הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.

מאמר שיטה

שיטה ניתנת להרחבה לחקר הישרדות עצבית בתרבית עצבית ראשונית עם רזולוציה של תא בודד ובזמן אמת

1.1K צפיות

⸱

DOI:

10.3791/62759

⸱

26 ביולי 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cortical Circuits in Health and Disease, Centro de Investigación Príncipe Felipe

* These authors contributed equally

במאמר זה

סיכום

כאן, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה, חזקה ורב-תכליתית לחקירת הישרדות עצבית על מתח ציטוטוקסי בתאי עצב ראשוניים בקליפת המוח עם רזולוציה תאית בזמן אמת או בחומר קבוע.

תקציר

אובדן עצבי הוא הליבה של נוירופתולוגיות רבות, כולל שבץ מוחי, מחלת אלצהיימר ומחלת פרקינסון. שיטות שונות פותחו לחקר תהליך ההישרדות העצבית על עקה ציטוטוקסית. רוב השיטות מבוססות על גישות ביוכימיות שאינן מאפשרות רזולוציה של תא בודד או כרוכות במתודולוגיות מורכבות ויקרות. מוצגת כאן פרדיגמה ניסויית רב-תכליתית, זולה ויעילה לחקר הישרדות עצבית. שיטה זו מנצלת תיוג פלואורסצנטי דליל של הנוירונים ואחריו הדמיה חיה וכימות אוטומטי. למטרה זו, הנוירונים עוברים אלקטרופוטציה כדי לבטא סמנים פלואורסצנטיים ועוברים תרבית משותפת עם נוירונים לא אלקטרופוטיים כדי לווסת בקלות את צפיפות התאים ולהגדיל את ההישרדות.

תיוג דליל על ידי אלקטרופורציה מאפשר כימות אוטומטי פשוט וחזק. בנוסף, ניתן לשלב תיוג פלואורסצנטי עם ביטוי משותף של גן מעניין לחקר מסלולים מולקולריים ספציפיים. כאן, אנו מציגים מודל של שבץ מוחי כמודל נוירוטוקס, כלומר, בדיקת חסך חמצן-גלוקוז (OGD), שבוצעה בתא היפוקסי ביתי זול וחזק. לבסוף, שתי זרימות עבודה שונות מתוארות באמצעות IN Cell Analyzer 2200 או הקוד הפתוח ImageJ לניתוח תמונות לעיבוד נתונים חצי אוטומטי. ניתן להתאים את זרימת העבודה הזו בקלות למודלים ניסיוניים שונים של רעילות ולהגדיל אותה להקרנה בתפוקה גבוהה. לסיכום, הפרוטוקול המתואר מספק מודל מבחנה נגיש, זול ויעיל של נוירוטוקסיות, שיכול להתאים לבדיקת התפקידים של גנים ומסלולים ספציפיים בהדמיה חיה ולבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה.

מבוא

חקר הפרעות עצביות דורש מודלים ניסיוניים הניתנים לניתוחים גנטיים, מולקולריים ותאיים. נוירונים ראשוניים בקליפת המוח הם מודל חזק מאוד לחקר הישרדות ורעילות עצבית 1,2,3,4. בתנאים המתאימים, נוירונים ראשוניים יפתחו בהדרגה קשרים סינפטיים ויציגו סימני היכר של נוירונים בוגרים. לכן, מודל זה אמין יותר מקווי תאים אימורטליים במידול הפיזיולוגיה של הנוירונים ונוח יותר למניפולציות מאשר מודלים של בעלי חיים. עם זאת, בהשוואה לקווי תאים, נוירונים ראשוניים בקליפת המוח קשים להעברה ושבריריים יחסית. יתר על כן, המורפולוגיה המורכבת של נוירונים בקליפת המוח עלולה לסבך את ההדמיה והניתוח בתרביות בצפיפות גבוהה. לעומת זאת, תרביות עצביות ראשוניות בצפיפות נמוכה קלות יותר לניתוח אך נוטות להיות שבריריות יותר.

בהתחשב בכל זה, מאמר זה מציג זרימת עבודה במבחנה במחיר סביר, רב-תכליתי וניתן להרחבה כדי למדל ולחקור הישרדות עצבית (איור 1). נקודות המפתח של פרוטוקול זה הן א) השיטה של אלקטרופורציה במבחנה של הנוירונים עם סמן פלואורסצנטי כדי לאפשר תיוג והדמיה דלילים של תאים חיים; ii) הרבגוניות שלו במודלים שונים של ציטוטוקסיות; ו-3) הניתוח האוטומטי למחצה או האוטומטי.

מערכת האלקטרופורציה (ראה טבלת החומרים) מספקת הליך פתוח וזול שאינו כולל ערכות ופתרונות ספציפיים 4,5,6. יתר על כן, ניתן להתאים שיטה זו בקלות כדי להשיג יעילות טרנספורמציה וצפיפות אופטימלית של נוירונים שעברו טרנספטציה, תוך ערבוב אלקטרופוטרי עם תאים שאינם אלקטרופוטים. התרבות המשותפת עם נוירונים נאיביים (לא אלקטרופורטיביים) משפרת משמעותית את הכדאיות של התאים האלקטרופורטיים בהשוואה לתרביות בצפיפות נמוכה. יתר על כן, הוא מאפשר תיוג דליל עם צפיפות מתכווננת של הנוירונים האלקטרופוטיים, תוך שמירה על רמה עקבית של ביטוי גנים. חשוב לכוון ל-3-5% מהנוירונים החשמליים במבחני הישרדות.

תיוג דליל מקל למעשה על האוטומציה של ניתוח התמונה מכיוון שהתאים מופרדים היטב וניתנים להבחנה בקלות. יש לציין כי פרדיגמה ניסויית זו עשויה להיות מותאמת לבדיקת גנים מרובים מעניינים על ידי תרבית משותפת של נוירונים במקביל עם סמנים פלואורסצנטיים ציטוזוליים שונים (למשל, חלבון פלואורסצנטי ציאן, חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP), חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)) באותה באר. בדומה למבחני ציטוטוקסיות אחרים (למשל, פרופידיום יודיד או לקטט דהידרוגנאז), הבדיקה המתוארת כאן מבוססת על העובדה שמוות עצבי מלווה בקרע של קרום התא. זה מעורר שחרור של חלבונים ציטוזוליים על ידי דיפוזיה וכתוצאה מכך אובדן הקרינה של GFP.

מודל חוץ גופי של שבץ מוחי, כלומר מודל OGD, מוצג כדוגמה לנוירוטוקסיות 7,8,9. פרוטוקול זה כרוך בחשיפת הנוירונים הראשוניים למאגר מלח הדומה לנוזל מוחי מלאכותי אך נטול חמצן וגלוקוז. למרות שמודל זה הוצג כדוגמה למתח נוירוטוקס, ניתן לבדוק מצבים ציטוטוקסיים שונים באותו תהליך עבודה 8,9. לבסוף, תיוג דליל מאפשר בקלות פיתוח של ניתוח הדמיה אוטומטי. כאן, הוקם פרוטוקול המבוסס על אימונופלואורסצנציה סטנדרטית וניתוח ImageJ במערך קטן יותר. לאחר מכן, זרימת עבודה זו הותאמה והוגדלה באמצעות מערכת הדמיה תאית המאפשרת ניתוח אוטומטי בהדמיה חיה במצבי תפוקה בינונית וגבוהה. לסיכום, מאמר זה מציג מתודולוגיה גמישה, משתלמת וניתנת להרחבה לחקר הישרדות עצבית במודלים ניסיוניים שונים של רעילות באמצעות הדמיה חיה וכימות אוטומטי.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

פרוטוקול

כל ההליכים המשתמשים בבעלי חיים צריכים להיות מפוקחים על ידי הוועדה לבעלי חיים ביו-אתיים של המכון ולהתבצע בהתאם לתקנות המקומיות. הנהלים המוצגים כאן אושרו על ידי הרשות המואצלת ועומדים בתקנות בספרד ובאירופה.

1. תרבית עצבית ראשונית

הערה: כל השלבים מבוצעים בתוך מכסה המנוע, תוך שימוש בחומרים ופתרונות סטריליים לשמירה על תנאים סטריליים.

  1. ציפוי פולי-ליזין (PLL)
    1. שטפו את הכיסויים (CVs, 15 מ"מ) ב-70% אתנול למשך הלילה (o/n) בשייקר מסלולי.
      הערה: המהירות של שייקר המסלול אמורה להספיק כדי להזיז את קורות החיים בעדינות אך לא מהר מדי כדי למנוע נזק או שריטות של קורות החיים. הסל"ד הספציפי ישתנה בהתאם לדגם השייקר. ניתן לאחסן קורות חיים באתנול לתקופות ארוכות (חודשים).
    2. הסר את האתנול ושטוף פעמיים במים נטולי יונים למשך 10 דקות כל אחת.
    3. תן לקורות החיים להתייבש בטמפרטורת החדר (RT) בצלחת פטרי של 100 מ"מ (13 CVs / צלחת בערך). ודא שקורות החיים אינם נוגעים זה בזה או בקצוות הצלחת.
      הערה: ניתן לאחסן קורות חיים יבשים ב-RT לתקופות ארוכות (חודשים).
    4. הכן את תמיסת ציר ה-PLL של 5 מ"ג/מ"ל במים, הכין מכסות ואחסן אותם ב-20 מעלות צלזיוס. יש לדלל את תמיסת המלאי ב-1x PBS לריכוז עבודה של 0.1 מ"ג/מ"ל.
      הערה: ניתן לבדוק ריכוזים גבוהים יותר של עד 1 מ"ג/מ"ל PLL.
    5. הוסף את הנפח המינימלי של PLL כדי לכסות את פני השטח של קורות החיים (ראה נפחים אופטימליים של PLL בטבלה 1). הוסף את תמיסת ה-PLL טיפתית כדי להקל על היווצרות טיפה.
      הערה: ציפוי נוירונים על קורות חיים נדרש לאימונופלואורסצנטיות. עבור הדמיית זמן-lapse (למשל, עבור תא IN), התאים מצופים ישירות מעל הבאר ללא קורות חיים מכיוון שקורות החיים עשויים לנוע במהלך חלוף הזמן. במקרה כזה, הוסף את הנפח המינימלי של PLL כדי לכסות את פני השטח של כל באר.
משטחנפח PLL (מ"ל)
כיסויים 15 מ"מ0.2
כיסויים 13 מ"מ0.18
צלחת 96 באר0.07
צלחת 24 באר0.3
צלחת 6 באר2
צלחת 60 מ"מ4.5

טבלה 1: נפחים אופטימליים של פולי-L-ליזין בהתאם לשטח הפנים.

  1. יש לדגור למשך שעה לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: תקופת הדגירה יכולה להיות ארוכה עד o/n.
  2. הסר את ה-PLL מה-CVs. שטוף את קורות החיים פעמיים במים נטולי יונים למשך 10 דקות כל אחד. תנו לקורות החיים להתייבש ב-RT.
    הערה: ניתן לאחסן את תמיסת ה-PLL בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לשימוש חוזר (פי 3 מקסימום).
  3. אחסן את קורות החיים המיובשים בתוך צלחת פטרי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (עד 7-10 ימים) או הניח אותם בתוך הבארות עם מצע ציפוי (ראה הרכב בטבלה 2 ונפחי עבודה בטבלה 3). הוסף מדיום ציפוי ישירות לבארות של צלחות 12 בארות (טבלה 3).
    הערה: נוירונים רגישים מאוד לאיכות נסיוב הבקר העוברי (FBS). יש לבדוק קבוצות שונות של FBS כדי לזהות את האצווה שבה התאים נראים בריאים יותר. לאחר זיהוי כמות גדולה של FBS, מומלץ להשיג כמות גדולה ולאחסן אותה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. ניתן להתאים פרוטוקול זה לסוגים אחרים של קורות חיים ולוחיות (ראה נפחי העבודה השונים בטבלה 3).
ציפוי בינוני
מם42.5מ"ל
10% סרום סוסים או FBS*5מ"ל
30% גלוקוז (0,6% ריכוז סופי)1מ"ל
PS (פניצילין, 10,000 יח'/מ"ל; סטרפטומיצין, 10 מ"ג/מ"ל);0.5מ"ל
מדיום אלקטרופורציה
אופטי-MEM
מדיום עצבי
מדיום נוירובזאלי48.5מ"ל
ב-271מ"ל
גלוטמקס 200 מ"מ0.125מ"ל
PS (פניצילין, 10,000 יח'/מ"ל; סטרפטומיצין, 10 מ"ג/מ"ל);0.5מ"ל
OGD בינוני (Tasca, et al. 2014)
CaCl21מ"מ
KCl5מ"מ
NaCl137מ"מ
ק"ח2פ"ד40.4מ"מ
עד2HPO40.3מ"מ
MgCl20.5מ"מ
מגסו40.4מ"מ
הפס25מ"מ
נהקו34מ"מ

טבלה 2: הרכב המדיה השונים בהם נעשה שימוש.

שטח פנים של בארות וצלחותנפח עבודה
צלחת 96 באר0.32ס"מ20.1מ"ל
צלחת 24 באר1.9ס"מ20.5מ"ל
צלחת 12 באר3.8ס"מ21מ"ל
צלחת 6 באר9.5ס"מ22.5מ"ל
צלחת 60 מ"מ21.5ס"מ26מ"ל

טבלה 3: שטח הפנים של סוגי הלוחות השונים ונפחי העבודה.

  1. הכנת התרבית העצבית
    1. מחממים מראש (37 מעלות צלזיוס) ומאזנים (באטמוספירה של 5% CO2 ) את מדיום הציפוי, המדיום העצבי ומדיום האלקטרופורציה (ראה הרכב בטבלה 2) בבקבוק פתוח חלקית בתוך חממת התא למשך שעתיים לפחות. תנו לטריפסין להתחמם ב-RT. חממו מראש את תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS) ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים.
    2. הגדר מראש את פרמטרי האלקטרופורציה (טבלה 4).
תנאי אלקטרופורציה: דופק נקבוביות
אורךVמרווח זמןNד. תעריףקוטביות
2 אלפיות השנייה17550210פלוס
תנאי אלקטרופורציה: דופק העברה
אורךVמרווח זמןNד. תעריףקוטביות
502050540פלוס/מינוס

טבלה 4: הגדרות אלקטרופורציה עבור NEPA21.

  1. דיסקציה של המוח וקצירת עכבר CD-1 embryos ב-E15 לאחר קיום יחסי מין
    1. להקריב את הנקבה ההרה על ידי פריקת צוואר הרחם ללא טשטוש. לעקר את הבטן עם 70% אתנול; חותכים ופותחים את הבטן במספריים חדים.
    2. מחלצים את הרחם ומניחים אותו בצלחת פטרי עם HBSS קר 1x. השאירו אותו על קרח בתוך מכסה המנוע של תרבית התאים עם מלקחיים נפוצים.
    3. הוציאו עובר מהרחם בעזרת מלקחיים ומספריים וערפו את ראשו בחיתוך בודד בעזרת מספריים.
    4. החזק את הראש והכניס מלקחיים (למשל, מלקחיים עדינים של דומונט) למסלול העין.
    5. בעזרת המחט (מזרק מחט 30 גרם) כלהב, חותכים את הברגמה ופורצים את החלק האחורי של הראש.
    6. הכניסו מלקחיים חדים דרך החתך אנכית לתוך הברגמה, ושברו את שכבת העור הדקה של האזור הקדמי. משוך את המלקחיים כדי לעקוב אחר הסדק האורכי בין שתי ההמיספרות מבלי לפגוע בקליפת המוח.
    7. השתמש במלקחיים הקטנים בזווית של 45 מעלות, מהחלק הקדמי לחלק האחורי, כדי להסיר את המוח מהראש.
    8. העבירו את המוח לצלחת פטרי בגודל 3.5 ס"מ עם HBSS 1x קר כקרח תחת סטריאומיקרוסקופ.
  2. דיסקציה של קליפת המוח
    הערה: הפרוטוקול לתרבית עצבית מותאם מההליך שתואר על ידי דוטי ובנקר10.
    1. השתמשו במלקחיים של דומונט (11 ס"מ) כדי להחזיק את התלמוס ובמחט המוטה בזווית של 45 מעלות כדי להפריד את קליפת המוח של כל המיספרה מהמוח האמצעי. ודא שקליפת המוח אינה מראה עקבות של רקמות אחרות; השתמש במלקחיים חדים כדי להסיר את קרומי המוח.
      הערה: קרומי המוח יוצרים קרום אלסטי דק העוטף את המוח וניתן לזהות אותם בקלות בגלל צבעם האדום. ביצוע תנועות רכות בזיגזג יעזור להסיר את קרומי המוח. ודא שכל קרומי המוח הוסרו מכיוון שהם רעילים לתרבות.
    2. העבירו את קליפת המוח הנקייה לצלחת פטרי נקייה בגודל 3.5 ס"מ עם HBSS 1x קר כקרח והניחו אותה על קרח.
  3. פירוק
    1. קוצצים כל קליפת המוח לשני חצאים והשתמשו במלקחיים או במחט חדה (30 גרם) כדי להקל על השפעת הטריפסין בשלב הבא.
    2. העבירו את החלקים ל -7 מ"ל של מאגר טריפסין-EDTA בטמפרטורת החדר בצינור של 15 מ"ל באמצעות פיפטה P1000 (חתכו 3-4 מ"מ מהקצה). המתן עד שהם ישקעו לתחתית הקצה לפני שתשחרר אותם מקצה הפיפטה. מערבבים על ידי הטיה.
    3. יש לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות באמבט מים. מערבבים על ידי הטיה כל 4-5 דקות.
      הערה: זמן הדגירה יכול לנוע בין 12 ל -15 דקות.
    4. הניחו לרקמה לשקוע בכוח הכבידה והסירו בזהירות את הטריפסין. שטפו את הטישו פעמיים עם 8 מ"ל של 1x HBSS וערבבו בעדינות על ידי הטיה. הסר את ה-1x HBSS בזהירות באמצעות פיפטה P1000 אך באמצעות קצה פיפטה לא חתוך.
    5. שטפו את הטישו פעם אחת עם 5 מ"ל של מדיום ציפוי. להתסיס על ידי הטיה. הסר את אמצעי הציפוי בזהירות באמצעות פיפטה P1000.
    6. מוסיפים 1.5 מ"ל מדיום ציפוי. פרק את התערובת באופן מכני באמצעות פיפטה P1000 על ידי שאיבת המדיום מתחתית הצינור ושחרורו בעדינות על הקירות למשך 8-12 פעמים לכל היותר.
    7. מסננים דרך מסננת תאים סטרילית (70 מיקרומטר) המונחת על צינור של 50 מ"ל. הוסף 10 מ"ל או נפח רצוי אחר של מדיום ציפוי לצינור.
    8. הכניסו 5 מיקרוליטר של תרחיף התאים לתא ספירת התאים, הוסיפו 5 מיקרוליטר של טריפן כחול (0.4% w/v), וספרו את התאים.
    9. צלחת התאים (ראה סעיף 1.6) על ידי העברת נפח מספיק של תרחיף התא כדי לקבל את מספר התאים הרצוי לאלקטרופורציה (למשל, 106 תאים) בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. צנטריפוגה את התאים בטמפרטורה של 250 × גרם למשך 5 דקות. המשך לסעיף 1.6.
  4. ציפוי תאים
    1. צלחת את הצפיפות הרצויה של מתלה התאים הלא צנטריפוגה משלב 1.5.7 בכל באר המכילה את מדיום הציפוי.
      הערה: בפרוטוקול זה, 100,000 עד 200,000 תאים/באר נזרעו בצלחת של 12 בארות. כהפניה, צלח לפחות 3 קורות חיים לכל תנאי ניסוי כדי לקחת בחשבון את השונות הניסיונית. סביבת ניסוי טיפוסית עשויה לכלול הדמיה של 4-5 שדות לכל CV (למשל, באמצעות מטרה של פי 20, כל שדה צפוי להיות ברוחב ~1.3 מ"מ2 ).
    2. הזז את הצלחת במכסה המנוע של תרבית התאים לכל הכיוונים הקרדינליים כדי להפיץ את התאים בצורה אחידה.
  5. אלקטרופורציה
    הערה: ניתן להשתמש במערכות טרנספקציה אחרות. למערכת NEPA21 המשמשת בפרוטוקול זה יש את היתרון של היותה "מערכת פתוחה". המשתמש יכול לשנות את הפרוטוקול, והוא אינו דורש ריאגנטים ספציפיים לטרנספקציה של קובטות מיוחדות המשמשות לאלקטרופורציה. פרוטוקול זה שונה מ-5.
    1. המשך משלב 1.5.9. השעו מחדש את גלולת התא עם 5 מ"ל של מדיום אלקטרופורציה בצינור של 15 מ"ל. צנטריפוגה את הצינור בחום של 250 × גרם למשך 5 דקות.
    2. חזור על שלב 1.7.1. השעו מחדש עם מדיום אלקטרופורציה כדי לקבל ריכוז של 106 תאים/מ"ל בכל אחת מקובטות האלקטרופורציה. מערבבים את התאים עם כמות ה-DNA הרצויה בקובטה.
      הערה: לביטוי GFP, נעשה שימוש ב-3 מיקרוגרם פלסמיד לכל מיליון תאים. בגלל השונות הגבוהה, מומלץ לבדוק את הריכוז האופטימלי עבור כל פלסמיד. בין 2 ל -24 מיקרוגרם של פלסמיד למיליון תאים נבדקו. ניתן לשלב פלסמידים מגוונים באותה קובטה כדי לבצע טרנספקציה כפולה. במקרה של טרנספקציה משותפת, יש להעביר את הגן המעניין בעודף בהשוואה ל-GFP (למשל, 3:1 הוא יחס אופטימלי שיש לבדוק) כדי להבטיח שרוב התאים המבטאים GFP מבטאים במשותף את הגן המעניין.
    3. הנח את הקובט בתא הקובט (איור 2). לחץ על כפתור התחל כדי להפעיל את התוכנית המוגדרת מראש (ראה תנאי אלקטרופורציה בטבלה 4). רשמו את ערכי הזרמים והג'אול המוצגים במסגרת 'מדידות '.
      הערה: המשתמש עשוי לשנות תנאים ספציפיים. לדוגמה, הפחתת המתח עשויה להפחית את יעילות הטרנספקציה אך להגביר את ההישרדות העצבית.
    4. הוצא את הקובט מהחדר. הוסף 500 מיקרוליטר ממדיום הציפוי לקובטה מיד לאחר האלקטרופורציה והעביר את הדגימה מהקובטה לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל באמצעות פיפטה.
      הערה: ככל שהוספת המדיום מהירה יותר, כך ההישרדות לאחר אלקטרופורציה טובה יותר מכיוון שהיא עוזרת למנוע נזק לתאים.
    5. צלחת את המספר הרצוי של תאים אלקטרופוטיים בכל באר.
      הערה: צלחת בין 20,000 ל -100,000 תאים בצלחת של 12 בארות. בהתאם לתנאים, רק 5-10% מהתאים האלקטרופוטיים עשויים לשרוד. המספר המדויק צריך להיבדק ולהתאים על ידי המשתמש.
    6. דגירה למשך 2-4 שעות בתנאים סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, לחות רוויה).
      הערה: לאחר תקופת הדגירה, התבונן בתאים תחת המיקרוסקופ. אם התרבית בריאה, רוב התאים היו נדבקים לפני השטח ומתחילים להנביט הרחבות נויריטים גלויות.
    7. שנה את מדיום הציפוי למדיום עצבי (נפחים והרכב בטבלה 1 ובטבלה 2, בהתאמה).
  6. שמירה על תאים
    1. כדי לרענן את המדיום, הסר מחצית מהמדיום והוסף נפח שווה של מדיום טרי מאוזן מראש לאחר 7 ימי תרבות.
    2. ביום העשירי של התרבית, החלף מחצית מהנפח במדיום עצבי טרי ללא תוסף הגלוטמין (ראה טבלת החומרים). חזור על שלב זה כל יומיים לאחר היום העשירי.
      הערה: לאחר 10 ימים של תרבית, התאים מייצרים גלוטמט בעצמם.

2. בניית החדר ההיפוקסי

  1. השתמש בכל מיכל הרמטי עם מכסה בורג או מערכת איטום מקבילה למטרה זו (איור 3A). קדחו שני חורים בדופן מיכל הפלסטיק והכניסו צינור פלסטיק בכל אחד מהם. אטמו אותם בסיליקון כך שהמיכל יהיה אטום הרמטית (איור 3).
    הערה: כאן נעשה שימוש במיכל פלסטיק גלילי (גודל 1 ליטר) עם מכסה בורג לבניית החדר. ודא שהמכולה גדולה מספיק כדי להכיל את קורות החיים הנדרשים לניסוי. כדי לטפל ביותר קורות חיים באותו חלל, פלטפורמות פלסטיק יכולות להיות מוערמות זו על גבי זו (איור 3A).
  2. כדי להכין את תא הבעבוע (ראה 3.2), קדחו חור במכסה של בקבוקון, בעזרת כל מקדחה מכנית סטנדרטית עם מקדחה מעט קטנה יותר מהצינור, והכניסו צינור פלסטיק דרך החור לתוך הבקבוק. אטמו את החור עם פרפילם כדי לשמור על האיטום ההרמטי (איור 3B).
  3. יש לעקר את המיכל ואת הבקבוק עם 70% אתנול ולהקרין באור אולטרה סגול למשך מחזור אחד לפני השימוש בהם.

3. מחסור בחמצן-גלוקוז (OGD)

הערה: הפרוטוקול עבור OGD מותאם מ-Tasca et al.7

  1. הכן את תמיסת ה-OGD עם תמיסת פוספט (טבלה 2) שנוספה בעבר באנטיביוטיקה.
    הערה: עבור כל צלחת 35 מ"מ, השתמש ב-5 מ"ל; עבור צלחת 100 מ"מ, השתמש ב -10 מ"ל.
  2. הוסף את תמיסת ה-OGD בתוך תא המבעבע (איור 3B) והנח אותה בתוך אמבט מים (כבר מחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס). חבר את הבקבוק למקור החנקן (N2, 100%).
    הערה: שים לב שמכיוון שתמיסת OGD מכילה HEPES כמאגר, היא אינה דורשת CO2. אם תמיסת ה-OGD מבוססת על מערכת חציצה ביקרבונט, השתמש ב-5% CO2 ו-95% N2 כדי להרוות את התמיסה והתא ההיפוקסיים.
  3. רווי את תמיסת ה-OGD בחנקן מבעבע בעדינות. השאירו את התמיסה במצב מבעבע קל למשך 20-30 דקות.
  4. העבירו מיד את הבקבוק למכסה המנוע של תרבית התאים והוסיפו 5 מ"ל מתמיסת OGD ללא חמצן בצלחות 35 מ"מ או 10 מ"ל בלוחות תרבית של 100 מ"מ.
  5. העבר את קורות החיים עם התאים המתורבתים לצלחות עם OGD. מבלי לכסות את הצלחות, העבירו אותם לתא ההיפוקסיה וסגרו אותם בחוזקה אך בזהירות.
    הערה: יש להשלים את שלבים 3.4 ו-3.5 במהירות האפשרית. שמור על קורות החיים הבקרה (מדיום עצבי בנורמוקסיה) בצלחות הבאר בתוך החממה. לחלופין, לחשוף את נוירוני הבקרה למדיום הנורמוקסי OGD בתוספת גלוקוז (10 מ"מ) כדי לבחון את ההשפעות של היפוקסיה ומחסור בגלוקוז באופן סלקטיבי יותר.
  6. חבר את מערכת החנקן לתא ההיפוקסיה ובדוק שהצינורות פתוחים. רווי את החדר ב-N2 למשך מספר דקות בלחץ של 2-3 בר (למשל, 2-3 דקות; 1 בר = 750 מ"מ כספית) (איור 3C).
    הערה: אל תשכח לבעבע שוב את תמיסת ה-OGD למשך 15 דקות בין מספר נקודות זמן.
  7. הפחיתו את לחץ החנקן ל-1.3-1.5 בר וסגרו את שני הצינורות של תא ההיפוקסיה (איור 3C). השאירו את החדר בחממה למשך הזמן הנדרש (למשל, 60 דקות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    הערה: משך ה-OGD עשוי לדרוש התאמה בהתאם למצב הניסוי ומטרות המחקר. זמן דגירה קצר (למשל, 30 דקות) ידמה היפוקסיה קלה. שעתיים של OGD בדרך כלל קשות מאוד כלפי הנוירונים. מומלץ לבדוק משך OGD של 45 עד 90 דקות לפני תחילת המחקר. כמובן שמשך ה-OGD ישפיע על ההישרדות הכוללת ועל ההתחלה היחסית של מוות עצבי לאחר ההחלמה מ-OGD. אם המטרה היא לנתח מוות עצבי בזמן אמת, שאפו להשיג תנאי OGD שיעוררו מוות של תאים מספר שעות לאחר ההתאוששות מ-OGD לניתוח יעיל יותר.
  8. פתח את החדר והעבר את קורות החיים לצלחת הרב-באר המקורית שלהם לצורך התאוששות. לאחר שלב זה, שקול שתי חלופות: 1) לניסויים בקנה מידה קטן, המשך לסעיף 4 לאימונופלואורסצנציה וניתוח תמונה; 2) לסינון תוכן גבוה, המשך לסעיף 5 לניתוח במנתח התאים (או בפלטפורמה מקבילה).
    הערה: הדמיה חיה מספקת גישה גמישה יותר מכיוון שהיא מאפשרת ניטור בזמן אמת של נקודות הניסוי השונות.

4. אנליזה על ידי אימונופלואורסצנציה סטנדרטית ו-ImageJ

הערה: זמן ההחלמה עשוי להשתנות בין שעה ל-24 שעות בהתאם לתנאים.

  1. שטפו את הנוירונים עם 1x PBS למשך 10 דקות.
    הערה: שלב זה הוא אופציונלי מכיוון שישנן מספר דרכים להמשיך ולנתח את התמונות.
  2. תקן את הנוירונים עם 4% פרפורמלדהיד למשך 10 דקות ב-RT. שטוף אותם שלוש פעמים עם 1x PBS למשך 10 דקות בכל שטיפה.
    הערה: מכיוון שפרפורמלדהיד רעיל, יש לעבוד מתחת למכסה מנוע כימי.
  3. לחדור את הנוירונים על ידי הוספת 1x PBS המכיל 0.1% טריטון X-100 למשך 10 דקות. שוטפים את התאים במהירות עם 1x PBS. חזור על שלב הכביסה פעמיים למשך 10 דקות בכל כביסה.
  4. הוסף 350 מיקרוליטר של תמיסת חסימה (1x PBS המכיל 2% אלבומין בסרום בקר) לקורות החיים והשאיר אותם למשך 30 דקות לפחות. סובב את מלאי הנוגדנים העיקרי (AB) (5 × גרם למשך 30 שניות) וערבב אותו עם תמיסת החסימה בדילול הנדרש, למשל, אנטי-GFP ב-1:600.
    1. העבירו את הכיסויים לפרפילם בתא לח (קופסה עם רקמה ספוגה במים לשמירה על לחות ומניעת אידוי). בהתאם לגודל ה-CVs, הוסף בזהירות 60 או 80 מיקרוליטר של דילול הנוגדנים העיקרי לכל CV, וודא שהתאים נמצאים במגע עם הנוגדן. דגרו את קורות החיים o/n ב-4 מעלות צלזיוס.
      הערה: יש ליצור טיפה על משטח ה-CV כדי לכסות את כל משטח ה-CV. הימנע מהפרעה לתאים בזמן פיפטינג של תמיסת הנוגדנים על קורות החיים. ניתן לקצר את זמן הדגירה לשעתיים ב-RT.
  5. שטפו את קורות החיים עם 1x PBS למשך 10 דקות מעל הפרפילם. חזור על שלב הכביסה פעמיים.
  6. לדלל את ה-AB המשני, למשל, Alexa 488 (1:500), ו-4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1:2,000) בתמיסת חסימה. בהתאם לגודל קורות החיים, הוסף טיפה של 60-80 מיקרוליטר של תמיסת ה-AB המשנית על התאים. דגרו את קורות החיים למשך שעה אחת בחושך ב-RT. שטפו את ה-AB וה-DAPI המשניים מהנוירונים עם PBS 1x למשך 10 דקות וחזרו על שלב זה פעמיים.
  7. התקן את קורות החיים במדיום הרכבה (ראה טבלת החומרים) לניתוח אימונופלואורסצנטי ואחסן אותם בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחר הייבוש.
  8. לכידת תמונות וניתוחן.
    הערה: נעשה שימוש במיקרוסקופ הפוך כדי לצלם את התמונות ב-20x (איור 4A, ראה טבלת החומרים).
    1. השתמש בתוכנת הקוד הפתוח ImageJ כדי לנתח את התמונות ולהשיג את המסיכה עבור ערוץ GFP (איור 4C).
      הערה: ישנן מספר דרכים להדמיה וניתוח של הנוירונים, בהתאם לזמינות הציוד ולפורמט הניסוי. זרימת העבודה הבאה ניתנת כדוגמה בסיסית שבה המטרה היא לזהות את הסומה של נוירונים בודדים המבטאים GFP הקיימים בתמונה. הערכים הספציפיים המוצגים כאן, כגון ערך הסף וגודל החלקיקים, צריכים להיבדק על ידי המשתמש על סמך תנאי הניסוי הספציפיים שלו. בנוסף, ניתן להוסיף מסננים ושלבי עיבוד שונים. לדוגמה, מסנני ImageJ Subtract Background ו-Despeckle עוזרים לעתים קרובות בניקוי התמונה בתחילת העיבוד. אופטימיזציה של זרימת העבודה לתנאי ניסוי ספציפיים דורשת ניסיון קודם בניתוח תמונות וידע במושגים בסיסיים של ניתוח תמונה כמותית. מכיוון שמדריך מעמיק על ניתוח תמונות הוא מחוץ לתחום הפרוטוקול הנוכחי, אנו ממליצים על המשאבים הבאים: מדריך למשתמש של ImageJ, https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/; לדוגמאות והדרכות, https://imagej.nih.gov/ij/docs/examples/index.htm; חבילת MBF ImageJ, https://imagej.net/mbf/index.htm.
    2. לסגמנטציה, בחר את פילוח עוצמה עם הפרמטרים הדרושים כדי לבודד את הסומה, שהוא האזור הבהיר ביותר של הנוירונים.: תפריט | תמונה | התאם | סף | הגדר סף מינימלי (למשל, 100) | לחץ על החל.
    3. חזור על הסף מ- 4.8.2. לכל התמונות כדי לראות את המסכה (כלומר, התמונה המקוטעת) עבור הסומה של תאי העצב (איור 4E).
    4. כדי לקבל את מספר התאים ששרדו בכל תמונה ולייצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני לביצוע חישובים, בחר תפריט | ניתוח | נתח חלקיקים והזן את ערכי הפרמטרים הדרושים (למשל, גודל: 50 אינסוף פיקסלים; מעגליות: 0.5-1.00). קחו בחשבון שב- t = 0 שעות, מספר התאים שנספרו הוא המספר הכולל של התאים שזוהו, וחשב את אחוז התאים ששרדו בנקודות הזמן השונות.
      הערה: סף גודל נמוך יותר שימושי לסינון עצמים קטנים יותר מהסומה (למשל, 60-80 מיקרומטר2).
    5. השתמש בפונקציית הקלט מאקרו של ImageJ כדי להפוך את הניתוח לאוטומטי ולחזור עליו: תפריט | תוספים | פקודות מאקרו | שיא | לחץ על צור כדי ליצור את המאקרו.

5. ניתוח בזמן אמת עם IN Cell Analyzer 2200

  1. הכנס את צלחת 12 הבארות למנתח התאים, חבר את מערכת CO2 והגדר את הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס.
    הערה: ניתן להגדיל שלב זה בקלות בפלטפורמה זו, ולבצע ניסוי דומה בתאי עצב המצופים בצלחת של 96 בארות.
  2. בחר את המטרה פי 20, בחר באופן אקראי 5 שדות לבאר (מכסה 2.33% מהבאר בדוגמה זו), ומקד אותם באופן אוטומטי עבור כל ערוץ פלואורסצנטי (פלואורסצאין איזותיוציאנט [FITC] במקרה זה). בחר את פרמטרי הרכישה (30 דקות זמן-lapse למשך 16 שעות). לחץ על התחל והמתן.
    הערה: מספר שדות ההדמיה חייב להיקבע על ידי החוקר וצריך להיות מספיק כדי להסביר את השונות בתוך באר אחת.
  3. השתמש ב- IN Cell Developertoolbox v1.9 כדי להגדיר את זרימת העבודה המתאימה לניתוח.
  4. לנתח את תמונות הנוירונים (ערוץ FITC) כדי ליצור מסכה לסומה של הנוירונים (איור 4).
    הערה: המטרה היא לזהות את הסומה של נוירונים בודדים הקיימים בתמונה. ניתוח זה עוקב אחר שלבים המקבילים לאלה המתוארים בסעיף 4 עבור ImageJ. עיין בסעיף 4 לקבלת זרימת העבודה ושיקולים כלליים. סף העוצמה נקבע לבחירת הסומה, שהוא האזור הבהיר ביותר של הנוירונים.
    1. לפילוח, בחר את פילוח העוצמה עם הפרמטרים הדרושים (במקרה זה, סף מינימלי של 20005.40).
    2. לעיבוד שלאחר העיבוד, בחרו באפשרות 'מסננת ', תוך שמירה על יעדים עם שטח גדול מערך שנקבע מראש (כאן, 189 פיקסלים (~80 מיקרומטר2)).
    3. בחר את הפרמטר Sum כדי לספור ולסכם את כל הנוירונים שזוהו במסכה (נוירונים ששרדו) עבור כל שדה ועבור כל השדות של באר בכל נקודת זמן של מהלך הזמן.
    4. ייצא את התוצאות לגיליון אלקטרוני. ב- t = 0 שעות, קח בחשבון שמספר התאים שנספרו הוא סך התאים שזוהו, וחשב את אחוז התאים ששרדו בנקודות הזמן השונות. חשב את הזמן שבו 50% מהתאים מתים כדי להקל על ההשוואה בין התנאים.
      הערה: על המשתמש להתאים את הפרמטרים לשלבי הפילוח והעיבוד שלאחר העיבוד עבור תעלות פלורסנט שונות בהתאם למבנים שיש לזהות.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

פרוטוקול זה נועד לבסס מודל מבחנה של שבץ מוחי. חשוב להשיג צפיפות עצבית נאותה, שתאפשר זיהוי של נוירונים אלקטרופוטיים בודדים כדי לנתח אותם בנפרד. גם שלב התרבות העצבית לאחר הציפוי הוא מכריע. התבגרות הנוירונים בתרבית היא פרוגרסיבית. התלות בגורמי גדילה, צמיחת נויריטים, קישוריות ופעילות אלקטרופיזיולוגית תשתנה מאוד בהתאם לשלב. בתנאים ספציפיים אלה ב-4-6 ימים במבחנה, למרות שהנויריטים מורחבים היטב, הנוירונים עדיין מאוד לא בשלים, תלויים מאוד בגורמי גדילה, ובעלי פעילות אלקטרופיזיולוגית נמוכה יחסית. בשלב זה, OGD עשוי...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

דיון

פרוטוקול זה מראה דרך יעילה למידול שבץ מוחי במבחנה. כדי להשיג מטרה זו, הצענו תיוג דליל של נוירונים בקליפת המוח באמצעות מערכת האלקטרופורציה NEPA215. מדובר במערכת פתוחה המאפשרת התאמה אישית של הפרוטוקול בעלות תפעולית מינימלית בהשוואה למערכות אחרות המשתמשות בערכות או במכשירים ספציפיים. תרבית מעורבת של נוירונים נאיביים ואלקטרופוטיים מאפשרת יותר גמישות וחוסן בהשוואה לתרבית עצבית בצפיפות נמוכה. זה מאפשר לחקור את ההשפעה של גנים, מבנים וחלבונים שונים וניתן להרחבה ב...

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

גילויים

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

תודות

אנו רוצים להודות לקרלוס דוטי על שיתוף המומחיות שלו בתרבית עצבית. אנו מודים גם לאליסיה מרטינז-רומרו ממתקן הליבה של Cytomics של המרכז לחקר פרינסיפה פליפה (CIPF), הנתמך על ידי מימון FEDERER האירופי. הפרויקט נתמך על ידי משרד הכלכלה והתחרותיות הספרדי עבור ריאגנטים, חומרים SAF2017 ומשכורות של YDC ו-PF. PF נתמך גם על ידי המענק RyC-2014-16410. CGN ו-PF נתמכים על ידי Conselleria de Sanitat של Generalitat Valenciana, כמו גם AGM (ACIF/2019/015). אנחלה רודריגז פרייטו נתמכת על ידי משרד המדע, החדשנות והאוניברסיטאות הספרדי, עם המענק PRE2018-083562.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
צלחות פטרי 10 ס"מFISHER SCIENTIFIC, S.L.1130-9283
צלחות פטרי 3.5 ס"מסטרילין
75 ס"מ2 בקבוקקורנינג430641U
B-27Life Technologies17504-044
צלחות תרבית תאיםשילוב קורנינג Costar®3513
חממת תאיםThermo Electron Corporationדגם 371
מסננת תאים 70 ומיקרו; mFalcon352350
אורות קריםSchott223488KL 1500
כיסויי LCD (15 מ"מ)Marienfeld111530
CU500 Cuvette ChamberNepa Gene
CU600 מחזיק מעמד קובטNepa Gene
DAPISigma-Aldrich Quimica, S. L.D9542-10MG1:2000
DMSOPanreacA3672
Dumont מלקחיים עדיניםFST11254-20
Dumont מלקחיים עדיניםFST11252-00
EC-002S NEPA קוביות אלקטרופורציה, פער 2 מ"ממסננת מסנן גן
Nepa Falcon352350
מספריים עדינים-חדים-קהיםFST14028-10
מספריים עדינים-ToughCut rFST14058-09
GFP עוף IgYAves LabsGFP-10101:600
גלוקוזסיגמא68769-100 מ"ל
תוסף GlutaMAX-I 200 מ"מ 100 מ"לפישר סיינטיפיק35050-061
HBSSThermofisher14175-095https://www.thermofisher.com/es/es/home/technical-resources/media-formulation.156.html
Hepes 1 מ 'ThermoFisher15630-080
סרום סוסיםInvitrogen26050088
MEMThermofisher11095080
שקופית מיקרוסקופ https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11095080#/11095080 (פוליליזין)VWR631-0107ממד: 25 x 75 x 1 מ"מ
מוביול 4-88סיגמא-אולדריץ' קימיקה, ס.ל.81381-250G
מחטים צהובות, 30 מדBD Microlance ™ 3304000
NEPA21 אלקטרופורטורNepa גן
Neubauer תאבלאו מותג 717805
Neurobasal בינוניThermoFisher21103-49
Opti-MEMInvitrogen31985-062
ParafilmCole-ParmerPM996
Paraformaldehyde (PFA), 95%Sigma-Aldrich Quimica, S. L.158127-500Gהשתמש בתמיסה: 4%
PEIPolysciences23966-1
פלסמיד עבור GFPpCMV-GFP-ires-Cre, מתואר ב- Fazzari et al., Nature, 2010
Poly-L-LysineSIGMAP2636
PS ( פניצילין, סטרפטומיצין)ThermoFisher15140122
מלקחיים משונניםFST11152-10
סטריאומיקרוסקופWORLD PRECISION INSTRUMENTS
מזרקיםBD פלסטיפק 1 מ"ל303176
טריטון X-100סיגמא-אולדריץ' קימיקה, S. L.מספר MDL: MFCD00128254ThermoFisher 25300054
יוניים 15 מ"לפישר05-539-4
צינורות 50 מ"לVWR21008-242
טאפרוור-טאפרוור הרמטי עם מכסה בורג. SP Berner - Taper 1 L Redondo con Rosca. ניתן לרכוש כל טאפרוור הרמטי שווה ערך בכל סופרמרקט.
אמבט מיםמעבדת שלדון דגם 12241641951
צינורות Trypsin-EDTA לא

מקורות

  1. Salazar, I. L., Mele, M., Caldeira, M., Costa, R. O., Correia, B., Frisari, S., Duarte, C. B. Preparation of primary cultures of embryonic rat hippocampal and cerebrocortical neurons. Bio-protocol. 7 (18), 2551(2017).
  2. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
  3. Fazzari, P., et al. Cell autonomous regulation of hippocampal circuitry via Aph1b-γ-secretase/neuregulin 1 signalling. eLife. 3, 02196(2014).
  4. Navarro-González, C., Huerga-Gómez, A., Fazzari, P. Nrg1 intracellular signaling is neuroprotective upon stroke. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 3930186(2019).
  5. NEPA21 transfection of cell suspensions using cuvettes. NEPAGENE Co. Ldt. , Available from: http://2017.igem.org/wiki/images/3/3a/T--TECHNION-ISRAEL--Electroporation-NEPA2_for_HPC-7.pdf (2017).
  6. Larson, M. A., Gibson, K. A., Vivian, J. L. In vivo validation of CRISPR reagents in preimplantation mouse embryos. Methods in Molecular Biology. 2066, 47-57 (2020).
  7. Tasca, C. I., Dal-Cim, T., Cimarosti, H. In vitro oxygen-glucose deprivation to study ischemic cell death. Methods in Molecular Biology. 1254, 197-210 (2015).
  8. Holloway, P. M., Gavins, F. N. E. Modeling ischemic stroke in vitro: the status quo and future perspectives. Physiology and Behavior. 47 (2), 561-569 (2016).
  9. Sommer, C. J. Ischemic stroke: experimental models and reality. Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).
  10. Dotti, C. G., Banker, G. A. Experimentally induced alteration in the polarity of developing neurons. Nature. 330 (6145), 254-256 (1987).
  11. Fazzari, P., et al. Control of cortical GABA circuitry development by Nrg1 and ErbB4 signalling. Nature. 464 (7293), 1376-1380 (2010).
  12. Sadiq, A. A., et al. An overview: Investigation of electroporation and sonoporation techniques. 2015 2nd International Conference on Biomedical Engineering. , 1-6 (2015).
  13. Shi, J., et al. A review on electroporation-based intracellular delivery. Molecules. 23 (11), 3044(2018).
  14. Fazzari, P., Mortimer, N., Yabut, O., Vogt, D., Pla, R. Cortical distribution of GABAergic interneurons is determined by migration time and brain size. Development. 147 (14), 185033(2020).

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

הדפסות חוזרות והרשאות

תגיות

throughput
הסרטון יגיע בקרוב
צור קשר
המלצה לספרייה

פרטיות

תנאי שימוש

מדיניות

2026 © זכויות יוצרים MyJoVE Corporation. כל הזכויות שמורות.