כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשתלת חלון אופטי השוכנות לצמיתות עבור בית החזה מורין, המאפשר הדמיה תוך-ויאלית ברזולוציה גבוהה של הריאה. קביעות החלון הופכת אותו מתאים היטב לחקר תהליכים תאיים דינמיים בריאה, במיוחד אלה המתפתחים לאט, כגון התקדמות גרורתית של תאים סרטניים מופצים.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
חלון קבוע לחקירת גרורות סרטן לריאה
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
גרורות, המהוות כ-90% מהתמותה הקשורה לסרטן, כוללת התפשטות מערכתית של תאים סרטניים מגידולים ראשוניים לאתרים משניים כגון העצם, המוח והריאה. למרות שנחקר בהרחבה, הפרטים המכניסטיים של תהליך זה נשארים מובנים היטב. בעוד שמודליות הדמיה נפוצות, כולל טומוגרפיה ממוחשבת (CT), טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים (PET) והדמיה תהודה מגנטית (MRI), מציעות דרגות שונות של הדמיה גסה, כל אחת מהן חסרה את הרזולוציה הזמנית והמרחבית הדרושה כדי לזהות את הדינמיקה של תאי גידול בודדים. כדי לטפל בכך, טכניקות רבות תוארו עבור הדמיה תוך-וינטלית של אתרים גרורתיים נפוצים. מתוך אתרים אלה, הריאה הוכיחה מאתגרת במיוחד לגישה להדמיה תוך-ויאלית בשל עדינותה ותפקידה הקריטי בשמירה על החיים. למרות מספר גישות תוארו בעבר עבור הדמיה תוך-וינטלית של תא יחיד של הריאה שלם, כל כרוך מאוד פולשני הליכים סופני, הגבלת משך ההדמיה המרבי האפשרי ל 6-12 שעות. מתואר כאן טכניקה משופרת להשתלה קבועה של חלון אופטי בית החזה זעיר פולשני להדמיה ברזולוציה גבוהה של הריאה (WHRIL). בשילוב עם גישה מותאמת למיקרוקרטוגרפיה, החלון האופטי החדשני מאפשר הדמיה תוך-וינטלית סדרתית של הריאה השלמה ברזולוציה של תא בודד על פני מפגשי הדמיה מרובים ומשתרע על פני מספר שבועות. בהתחשב במשך הזמן חסר התקדים שבו ניתן לאסוף נתוני הדמיה, WHRIL יכול להקל על גילוי מואץ של המנגנונים הדינמיים שבבסיס ההתקדמות גרורתית ותהליכים ביולוגיים רבים נוספים בתוך הריאה.
מבוא
אחראי ~ 90% ממקרי המוות, גרורות הוא הגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן1. בין האתרים העיקריים של גרורות שנצפו קלינית (עצם, כבד, ריאות, מוח)2, הריאה הוכיחה מאתגרת במיוחד עבור הדמיה in vivo באמצעות מיקרוסקופיה תוך ויאלית. הסיבה לכך היא שהריאה היא איבר עדין בתנועה מתמדת. התנועה המתמשכת של הריאות, המורכבת עוד יותר על ידי תנועת לב תוך-גזעית, מהווה מחסום משמעותי להדמיה מדויקת. לכן, בשל חוסר נגישותה היחסית לאופנה להדמיה אופטית תוך-וינטלית ברזולוציה גבוהה, צמיחת הסרטן בתוך הריאה נחשבה לעתים קרובות לתהליך נסתר3.
בסביבה הקלינית, טכנולוגיות הדמיה כגון טומוגרפיה ממוחשבת (CT),....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולתקנות לשימוש בבעלי חוליות, כולל אישור מראש של מכללת אלברט איינשטיין לרפואה מוסדית לטיפול בבעלי חיים והוועדה לשימוש בבעלי חיים.
1. פסיבציה של חלונות
- שטפו את מסגרות החלונות האופטיות (איור משלים 2) עם פתרון של 1% (w/v) של חומר ניקוי פעיל אנזימטית.
- בתוך צנצנת זכוכית, להטביע את מסגרות החלון האופטי 5% (w / v) פתרון נתרן הידרוקסיד במשך 30 דקות ב 70 °C (70 °F).
- הסר ושטוף את מסגרות החלון במים דה-יוניים.
- בתוך צנצנת זכוכית חדשה, להטביע את מסגרות החלון האופטי 7% (w / v) פתרון חומצת לימון במשך 10 דקות ב 55 °C (55 °F).
- שוב, להסיר ולשט....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
שלבי ההליך הכירורגי המתואר בפרוטוקול זה מסוכמים ומאוירים באיור 1. לזמן קצר, לפני הניתוח, עכברים הם מרדים ואת השיער מעל בית החזה השמאלי מוסר. עכברים מצנררים ומאווררים מכנית כדי לאפשר הישרדות עם פריצת חלל בית החזה. רקמות רכות מעל הצלעות נקטעות, ונוצר פגם מעגלי קטן, המשתרע על צלעותה-6 וה-7. מסגרת החלון האופטי מוכנסת לפגם והצד התחתון שלו (מחוץ לצמצם הצלול) דבק ברקמת הריאה. לאחר מכן, מסגרת החלון מאובטחת בשילוב של תפרים ודבק, חותם מחדש את חלל בית החזה ומאפשר חידוש נשימה רגילה.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באתרים של גרורות רחוקות כגון הריאה, הדמיה אופטית ברזולוציה גבוהה מספקת תובנה על הדינמיקה המשוכללת של גרורות תאים סרטניים. על ידי הפעלת הדמיה של תאים סרטניים בודדים והאינטראקציות שלהם עם הרקמה המארחת, הדמיה תוך-וינטלית ברזולוציה גבוהה הוכיחה את עצמה כמכשיר להבנת המנגנונים הבסיסיים של גרורות.
המתואר כאן הוא פרוטוקול כירורגי משופר להשתלת בית החזה הקבועה של חלון אופטי שנועד לאפשר הדמיה סדרתית של הריאה המורינה באמצעות מיקרוסקופיה מולטיפוטונית ברזולוציה גבוהה. החלון שנוצר באמצעות פרוטוקול ז.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחברים אינם חושפים ניגודי עניינים.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: CA216248, CA013330, רות ל. קירששטיין T32 של מונטיפיורי הכשרה Grant CA200561, פרס METAvivor תחילת הקריירה, המרכז לביופוטונייקה Gruss-Lipper ותוכנית ההדמיה המשולבת שלה, וג'יין א' ומיילס פ. דמפסי. ברצוננו להודות למתקן ההדמיה האנליטית (AIF) במכללת איינשטיין לרפואה על תמיכת ההדמיה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| תמיסה של 1% (w/v) של חומר ניקוי פעיל אנזימים | Alconox Inc | N/A | חומר ניקוי אניוני מרוכז עם אנזים פרוטאז לניקוי ידני ואולטראסוני |
| 2 ומיקרו; m מיקרוספירות פלואורסצנטיות | Invitrogen | F8827 | |
| 5 מ"מ כיסוי | מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית | 72296-05 | |
| 5% (w/v) תמיסה של נתרן הידרוקסיד | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| 5% איזופלורן | הנרי שיין, בע"מ | 29405 | |
| 5-0 משי קלוע עם מחט חיתוך RB-1 | Ethicon, Inc. | תמיסה 774B | |
| 7% (w/v) של חומצת לימון | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| מסגרת חלון נירוסטה 8 מ"מ | N/A | N/A | בהתאמה אישית, <חזקה>איור משלים 2 |
| 9 ס"מ 2-0 עניבת משי | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| 5 מ"מ אגרוף ביופסיה חד פעמי | Integra | 33-35-SH | |
| מספריים מיקרו-חיתוך קהים | Roboz | RS-5980 | |
| מחזיק כלי חלון פליז | N/A | N/A | בהתאמה אישית, איור משלים 3 |
| בופרנורפין | הוספירה | 0409-2012-32 | |
| עט קוטרי | Braintree Scientific | GEM 5917 | |
| כלורהקסידין גלוקונאט | Becton, Dickinson and Company | 260100 | ChloraPrep ספוגית יחידה 1.75 מ"ל |
| מיכל אוויר דחוס | Falcon | DPSJB-12 | |
| דבק ציאנואקרילט | דבקי הנקל | LOC1363589 | |
| תאורת סיבים אופטיים | O.C. White Company | FL3000 | |
| מעקר חרוזים | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | נביטה 500 |
| מלקחיים Graefe | Roboz | RS-5135 | |
| מנורת חום אינפרא אדום | Braintree Scientific | HL-1 | |
| מזרקי אינסולין | Becton Dickinson | 329424 | |
| Isoflurane וופורייזר | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson מחזיק מחט עם מנעול | Kalson כירורגי | T1-140 | |
| אפליקטורים עם קצה כותנה ארוך | Medline Industries | MDS202055 | |
| Nair | Church & דווייט ושות', בע"מ | ||
| ניאומיצין/פולימיקסין B/בציטראצין | ג'ונסון & ג'ונסון | 501373005 | משחת אנטיביוטיקה |
| משחת עיניים | Dechra מוצרים וטרינריים | 17033-211-38 | |
| סרט נייר | פישר סיינטיפיק | S68702 | |
| מאוורר עכברים | קנט סיינטיפיק | PS-02 | PhysioSuite |
| כיסוי מלבני זכוכית | קורנינג | 2980-225 | |
| מעמד | אינטובציה למכרסמיםBraintree Scientific | RIS 100 | |
| נורת ניפוח ריאות של בעלי חיים קטנים | מכשיר הרווארד | 72-9083 | |
| כלי חיתוך נירוסטה | N/A | N/A | בהתאמה אישית, <חזק>איור משלים 1 |
| סולפאמתוקסזול ואנטיביוטיקה אוראלית Trimethoprim | היי-טק פארמקל ושות'. | 50383-823-16 | |
| SurgiSuite פלטפורמה כירורגית רב תכליתית לעכברים, עם התחממות | קנט סיינטיפיק | SURGI-M02 | פלטפורמה כירורגית מחוממת |
| צנתר קנה הנשימה | Exelint International | 26746 | G קטטר |
| איסוף ואקום בדיקת מתכת | Ted Pella, Inc. | 528-112 |
מקורות
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: a question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Lee, Y. T. Breast carcinoma: pattern of metastasis at autopsy. Journal of Surgical Oncology. 23 (3), 175-180 (1983).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., ....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
