פרוטוקול זה מציג שיטה לבידוד RNA מביופילמים של Pseudomonas aeruginosa הגדלים בשקופיות תא לריצוף תפוקה גבוהה.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
פרוטוקול זה מציג שיטה לבידוד RNA מביופילמים של Pseudomonas aeruginosa הגדלים בשקופיות תא לריצוף תפוקה גבוהה.
Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן חיידקי אופורטוניסטי הגורם לזיהומים בדרכי הנשימה של חולי סיסטיק פיברוזיס (CF). P. aeruginosa ידוע ביכולתו ליצור ביופילמים המוגנים על ידי מטריצה של אקסופוליסכרידים. מטריצה זו מאפשרת למיקרואורגניזמים להיות עמידים יותר בפני גורמים חיצוניים, כולל טיפול אנטיביוטי. אחת השיטות הנפוצות ביותר לגידול ביופילם למחקר היא בלוחות מיקרוטיטר או בשקופיות תאיות. היתרון של מערכות אלו הוא בכך שהן מאפשרות בדיקה של תנאי גידול מרובים, אך החיסרון שלהן הוא שהן מייצרות כמויות מוגבלות של ביופילם למיצוי RNA. מטרת מאמר זה היא לספק פרוטוקול מפורט, צעד אחר צעד, כיצד לחלץ RNA כולל מכמויות קטנות של ביופילם באיכות ובכמות מספיקות לריצוף תפוקה גבוהה. פרוטוקול זה מאפשר לחקור את ביטוי הגנים בתוך מערכות ביופילם אלה.
רוב הזיהומים החיידקיים הכרוניים, כגון זיהומים ריאתיים בחולי סיסטיק פיברוזיס (CF) וזיהומים הקשורים לתותבות, מאופיינים בגדילה של אורגניזמים בתוך ביופילמים. ביופילמים1 הם קהילות של חיידקים עטופים במטריצה המורכבת בעיקר מפוליסכרידים2. חיידקים בתוך ביופילמים יכולים להיות איטיים, רדומים מבחינה מטבולית ובתנאים אנאירוביים והיפוקסיים. ביופילמים עמידים יותר לאנטיביוטיקה בשל גורמים כמו ירידה בחדירת אנטיביוטיקה, ביטוי מוגבר של משאבות פליטת תרופות וירידה בחלוקת התאים3. מסיבות אלה ואחרות, הם מעוררים עניין מחקרי רב.
על מנת לחקור במדויק זיהומים מתמשכים ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מועצת האתיקה של המחקר (REB) נדרשת לאיסוף ועיבוד דגימות כיח מנבדקים אנושיים. מחקר זה אושר על ידי בית החולים לילדים חולים (REB#1000019444). מועצת האתיקה של המחקר (REB) נדרשת לאסוף ולאחסן דגימות ליחה מנבדקים אנושיים. מחקרים אלה אושרו על ידי בית החולים לילדים חולים REB#1000058579.
1. היווצרות ביופילם
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הסקירה הכללית של השיטה מוצגת באיור 1. בעבר השתמשנו במגלשות עם 8 בארות כדי לגדל ביופילמים של P. aeruginosa ולחשוף אותם לאנטיביוטיקה לפני שבדקנו אותם באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית בנקודות זמן שונות12,13. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחלץ את סך ה-RNA ישירות מביופילמים הגדלים במערכת זו על מנת לחקור שינויים בביטוי גנים לאחר הטיפול. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה עבור P. aeruginosa, אך ניתן להתאים אותו בקלות למיני חיידקים אחרים........
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
סה"כ RNA מופק בהצלחה מ-17 דגימות ביופילם חיידקיות שונות בשלוש עותקים, ומניב בסך הכל 51 דגימות. ארבעים ותשע ספריות ה-RNA מאוגדות ומרוצפות בהצלחה. בסך הכל, זה מאמת את קריטריוני האיכות שלנו עם שיעור הצלחה של 96% למרות שיותר ממחצית הדגימות נחשבות לשפע נמוך ובאיכות תת-אופטימלית 34,35,36,37.
משמעות
פרוטוקול מיצוי RNA זה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
למחברים אין גילוי נאות להצהיר.
תרומת המחברים: P.W., Y.Y. ו-V.W היו מעורבים בהמשגת המחקר. K.G., L.J., A.M. ו-P.W. ביצעו אופטימיזציה של פרוטוקולי המעבדה. המימון ל-KG נתמך על ידי סבסוד תוכנית ההשמה לעבודה לסטודנטים באמצעות BioTalent Canada.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | אלקטרופורזה אוטומטית של ביומולקולות |
| ערכת פיקו RNA 6000 | Agilent | 5067-1513 | שבב אלקטרופורזה RNA ברגישות גבוהה ליצירת |
| מאגר ליזה RIN DNA/RNA Zymo | Research | D7001-1-50 | מאגר ליזה מבוסס גואנידיניום תיוציאנט ו-N-Lauroylsarcosine הנמכר כחלק מערכת לטיהור חומצות גרעין |
| מאגר הכנה ל-DNA/RNA | Zymo Research | D7010-2-10 | מאגר גואנידין הידרוכלוריד ואתנול המשמש לטיהור DNA ו-RNA |
| DNA/RNA Shield | Zymo Research | R1100-50 | מגיב שימור/הגנה על DNA ו-RNA |
| מאגר שטיפת DNA/RNA | Zymo Research | D7010-3-6 | מאגר מלח ואתנול המשמש לטיהור DNA ו-RNA |
| DNBSEQ G-400RS | MGI | G-400RS | רצף תפוקה גבוהה |
| MGIEasy RNA Directional Library Prep Set | MGI | 1000006386 | צור ספריות עבור פלטפורמות ריצוף בתפוקה גבוהה של MGI מסך ה-RNA. |
| Mini-Beadbeater-96 | BioSpec | 1001 | משבש תאים באנרגיה גבוהה ותפוקה גבוהה |
| NEBNext ערכת דלדול rRNA (חיידקים) | ניו אינגלנד Biolabs | E7850X | דלדול יעיל וספציפי של rRNA חיידקי (5S, 16S, 23S) |
| מערכת שקופיות קאמרית Nunc Lab-Tek II | Thermo Fisher Scientific | 154534 | מגלשת תא 8 בארות עם בארות נשלפות |
| קיוביט פלואורומטר | Thermo Fisher Scientific | Q33238 | פלואורומטר ל-DNA, RNA וחלבונים |
| ערכת בדיקה Qubit RNA HS Thermo | Fisher Scientific | Q32852 | בדיקה פלואורומטרית ברגישות גבוהה למדידת ריכוז RNA |
| מסנני ספין-אוויי | Zymo Research | C1006-50-F | עמודת ספין מבוססת סיליקה המשמשת בעיקר לקשירת או הסרה של DNA גנומי |
| לולאות חיסון סטריליות, 1 uL | Sarstedt | 86.1567.050 | לולאות חיסון סטריליות וחד פעמיות למניפולציה של מיקרואורגניזמים |
| ZR BashingBead צינורות ליזה | Zymo Research | S6003-50 | צינורות 2 מ"ל המכילים מטריצת ליזה חרוזים של 0.1 ו-0.5 מ"מ להומוגניזציה של דגימות ביולוגיות |
| Zymo Spin IIICG עמודות | Zymo Research | C1006-50-G | עמודת ספין מבוססת סיליקה לטיהור DNA ו-RNA |
| מסנני Zymo-Spin III-HRC | מחקר | ZymoC1058-50 | הסר מעכבים כגון תרכובות פוליפנוליות, חומצות הומיות/פולביות, טאנינים, מלנין וכו'. |
| ערכת Zymobiomics DNA/RNA Miniprep | Zymo Research | R2002 | ערכת מיצוי כפולה DNA ו-RNA |
| Zymobiomics HRC Prep | solution Zymo Research | D4300-7-30 | לשימוש עם מסנני Zymo-Spin III-HRC להסרת מעכבי PCR |
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
מאמר זה פורסם
הסרטון יגיע בקרוב