. Harrison, A., et al. Reprioritization of biofilm metabolism is associated with nutrient adaptation and long-term survival of Haemophilus influenzae. NPJ Biofilms and Microbiomes. 5 (1), 33(2019).
  17. Sousa, C., Franca, A., Cerca, N. Assessing and reducing sources of gene expression variability in Staphylococcus epidermidis biofilms. BioTechniques. 57, 295-301 (2014).
  18. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology. 28 (3), 495-503 (1990).
  19. Coppin, C. Re: How do silica based RNA spin columns only bind RNA and not DNA. , Available from: https://www.researchgate.net/post/How_do_silica_based_RNA_spin_columns_only_bind_RNA_and_not_DNA/60b017bffa5c4151cac1c/citation/download (2021).
  20. Kennedy, S. A complete guide to how nucleic extraction kits work. , Available from: https://bitesizebio.com/13516/how-dna-extraction-rna-miniprep-kits-work/ (2021).
  21. Qubit RNA HS Assay Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2FQubit_RNA_HS_Assay_UG.pdf&title=VXNlciBHdWlkZTogUXViaXQgUk5BIEhTIEFzc2F5IEtpdHM (2015).
  22. Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. RNA Integrity Number (RIN) - Standardization of RNA Quality Control (Application report # 5989-1165EN). , Available from: https://www.agilent.com/cd/library/applications/5989-1165EN.pdf (2016).
  23. Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3(2006).
  24. Culviner, P. H., Guegler, C. K., Laub, M. T. A Simple, Cost-Effective, and Robust Method for rRNA Depletion in RNA-Sequencing Studies. mBio. 11 (2), (2020).
  25. MGIEasy RNA Directional Library Prep Set User Manual verA2. MGI Tech Co. , Available from: https://en.mgi-tech.com/products/reagents_info/14/ (2020).
  26. Andrews, S. FastQC: A Quality Control Tool for High Throughput Sequence Data. , Available from: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ (2010).
  27. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46, 537-544 (2018).
  28. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina Sequence Data. Bioinformatics. , (2014).
  29. NCBI Resource Coordinators. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 44 (1), (2016).
  30. Li, H. Aligning sequence reads, clone sequences and assembly contigs with BWA-MEM. arXiv. , (2013).
  31. Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), (2009).
  32. Liao, Y., Shi, W. Read trimming is not required for mapping and quantification of RNA-seq reads at the gene level. NAR Genomics and Bioinformatics. 2 (3), (2020).
  33. Penir, S. Calculating Mapping Statistics from a SAM/BAM file using SAMtools and awk. , Available from: https://sarahpenir.github.io/bioinformatics/awk/calculating-mapping-stats-from-a-bam-file-using-samtools-and-awk/ (2019).
  34. Haile, S., et al. Evaluation of protocols for rRNA depletion based RNA sequencing of nanogram inputs of mammalian total RNA. PLoS ONE. 14 (10), 0224578(2019).
  35. Schuierer, S., et al. A comprehensive assessment of RNA-seq protocols for degraded and low-quantity samples. BMC Genomics. 18 (442), (2017).
  36. Shanker, S., et al. Evaluation of Commercially Available RNA Amplification Kits for RNA Sequencing Using Very Low Input Amounts of Total RNA. Journal of Biomolecular Techniques. 26 (1), (2015).
  37. Adiconis, X., et al. Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples. Nature Methods. 10, 623-629 (2013).
  38. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biology. 17 (13), (2016).
  39. Illumina, Inc. Coverage depth recommendations. , Available from: https://www.illumina.com/science/technology/next-generation-sequencing/plan-experiments/coverage.html (2021).
  40. What is a good sequencing depth for bulk RNA-Seq. ECSEQ Bioinformatics. , Available from: https://www.ecseq.com/support/ngs/what-is-a-good-sequencing-death-for-bulk-rna-seq (2019).
  41. Bedre, R. Sequencing coverage and breadth of coverage. , Available from: https://www.reneshbedre.com/blog/sequencing-coverage.html (2021).
  42. Dotsch, A., et al. The Pseudomonas aeruginosa transcriptome in planktonic cultures and static biofilms using RNA sequencing. PLoS One. 7 (2), 31092(2012).
  43. Chen, Y., et al. Population dynamics and transcriptomic responses of Pseudomonas aeruginosa in a complex laboratory microbial community. npj Biofilms and Microbiomes. 5 (1), (2019).
  44. Thoming, J. G., et al. Parallel evolutionary paths to produce more than one Pseudomonas aeruginosa biofilm phenotype. NPJ Biofilms and Microbiomes. 6, 2(2020).
  45. Soares, A., et al. Understanding ciprofloxacin failure in Pseudomonas aeruginosa biofilm: persister cells survive matrix disruption. Frontiers in Microbiology. 10, 2603(2019).
  46. Whiteley, M., et al. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Nature. 413, (2001).
  47. Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nature Protocols. 1, (2006).
  48. Liu, Y., Zhou, J., White, K. P. RNA-seq differential expression studies: more sequence or more replication. Bioinformatics. 30 (3), (2014).
  49. Wieczorek, D., Delauriere, L., Schagat, T. Methods of RNA Quality Assessment. , Available from: https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment/ (2021).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

בידוד RNA מביופילםמיצוי RNA כולליצירת ביופילםמטריצת אקסופוליסכרידיםביופילמים בלוחיות מיקרוטיטרריצוף בתפוקה גבוההפתוגן חיידקיסיסטיק פיברוזיס

מאמר זה פורסם

הסרטון יגיע בקרוב

צרו קשר
המליצו לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

זכויות יוצרים © 2026 MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.